重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体的构建及转染兔骨髓基质干细胞的实验研究

[目的]构建人骨形态发生蛋白-7（human bone morphogenetic protein-7，hBMP-7）基因真核表达载体，评价其转染兔骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）的诱导成骨能力。[方法]从人类胎盘组织中克隆出hBMP-7基因，与真核表达载体pcDNA3．1连接，成功构建了重组pcDNA3．1-hBMP-7真核表达载体；从兔骨髓中分离培养BMSCs，分为3组：ApcDNA3，1-hBMP-7转染组；B空载体pcDNA3．1转染组；C未转染组。使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在BMSCs中的表达。检测各组细胞碱性磷酸酶，胶原，骨钙蛋白合成情况。[结果]RT．PCR、免疫组织化学检测显示经hBMP-7转染的BMSCs中有BMP-7表达。经hBMP-7转染BMSCs的碱性磷酸酶于转染后第2d显著增高，到第8d达到最高；经hBMP-7转染的BMSCs合成胶原、骨钙蛋白能力也显著提高，与转染空载体、未转染的BMSCs相比有显著性差异（P〈0.05）。[结论]成功构建了pcDNA3，1-hBMP-7真核表达载体；外源的hBMP-7基因可在兔BMSCs中充分、高效的表达，并且这种外源性hBMP-7基因具备了促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力，这为hBMP-7的基因治疗提供了坚实的理论基础。     

血管内皮生长因子基因稳定转染兔骨髓基质干细胞的研究

目的 检测人血管内皮生长因子(VEGF)基因稳定转染对兔骨髓基质干细胞(BM-SC)VEGF表达的影响.方法 分离并培养兔骨髓基质干细胞,利用脂质体介导pcDNA3.1-VEGF165转染兔BMSC,G418筛选稳定表达pcDNA3.1-VEGFl65的细胞克隆,RT-PCR、Western blot法检测转染前后细胞中VEGF165 mRNA和蛋白的表达.结果 通过筛选获得了稳定表达pcDNA3.1-VEGF165的细胞克隆.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot结果显示:稳定转染组BMSC中可检测到VEGF165 mRNA和蛋白的表达,空白和空载体组未见VEGF表达.结论 pcDNA3.1-VEGF165载体转染的兔BMSC可稳定表达外源性VEGF165 mRNA和蛋白,可作为治疗骨缺损和骨缺血性坏死研究的种子细胞.     

人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及分化的影响

目的：研究人骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染人骨髓基质干细胞(hBMSC)对其增殖及分化的影响。方法：利用免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞。BMP-2的表达。流式细胞仪和ALP活性测定分析BMP-2基因转染对细胞增殖、分化的影响。结果：转染后，hBMP-2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达。蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达，S期细胞比例和ALP活性明显增高。结论：Ad-BMP-2可高效转染hBMSC，且促进细胞增殖和成骨转化。     

人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及分化的影响

目的:研究人骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染人骨髓基质干细胞(hBMSC)对其增殖及分化的影响.方法:利用免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达.流式细胞仪和ALP活性测定分析BMP-2基因转染对细胞增殖、分化的影响.结果:转染后,hBMP-2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达.蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达,S期细胞比例和ALP活性明显增高.结论:Ad-BMP-2可高效转染hBMSC,且促进细胞增殖和成骨转化.     

BMP-2重组质粒转染人骨髓基质干细胞及表达蛋白的诱导活性观察

目的 构建骨形态发生蛋白-2(BMP-2)真核表达质粒，使其在人骨髓基质干细胞(hBMSCs)中表达，并观察表达产物的诱导成骨活性。方法在脂质体介导下将BMP-2基因导入hBMSCs，流式细胞仪、ALP检测和VEGF探针原位杂交分析其对细胞增殖、ALP活性和VEGF表达的影响。并利用转染后的培养液上清诱导小鼠成纤维细胞(L929)，检测其骨钙素、Ⅱ型胶原表达。结果 转染后细胞稳定表达BMIP-2基因，S期细胞比例增多，ALP活性和VEGF的表达明显增加。且诱导L929细胞骨钙素、Ⅱ型胶原阳性表达。结论 BMP-2重组质粒转染hBMSCs后表达目的蛋白，促进自身增殖、分化和上调VEGF的表达，并诱导成纤维细胞向成骨细胞转化，为BMP-2基因治疗奠定了实验基础。     

