人慢性粒细胞白血病树突状细胞的培养和鉴定

为探讨树突状细胞(ＤＣ)疫苗在慢性髓性白血病(ＣＭＬ)治疗中的作用,我们首先建立从ＣＭＬ骨髓和外周血单个核细胞中培养ＤＣ的方法,并比较ＣＭＬ来源的ＤＣ与正作者单位:100034北京医科大学人民医院血液病研究所常骨髓来源的ＤＣ在形态和表面分子表达等方面的差异,以寻找提高ＣＭＬ来源树突状细胞功能的措施,为进一步应用ＤＣ疫苗治疗ＣＭＬ提供线索。一、对象与方法1对象:25例成人Ｂｃｒ/Ａｂｌ融合基因和染色体阳性ＣＭＬ慢性期骨髓和外周血标本,诊断和分期依据国际骨髓移植登记组分期标准。正常骨髓标本6例。2树突状细胞培养:骨髓或外周…     

慢性粒细胞白血病患者骨髓中不同细胞诱生树突状细胞的体外研究

目的:体外诱导慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓单个核细胞(BMMNCs)、CD34+细胞、单核细胞为树突状细胞(DCs),并对其形态、表型及其刺激T细胞增殖作用进行比较。方法:利用GM-CSF、IL-4、TNF-α体外定向诱导生成树突状细胞,利用流式细胞仪对所诱生的细胞进行细胞形态及表型检测,用D-FISH方法检测所诱生DCs的白血病源性。并应用MTT法检测所诱生的DCs刺激T细胞增殖的能力。结果:CML患者BMMNCs、CD34+细胞、单核细胞体外均可诱导生成bcr/abl融合基因阳性的DCs,前者DCs产量明显高于后二者,但均具有刺激自体及异体T细胞增殖的能力,且三者无显著性差异。结论:来源于CML患者骨髓的BMMNCs、CD34+细胞、单核细胞均可诱生成CMLDCs,对T细胞均具有刺激增殖能力,但BMMNCs所诱生的DC主要来源于未成熟的中性粒细胞。     

当归多糖促进慢性粒细胞白血病细胞性树突状细胞的诱导生成

目的 探讨当归多糖(APS)对慢性粒细胞白血病细胞诱导生成树突状细胞(DCs)的影响。方法 取慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓单个核细胞，分别予粒-巨噬集落刺激因子(GM—CSF)／白介素-4(IL-4)培养或GM-CSF／IL-4联合各浓度APS(50，100，200mg／L)培养，普通光镜和电镜观察细胞形态，台盼蓝拒染法检测细胞成活率，流式细胞仪检测DCs的免疫表型(CD80，CD86，CD83)，自体或异体混合淋巴细胞反应检测DCs刺激T淋巴细胞的增殖能力。结果GM-GSF/TL-4或GM-CSF，IL-4／APS诱导培养的慢性粒细胞白血病骨髓单个核细胞均表现出典型的树突状形态而且表达高水平的免疫表型。GM-CSF／IL-4／APS培养的DCs的细胞成活率和增殖能力显著提高，CD83，CD80，CD86表达显著升高，APS组慢性粒细胞白血病细胞诱导的树突状细胞(CML-DCs)刺激T淋巴细胞的增殖能力更强。结论 GM-CSF/IL-4/APS培养的DCs的CD83，CD80、CD86表达率明显高于GM-CSF／IL-4组。GM-CSF／IL-4／APS诱生的CML-DCs刺激T淋巴细胞增殖能力强于GM-CSF／IL-4组。APS能促进IL-4和GM-CSF对CML-DCs的诱生与成熟。     

rhGM-CSF联合rhIL-4诱导慢性粒细胞白血病细胞来源的树突状细胞

目的 用rhGM-CSF联合rhIL－4将慢性粒细胞白血病（CML）原代细胞诱导成树突状细胞（DC），探索白血病免疫治疗的新途径。方法 分离初诊CML患者外周血单个核细胞（PBMNC），用rhGM-CSF联合rhIL－4共同培养7d；流式细胞仪（FACS）检测细胞因子诱导前后细胞表面HLA－DR、CD1a、CD80和D86的表达，电镜观察细胞形态。结果 经7d的诱导，HLA－DR、CD1a、CD80和CD86的表达明显上调；电镜观察到典型的DC 形态特征。结论 rhGM-CSF联合rhIL－4可成功将CML原代细胞诱导成CML－DC，可望用于CML的免疫治疗。     

慢性粒细胞白血病骨髓的体外净化

目的 :探讨白细胞介素、干扰素α2α、bcr -abl反义寡核苷酸对慢性粒细胞白血病骨髓体外净化效果。方法 :采用体外克隆形成培养技术 ,分别用白细胞介素、干扰素α2α、bcr-abl反义寡核苷酸不同的组合方案 ,进行体外净化 5例慢性粒细胞白血病 (CML)骨髓。结果 :联用IL - 2、IFN -α2α(各 80 0um/ml)、bcr-ablAS -ODN(30ug/ml)方案 ,对白血病细胞克隆形成单位 (L -CFU)抑制作用有显著差异 (P <0 .0 1 ) ,而相同条件下 ,GM-CFU及L -CFU的集落存活率分别为 2 6 .91 %和 3 .49% (P <0 .0 1 )。结论 :联用IL - 2、IFN -α2α(各 80 0u/ml)、bcr-ablAS -ODN(30ug/ml)方案 ,选择性体外净化慢性粒细胞白血病细胞的效果好 ,可用于临床净化CML骨髓。     

慢性粒细胞白血病骨髓体外净化的实验研究

目的　探讨白细胞介素、干扰素 α2 a、bcr- abl反义寡核苷酸对慢性粒细胞白血病骨髓体外净化效果。方法　采用体外克隆形成培养技术 ,分别用白细胞介素、干扰素 α2 a、bcr- abl反义寡核苷酸不同的组合方案 ,体外净化 5例慢性粒细胞白血病 (CML)骨髓。结果　联用 IL- 2、IFN- α2 a(各 80 0 u/ m l)、bcr- abl AS- ODN(30 μg/ ml)方案 ,对白血病细胞克隆形成单位 (L- CFU)抑制作用有显著差异 (P<0 .0 1) ,而相同条件下 ,GM- CFU及 L- CFU的集落存活率分别为 2 6 .91%和 3.49% (P<0 .0 1)。结论　联用 IL- 2、IFN- α2 a(各 80 0 u/ m l)、bcr- abl AS- ODN(30 μg/ml)方案 ,选择性体外净化慢性粒细胞白血病细胞的效果好 ,可用于临床净化 CML 骨髓     

慢性粒细胞白血病树突状细胞的体外定向诱导扩增及鉴定

目的：W本外定向诱导扩增慢性粒细胞白血病（CML）患者外周血单个核细胞（PBMNC）来源的树突状细胞（CML－DC）并测定其表型。方法：取CML患者新鲜抗凝血,用淋巴细胞分离液分离PBMNC,经细胞因子rhGM-CSF,rhIL-4,rhTNF-α联合刺激培养9－12d,收集培养细胞,光镜形态学分析并细胞计数,结合PE－CD1a单抗、FITC－CD14居流式细胞 （FCM）上进行CML－DC比例及表型分析。结果CML患者PBMNC经以上细胞因子联合培养,CML－DC含是可达3．5％－23．5％,而新鲜分离的CML患者PBMNC中CML－DC含量仅为0．1％－1％,结论CML患PBMNC 体外定向诱导扩增培养可以生成较多的CML－DC,从而为CML的免疫治疗应用于临床提供了基础。     