携带人血管内皮细胞生长因子基因细菌内重组腺病毒转染兔骨髓基质干细胞的表达

目的应用高效细菌内同源重组系统pAd-Easy,制备含人血管内皮细胞生长因子121 (VEGF121)基因的重组腺病毒,感染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),并检测外源基因的表达,为其进一步应用于血管化组织工程骨组织的构建打下基础。方法自pCDNA-VEGF121质粒中切取VEGF121基因,将VEGF基因克隆到穿梭质粒,在BJ5183细菌内重组,在293细胞中构建携带VEGF基因的重组腺病毒,将腺病毒感染BMSCs,利用ELISA、免疫组织化学的方法检测VEGF121在BMSCs中的表达。结果通过pAd-Easy系统成功构建高滴度的携带VEGF121基因重组腺病毒pAd-VEGF,ELISA检测显示经转染的BMSCs中VEGF121的表达均明显增强,随着感染病毒MOI值的增高,VEGF121的表达量相应增高,差异有统计学意义(P<0．01),免疫组化法显示经基因转染的BMSCs中有强阳性信号,未转染组出现阴性结果。结论Ad-VEGF转染BMSCs后能稳定提高VEGF蛋白的表达。     

人骨形态发生蛋白-2基因转染兔骨髓基质干细胞及其表达

目的探讨含有人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)cDNA的真核表达载体在兔骨髓基质干细胞(MSCs)中的转录及表达情况,为进一步进行多基因转染MSCs复合纳米仿生骨治疗骨缺损实验提供材料。方法用电穿孔方法将真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP2转染至兔MSCs中,荧光显微镜及流式细胞学检查观察转染效果、检测转染效率,定量RT-PCR方法观察hBMP-2cDNA在兔MSCs中的转录情况,免疫组织化学及westernblot方法检测hBMP-2蛋白表达情况,ALP活性定量测定检测hBMP-2蛋白功能。结果电穿孔方法将重组质粒转染至兔MSCs中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪检测转染效率为(42.7±2.1)%,转染24h后定量RT-PCR方法检测到hBMP-2cDNA在兔MSCs中的转录片断,免疫组织化学观察到hBMP-2蛋白呈强阳性表达,westernblot方法可见18KDhBMP-2蛋白条带,转染组细胞ALP活性明显提高(P>0.05)。结论pIRES2-EGFP-hBMP2通过电穿孔方法导入兔MSCs,并在其中有效表达,发挥生物学作用。     

脂质体介导血管内皮生长因子基因片段在犬骨髓基质干细胞中的表达及其影响

目的 探讨脂质体介导的重组血管内皮生长因子165(vascularendothelial growthfactor 165,VEGF165)基因转染后的犬骨髓基质干细胞分泌血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)的能力及细胞增殖能力的改变,为改善骨缺血坏死的干细胞治疗方法提供基础.方法 实验分VEGF165基因转染组与空白对照组,从成年犬的胫骨抽取骨髓,体外分离纯化,贴壁培养骨髓基质干细胞,传代培养后以脂质体法将携带荧光蛋白VEGF165基因的穿梭质粒转入实验组骨髓基质干细胞中,在荧光显微镜视下观察转染效率,并通过ELISA法分别检测转染后1、3、5、7、9、11、13 d实验组与对照组培养液中VEGF的含量,对结果进行统计分析.MTT法检测转染细胞的增殖能力,绘制增殖曲线.结果 重组人血管内皮生长因子165(recombinate the human being vasular endotheial growth factor165,hVEGF165)基因通过脂质体能够成功转染犬骨髓基质干细胞并分泌VEGF.h-VEGF165基因转染组培养液中VEGF蛋白含有量较未转染组增高,ELISA结果显示转染后上清液中第2天即可出现VEGF浓度的增高,到第7天时达到分泌高峰,筛选后的细胞上清液中VEGF浓度稳定在300ng/L左右,与对照组相比升高约10倍,其差别具有显著的统计学意义.骨髓基质干细胞转染基因后,细胞的增殖能力同对照组相比无明显差别.结论 采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到犬骨髓间充质干细胞中并可有效表达VEGF. hVEGF165基因转染犬骨髓基质干细胞对细胞的增殖能力无明显影响.     