慢性粒细胞白血病骨髓体外净化的实验研究

OBJECTIVE: To investigate the effect of IL-2, IFN and bcr-abl AS-ODN on bone marrow purging in vitro for patients with chronic myelogenous leukemia (CML). METHODS: By amplifying in vitro clone forming culture, and purging the bone marrow of 5 CML patients through different combined use of IL-2, IFN and bcr-abl AS-ODN, we compared the effects of 4 combined regimens. RESULTS: It was found that the suppressive effects of the 4th regimen combining IL-2 (800 U/ml), IFN (800 u/ml) and bcr-abl AS-ODN (30 micrograms/ml) on leukemia cell clone forming unit (CFU) were significantly different from the suppressive effects of the other 3 regimens (P < 0.01). With the use of the 4th regimen, the GM-CFU and L-CFU survival rates were 26.91% and 3.49% respectively (P < 0.01). CONCLUSION: The combined regimen of IL-2 (800 U/ml), IFN (800 u/ml) and bcr-abl AS-ODN (30 micrograms/ml) has good effect on selective CML bone marrow purging in vitro and can be used in clinical purging of CML bone marrow.     

慢性粒细胞白血病树突状细胞诱导及其抗肿瘤功能的体外研究

目的 探讨人慢性粒细胞白血病(CGL)来源的树突状细胞(DC)的免疫功能。方法 应用重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)联合重组人白介素(rhIL)-4在体外诱导培养CGL细胞,获得DC。应用流式细胞仪(FACS)检测诱导前、后的细胞表型,观察其诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)的体外抗肿瘤效应。采用酶联免疫吸附试验(ELIS)测定DC培养及DC与外周血单个核细胞(PBMNC)共同培养的上清液中IL-12及干扰素(IFN)-γ的量。结果 联合rhGM-CSF及rhIL-4可诱导CGL细胞分化为DC;CGL-DC体外激活的CTL对CGL细胞具有特异性细胞毒活性;分别从诱导DC培养上清液和DC PBMNC培养的上清液中检测出一定量IL-12及IFN-γ。结论 CGL-DC具有抗原提呈细胞的免疫功能,可望用于CGL的免疫治疗。     

CML自体树突状细胞对CML白血病细胞作用的研究

目的　研究慢性粒细胞白血病 (CML)自体树突状细胞 (DC)对费城 (Ph)染色体细胞的作用。方法　采用液体培养法从 4例 CML 慢性期患者外周血单个核细胞 (PBMNC)中培养出 DC及 T细胞 ,而后将 DC加 IL- 2或 IL- 2激活的 T细胞 ,分别与自体 PBMNC及 K5 6 2细胞共同孵育 6 h,行常规染色体测定 ,分析自体及 K5 6 2 Ph+染色体细胞残存率。结果　从 4例 CML 患者 PBMNC中培养出约 3× 10 5～ 2× 10 6 PBMNC的自体 DC;DC加 IL-2激活的 T细胞比单用 IL- 2激活的 T细胞对自体 Ph+染色体细胞的杀伤作用强 (P<0 .0 0 1) ;DC激活的自体 T细胞对自体 Ph+染色体细胞的杀伤作用强于对 K5 6 2 Ph+染色体细胞的杀伤作用 (P<0 .0 0 1)。结论　 DC激活的 T细胞能有效抑制 Ph+染色体细胞 ;CML 患者 DC激活的自体 T细胞对自体 Ph+染色体细胞特异性的杀伤作用可能受到主要组织相容性 (MHC)的限制     

慢性粒细胞性白血病患者间充质干细胞的分离、纯化及向神经元样细胞分化的研究

目的研究慢性粒细胞性白血病（CML）骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离、纯化、扩增以及在体外向神经元样细胞定向分化的能力。方法获取CML患者的骨髓MSCs，采用低血清培养液培养，瑞士染色观察其形态；流式细胞仪检测其免疫表型和细胞周期；逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测CML特异性表达的bcr／abl基因；分析骨髓MSCs染色体核型。全反式维甲酸（ATRA）诱导MSCs在体外分化为神经元样细胞，倒置相差显微镜观察神经元样细胞的形态，免疫组织化学染色法和Western blot法检测神经丝蛋白（NF）和神经元烯醇化酶（NSE）的表达。结果CML来源的骨髓MSCs呈纤维样贴壁生长，体外培养易扩增；表达相关抗原CD29、CD44、CD105，不表达CD31、CD13、CD34、CD45、HLA—DR；不表达bcr／abl融合基因，且具有正常的核型；不同扩增代数的MSCs在诱导剂的作用下呈现典型的神经元样细胞形态，NF、NSE呈阳性反应。结论CML患者骨髓中可以分离培养MSCs，它具有体外大量扩增并保持低分化状态的特性和定向分化为神经元样细胞的能力，是一种可用于神经系统疾病治疗的种子细胞。     