重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨

目的：构建人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein,，hBMP-2)真核表达载体PcDNA3．1-hBMP-2，转染兔骨髓基质干细胞(bane marrow stromal cells，BMSCs)，种植去抗原牛松质骨(bovine cancellous bone，BCB)支架体外构建组织工程骨。方法：蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达，碱性磷酸酶(ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上，扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果：转染后，BMSCs表达BMP-2，ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀，伸展良好。结论：在脂质体介导下，BMP-2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化，转染后细胞在支架材料上贴附生长良好，为进一步应用携带BMP-2基因的人工骨修复骨缺损奠定了实验基础。     

生长板软骨细胞促进骨髓基质干细胞血管内皮生长因子的表达

目的观察骨髓基质干细胞(BMSCs)在生长板软骨细胞旁分泌作用下血管内皮生长因子(VEGF)的表达规律及其与成骨分化的相关性。方法大鼠BMSCs与生长板软骨细胞进行间接共培养,培养终末期做细胞化学染色,定量测定碱性磷酸酶(ALP)活性,用RT-PCR方法半定量检测VEGFmRNA的表达。结果生长板软骨细胞持续高表达VEGF。BMSCs随共培养时间的延长,ALP活性升高,BMSCs的VEGF的表达也逐渐增强。培养液加入两种分泌型VEGF中和抗体后,VEGF表达趋势不变,ALP活性仍为升高趋势,也不影响培养终末期钙化结节的形成。培养终末期BMSCs的CD31和CD34均阴性。结论BMSCs成骨分化过程中VEGF的表达符合成骨细胞分化基因的表达规律,与成骨细胞特征性基因的表达趋势一致,体外条件共培养条件下,中和VEGF后并不能阻碍BMSCs的成骨分化。     

成骨细胞与诱导剂对骨髓基质干细胞的增殖与成骨分化的影响

目的探索一种新的骨髓基质干细胞(marrow stromal stem cells,MSCs)增殖与成骨分化的体外诱导培养体系. 方法乳大鼠颅骨来源的第3代成骨细胞与诱导剂(1 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50μg/ml抗坏血酸)对大鼠股骨、胫骨来源的MSCs生长的影响.于8块24孔板上培养MSCs,每孔接种5×104个第3代MSCs.按培养成分不同分为4组,每组2块.DMEM培养为对照组;诱导剂培养为诱导剂组;成骨细胞培养为成骨细胞组;联合使用成骨细胞与诱导剂培养为联合诱导组.计数诱导1～8 d各组MSCs的数量并绘制细胞生长曲线,检测诱导10 d的MSCs的碱性磷酸酶活性,采用RT PCR检测诱导2周时MSCs骨钙素mRNA的表达水平.结果原代及传代MSCs形态正常.细胞生长曲线示MSCs数量均随时间延长增加.成骨细胞组增殖最快,诱导剂组增殖最慢,5～8 d成骨细胞组及诱导剂组细胞数量与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).联合诱导组碱性磷酸酶活性为2.01±0.56 U与对照组0.68±0.14 U、诱导剂组1.27±0.43 U及成骨细胞组0.77±0.19 U比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).对照组不表达骨钙素mRNA,诱导剂组为0.783±0.094、联合诱导组为0.814±0.071与成骨细胞组0.302±0.026比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论联合使用成骨细胞和诱导剂诱导MSCs,不影响MSCs的正常增殖而促进MSCs的成骨分化,诱导效果较好,可望成为一种新的骨组织工程种子细胞的体外培养体系.     

成人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的研究

目的研究成人骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）体外分化为血管内皮细胞的能力并探讨其诱导条件。方法分离成人骨髓单个核细胞，经贴壁法获取MSCs。所获细胞分4组进行诱导：组1、2以5×10^3／cm^2细胞密度接分别接种于含2％和15％胎牛血清的L—DMEM培养基；组3、4以5×10^4／cm^2细胞密度分别接种于上述两种血清浓度的培养基，各组细胞经血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）辅以牛脑提取物的诱导，对照组为正常传代培养的MSCs。在诱导的第14、21天分别测定表面分子CD34、VEGFR-2、CD31和Ⅶ因子相关抗原（factor Ⅷ—related antigen，又称von Willebrand factor，vWF）以及体外成血管实验对分化细胞进行鉴定，同时测定不同诱导条件下的细胞增殖指数（proliferation index，PI）。结果组3细胞经诱导后，内皮系表面分子CD34、VEGFR-2、CD31、vWF于第14天均有不同程度表达，分别为8．5％、12．0％、40．0％、30．0％．其中CD34、VEGFR-2在第21天表达上调，为15．5％、20．0％，余各诱导组细胞未表达上述表面分子；诱导后的组3细胞呈低增殖状态（PI值约为10．4％），在半固体培养基中还可形成血管腔样结构。结论从成人骨髓中分离培养的MSCs，在较高细胞接种密度和低增殖状态下，经VEGF、牛脑垂体提取物诱导后，可分化为血管内皮细胞，可作为治疗性血管生成及组织工程理想的种子细胞。     

人血管内皮细胞生长因子cDNA克隆和在大肠杆菌的高效表达

目的 在大肠杆菌高效表达人血管内皮生长因子蛋白质。方法 用PCR从人胎儿脑cDNA文库扩增血管内皮细胞生长因子（VEGF）cDNA,得到517bp的DNA片段。扩增片段重组到M13mP18中,经测序证实为VEGF165cDNA。将该片段重组到PRL621温控表达质粒中,在大肠杆菌表达20kd的重组蛋白。结果 该表达产物占菌体总蛋白的35%,其N-端15个氨基酸序列与天然VEGF165蛋白相应序列一致。结论 工程菌TG1/PRL621/VEGF高效表达人VEGF165蛋白质。     

人血管生成素1真核表达载体的构建及在兔骨髓间充质干细胞的表达

目的 探索构建人血管生成素1(human angiopoietin 1，hAng-1)真核表达载体，转染体外培养兔骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stemcells，MSCs)修复骨缺损的可能性。方法 基因重组和限制性内切酶酶切构建真核表达载体pcDNA3-hAng 1，经脂质体DOTAP介导质粒转染兔MSCs，G418筛选阳性克隆，RTPCR及免疫印迹杂交检测hAng-1 mRNA及蛋白表达。结果 重组真核表达载体pcDNA3-hAng-1经限制性内切酶Xho-I和BamH-I酶切后，电泳显示1．4kb hAng-1目的片段和5．4kb pcDNA3载体片段，转染兔MSCs后，RT-PCR检测出目的基因mRNA，免疫印迹杂交检出hAng-1的蛋白表达。结论 构建的真核表达载体pcDNA3-hAng-1能在转染的兔MSCs中表达，可以为组织工程骨修复奠定基础。     

骨髓间充质干细胞向神经细胞定向分化的体外研究

目的　探讨骨髓间充质干细胞( marrow stromal stem cells,MSCs)向神经细胞定向分化中神经蛋白分子的表达情况。　方法　取第5～7代体外培养Wistar大鼠MSCs,以0 .5μmol/ L全反式视黄酸( all- trans retinoidacid,ATRA)预诱导2 4 h后,换用改良神经细胞培养基( modified neuronal medium,MNM)继续培养。在ATRA作用2 4 h及MNM作用2、6、9、18及36 h,免疫组织化学检测巢蛋白( Nestin)、神经元特异性核心抗原( neuron- specificnuclear protein,Neu N)、微管相关蛋白2 ( microtubule- associated protein 2 ,MAP- 2 )和胶质纤维酸性蛋白的表达情况。　结果　ATRA和MNM作用后,MSCs呈典型神经元样,伸出较多的突起和分支,形成网络。Nestin最先表达,ATRA作用2 4 h出现,Neu N其次,MNM作用2 h检测到,MAP- 2最晚,MNM作用9h检测到。Nestin在MNM作用18h后表达最强,其阳性率为92 .3%±3.4 % ;36 h后表达明显减弱,阳性率仅为12 .3%±3.4 % ,而其它标志蛋白则持续表达。　结论　ATRA和MNM能促进MSCs向神经前体细胞和神经元转化,神经蛋白分子的表达顺序与神经细胞发育过程一致,为研究神经细胞发育提供了一个较好的体外模型     