急性髓性白血病骨髓基质细胞白细胞介素—6分泌活性的研究

目的：检测急性髓性白血病（ Ａ Ｍ Ｌ）时骨髓基质细胞 Ｉ Ｌ６ 分泌活性，并探讨其对 Ａ Ｍ Ｌ增殖的作用。方法：我们选择了１５ 例 Ａ Ｍ Ｌ患者及１０ 例正常对照者，应用体外骨髓基质细胞培养法及 Ｉ Ｌ６ 生物活性检测法。 Ｉ Ｌ６活性测定采用 Ｉ Ｌ６ 依赖性细胞株 Ｍ Ｈ６０，染色后在酶标仪上测定。结果： Ａ Ｍ Ｌ骨髓基质细胞形成能力较差，但其 Ｉ Ｌ６ 活性明显高于未添加组（ Ｐ ＜ ００５）。结论： Ａ Ｍ Ｌ时骨髓基质细胞存在量和质的异常， Ｉ Ｌ３ 可促进 Ｉ Ｌ６ 的分泌， Ｉ Ｌ６ 的异常分泌在 Ａ Ｍ Ｌ的细胞增殖上可能起重要作用。     

自身骨髓移植治疗急性髓系白血病：附7例报告

对7例急性髓系白血病(AML)完全缓解期(CR)患者进行自身骨髓移植(ABMT)洽疗,结果7例患者均恢复造血,无1例近期死亡。ABMT后随访情况表明,标危组2例在CR1期移植者已无病生存26及18月,在CR2期移植的2例中1例已超过30月,另1例于移植后9月死于他因,并无白血病复发迹象。3例高危组患者中2例于移植后5月复发,另1例已持续CR5.5月,目前尚在观察中。提示ABMT对标危组AML(CR1及CR2期)患者的疗效优于高危组。     

细胞周期检测点激酶Chk1和Chk2在急性白血病骨髓单个核细胞中表达的研究

目的　探讨细胞周期检测点激酶 1,2 (Chk1,2 )在急性白血病中表达的意义。方法　用RT PCR方法、免疫组织化学方法及共聚焦显微镜检测Chk1和Chk2的mRNA和蛋白在白血病细胞株K5 6 2及急性白血病骨髓单个核细胞中的表达。结果　Chk1和Chk2的mRNA水平在急性白血病与增生性贫血之间无显著差异 ,Chk1和Chk2在K5 6 2细胞及白血病骨髓单个核细胞的细胞质和细胞核中均有表达 ,Chk1蛋白在初治及骨髓幼稚细胞大于 30 %的复治白血病的骨髓单个核细胞中核表达显著增高 ,Chk2蛋白在白血病骨髓单个核细胞中核表达与增生性贫血相比无显著差异。结论　Chk1和Chk2的mRNA水平与白血病发生无关 ,但Chk1蛋白表达水平与白血病发生有一定的相关性 ,Chk1有作为白血病治疗靶点的可能性 ,Chk2蛋白表达水平与白血病发生无关。     