纤维蛋白胶复合骨形成蛋白的注射型骨修复材料对兔骨髓基质细胞增殖和分化的影响

目的观察以纤维蛋白胶（fibrin sealant，FS）为载体复合骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的注射型骨修复材料对体外培养的兔骨髓基质细胞（marrow stromal cells，MSCs）增殖和分化的影响，为其临床应用提供实验依据。方法取3日龄新西兰兔骨髓进行培养传代，采用第3代细胞进行研究。实验分为3组，实验组：以含1μg／ml rhBMP-2注射型FS培养细胞；FS对照组：以单纯FS培养细胞；空白对照组：不作任何处理。采用细胞培养、组织化学及电镜等方法对各组兔MSCs的增殖、贴壁率、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性及染色、Ⅰ型胶原表达、超微结构及细胞在材料中的生长情况进行观察。结果各组细胞促增殖作用由强到弱依次是：FS对照组→实验组→空白对照组，各组间差异均有统计学意义（P〈0.05）；对细胞贴壁率的影响总体由强到弱依次是：FS对照组→实验组→空白对照组，各组间差异均有统计学意义（P〈0.05）。各组ALP活性由强到弱依次是：实验组→FS对照组→空白对照组，各组间差异均有统计学意义（P〈0.05）；各组细胞的Ⅰ型胶原表达水平由高到低依次是：实验组→FS对照组→空白对照组，差异均有统计学意义（P〈0.05）。扫描电镜观察，材料表面粗糙，有微孔存在，FS对照组、实验组细胞与材料融合生长。透射电镜观察：实验组细胞向成骨细胞分化程度高，但细胞增殖活性较FS对照组稍差；FS对照组细胞向成骨细胞分化的程度较实验组低，细胞增殖活性较好；空白对照组的细胞增殖活性较差，胞外基质少。结论以FS为载体复合BMP的注射型骨修复材料可显著提高MSCs向成骨细胞方向的分化水平，但对MSCs促增殖作用不明显。     

小鼠骨髓基质干细胞与人耳脱细胞软骨复合培养的研究

目的探讨以小鼠骨髓基质干细胞(MSCs)作为组织工程软骨的种子细胞,在人耳脱细胞软骨支架上生长的可行性.方法将人耳软骨经脱细胞处理,得到脱细胞软骨支架.抽取鼠的骨髓,经离心得到单个核细胞,进行体外分离培养得到MSCs.将鼠的第2代MSCs种植于脱细胞软骨支架上,体外立体培养10天,在光镜及电镜下观察细胞生长及胶原纤维排列情况.结果 MSCs在人耳脱细胞软骨支架上能立体培养成活,细胞分布不均,靠近培养液的一面细胞分布较多,其中大部分细胞进入已脱细胞的软骨陷窝内,每个陷窝内的细胞数为1～2个.结论以鼠MSCs为种子细胞,可在人耳脱细胞软骨支架上良好生长,构建组织工程软骨.     

乳腺疾病中血管内皮生长因子的表达及其意义

目的 观察乳腺良恶性疾病中血管内皮生长因子（VEGF）的表达状况以及与肿瘤大小、临床分期、血行转移、腋淋巴结转移等预后因素的关系。方法 用免疫组化LSAB法分析了70例乳腺浸润性导管癌、30例良性乳腺病和7例癌旁组织中VEGF的蛋白表达情况。结果 乳癌组和癌旁组VEGF表达水平显著高于良性病组。有血行转移或淋巴结转移组VEGF表达水平高于无转移组，而在其他预后因素中分布无差异。结论 VEGF表达水平对判定乳腺疾病良恶性及乳癌血行转移或淋巴转移的可能性有一定的预示价值。     

血管内皮生长因子在骨折愈合中的作用

目的　研究血管内皮生长因子 (VEGF)在骨折愈合过程中的作用 ,探讨应用 VEGF及拮抗VEGF对骨折愈合所产生的影响。方法　利用新西兰大耳白兔 10 5只制作左侧桡骨中段骨折动物模型 ,随机分成三组 ,两组分别应用 VEGF多克隆抗体及 VEGF,另一组为对照组 (不作任何处理 )。在伤后 8、2 4、72小时和 1、3、5、8周利用单光子放射计算机断层显像术测定骨折端血流量变化 ,在 1、3、5及 8周摄 X线片观察骨折愈合情况。结果　应用 VEGF使骨折端血流量在 8小时～ 3周较对照组增高 ,但 X线片却未见明显差异 ;而 VEGF多克隆抗体可导致骨折端血流量在各时相点较对照组明显减少 ,并阻碍了骨折的愈合进程 ,最终使骨折端形成骨不连样改变。结论　骨折愈合过程中缺乏 VEGF将严重影响骨折的正常愈合过程 ,并导致骨不连接 ,应用外源性 VEGF可能通过增加骨折端血流量而对骨折愈合有益