慢性髓性白血病细胞来源的树突状细胞大容量诱导及其功能的实验研究

目的　探索大容量诱导慢性髓性白血病 (CML)细胞来源的树突状细胞 (DCs)的适宜方法 ;研究CML DCs刺激自体T淋巴细胞增殖并分泌γ 干扰素 (IFN γ)的能力。方法　用CS 30 0 0 plus血细胞分离机采集初诊CML病人的外周血单个核细胞 (PBMNCs) ;单采的CML PBMNCS转入组织培养袋 ,加入重组人粒 巨细胞集落刺激因子 (rhGM CSF)和重组人白介素 4 (rhIL 4 ) ,培养诱导 7d ;在诱导前后 ,用流式细胞仪分别检测细胞表面HLA DR、CD1a、CD80和CD86的表达水平 ;用3 H TdR掺入法检测CML DCs和CML PBMNCs刺激自体和异体T细胞增殖的能力 ;用ELISA法检测在自体混合淋巴细胞培养 (MLR)时T细胞分泌的IFN γ浓度。结果　用血细胞分离机收集的CML PBMNCs ,在组织培养袋内经细胞因子培养诱导 ,HLA DR、CD1a、CD80、CD86的表达均有明显上调 ,细胞形态也表现典型的DC特征 ;CML DCs能显著刺激自体和异体T细胞增殖 ,而CML PBM NCs仅能刺激异体T细胞的增殖 ,刺激自体T细胞增殖的能力很弱 ;刺激自体T细胞增殖时分泌的IFN γ浓度 ,CML DCs组为 (877± 2 14 )pg/mL ;CML BPMNCs组仅为 (14± 1.7) pg/mL。 结论　单采的CML PBMNCs转入组织培养袋 ,加入rhGM CSF和rhIL 4 ,可收获大容量的CML DCs;CML DCs在体外具有显著刺激自体T细胞增殖     

基质金属蛋白酶在慢性粒细胞白血病患者中的表达及其临床意义

目的 检测慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓单个核细胞基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9、MMP-14)及其抑制剂(TIMP-1、TIMP-2)基因表达情况.方法 收集CML患者及正常成人的骨髓,分离单个核细胞,抽提RNA后进行RT-PCR得到cDNA,利用所合成的引物进行相应基因的扩增.结果 在12例正常成人骨髓单个核细胞基因中皆有MMP-9、TIMP-1的表达,6例表达TIMP-2,而MMP-2和MMP-14的表达皆为阴性;30例CML患者皆有MMP-9、TIMP-I的表达,其中26例有TIMP-2的表达,11例表达MMP-2和MMP-14;而11例表达MMP-2的患者中,3例已发生急变,6例处于加速期.结论 MMP-2与MMP-14的表达在骨髓单个核细胞中具有一致性,两者的出现与慢性粒细胞白血病进展相关.     

Identification and Ultrastructure Observation of Rat Bone Marrow Derived Dendritic Cells in Vitro

Objective To amplify large number of dendritic cells （DCs） from murine bone marrow and assay their morphological and immunological characteristics. Methods The rat marrow cells were collected and cultured for 3 days and the floating cells were removed. The combination of rat IL-4 and GM-CSF at 5ng/ml were added into the fresh mediums. On day 7-8, cells were supplemented with GM-CSF only （2.Sng/ml）. Dendritic cells at different maturation stages were analyzed for their phenotype, morphology, and functional properties. Results Early stage or immature DCs were round-shaped and showed no dendrites with intermediate levels of MHC- II and low levels of the costimulator molecules CD80 and CD86. Upon further culture, the cultured DCs had the typical morphological characterization of DCs, a strong upregulation of MHC-II, CD80, CD86 and CD11 b could be observed, and the ability of stimulating the proliferation of allogeneic T cells was enhanced. DCs （day 12 and lipopolysaccharide （LPS）- treated） were full maturation with the capacity of stimulating the proliferation of allogeneic strengthened and higher level of MHC- H, CDS0, CD86 and CD1 lb. Conclusion A method to generate large number of DCs from murine bone marrow is established. Dendritic cells at different maturation stages could be obtained, which contribute to further studying the functions of immune tolerance and activation of DCs.     

不典型慢性粒细胞白血病血液学特征分析

目的：探讨不典型慢性粒细胞白血病的诊断．方法：对比分析12例不典型慢性粒细胞白血病和23例典型慢性粒细胞白血病的临床表现和血液细胞学特征．结果：不典型慢性粒细胞白血病发病年龄较大，多数患者元贫血，血小板轻度增高，脾大不明显，外周血中性粒细胞碱性磷酸酶积分稍减低或正常，Ph染色体阴性，PCR检测阴性．结论：不典型慢性粒细胞白血病诊断必须结合临床动态观察，若随病程延长，病情加重，其他治疗无效者，应考虑本病．