丹参酮ⅡA诱导NB4细胞凋亡与线粒体跨膜电位关系的研究

目的：研究丹参酮ⅡA（TanⅡA）诱导NB4细胞凋亡与线粒体跨膜电位（△Ψm）关系。方法：将NB4细胞分别用TanⅡA、As2O3,TanⅡA 1.0μg/ml环孢菌素A（CsA）和As2O3 1.0μg/mlCsA处理，多面手用光镜和透射电镜观察NB4细胞形态学变化；用流式细胞术分别测定G1期细胞百分率及PI和Rh123双染色后细胞的△Ψm。结果：NB4细胞经1．0和2．0μg/mlTanⅡA处理后的亚G1期细胞百分率无差异，但均高于0．5μg/ml组。NB4细胞经TanⅡA作用后，光镜和透射电镜下观察到典型的凋亡形态学特征；随着TanⅡA作用时间增加，NB4细胞凋亡数增加和△Ψm降低（P＜0．01），两者呈直线关系。CsA能抑制TanⅡA诱导NB4细胞△Ψm降低和凋亡细胞数增加（P＜0．01）。结论：TanⅡA诱导NB4细胞凋亡是通过使线粒体膜通透性转运孔开放，△Ψm降低来实现的；CsA能抑制这些效应。     

三氧化二砷诱导NB4细胞凋亡和环氧合酶-2基因表达研究

本研究探讨三氧化二砷(As2O3)诱导NB4细胞凋亡过程中线粒体膜电位的改变及环氧合酶-2的表达变化。利用免疫荧光显微镜、DNA电泳等观察As2O3诱导NB4细胞凋亡过程中NB4细胞的形态学改变,流式细胞术检测NB4细胞凋亡率及线粒体膜电位改变,Western blot分析环氧合酶-2的蛋白质表达水平变化。结果表明,经2μmol/L As2O3处理NB4细胞48小时后,荧光显微镜显示NB4细胞出现核致密浓染、染色质固缩及片断化断裂,甚至呈碎片状;提取DNA进行琼脂糖电泳显示典型DNA Ladder现象。流式细胞术分析发现,NB4细胞经3μmol/L As2O3处理48小时后细胞凋亡率为33.34%,As2O3浓度越高,NB4细胞凋亡率越高;以0.5、1、2、4及8μmol/L As2O3分别处理NB4细胞48小时后,线粒体膜电位分别下降12.8%、21.6%、66.9%、83.7%和83.8%;Western blot检测显示,环氧合酶-2在实验组的表达明显低于对照组,且随着As2O3浓度的升高,环氧合酶-2的表达逐渐降低,二者呈显著的负相关关系。结论 :As2O3能够有效诱导NB4细胞凋亡,且在一定浓度范围内具有量效关系;线粒体膜电位下降与As2O3诱导的NB4细胞凋亡有关;环氧合酶-2可能参与了As2O3诱导的NB4细胞凋亡过程。     

亚硒酸钠和三氧化二砷诱导人急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞凋亡机制的比较

为比较亚硒酸钠（Na2SeO3）和三氧化二砷（As2O3）诱导NB4细胞凋亡的作用机制，本研究应用MTT实验、DNA琼脂糖电泳，细胞内DNA含量检测研究细胞生长抑制和细胞凋亡，用化学发光法，化学比色法检测细胞内活性氧和还原型谷胱甘肽，用流式细胞术检测细胞内线粒体膜电位，结果显示：5μmol/L亚硒酸钠和1μmol/L三氧化二砷作用24小时后均能诱导NB4细胞凋亡。在诱导细胞凋亡的过程中，亚硒酸钠和三氧化二砷组均伴有细胞内活性氧水平的提高和线粒体膜电位下降，但在亚硒酸钠组还伴有细胞内还原型谷胱甘肽下降，用N乙酰半胱氨酸提高细胞内还原型谷胱甘肽后，增强了硒诱导NB4细胞细胞和氧化应激的作用，但是抑制了砷诱导细胞凋亡和氧化应激的作用。结论：亚硒酸钠和三氧化二砷同样可以诱导NB4细胞的凋亡，但是二的作用机制可能存在差异。     

三氧化二砷对急性早幼粒细胞白血病细胞凋亡相关基因表达的影响

本研究采用微矩阵基因芯片技术探讨三氧化二砷（As2O3）对NB4细胞凋亡的相关基因表达谱的影响。As2O3作用NB4细胞48小时，用改进的TRlzOL试剂一步法抽提As2O3作用前后的NB4细胞总RNA；经逆转录．聚合酶链反应后用Cy3标记的脱氧三磷酸尿苷（Cy32dUTP）和Cy52dUTP两种不同的荧光染料，将As2O3作用前后的NB4细胞mRNA分别标记成两种DNA探针，并与载有一组凋亡相关基因的表达谱芯片进行杂交，扫描分析筛选As2O3作用前后NB4细胞表达差异的凋亡基因；采用逆转录实时定量聚舍酶链反应（RQ—PCR）检测p2l，survivin，cdc2及WeelHu等方法检测细胞凋亡。结果表明：从As2O3作用后NB4细胞中筛选出表达差异的凋亡相关基因共18条，包括p21，survivin，cdc2及WeelHu等，表达上调的有6条，表达下调有12条；p21、survivin、cdc2及WeelHu可能与As20，诱导NB-4细胞的分化和（或）凋亡有关。结论：As203介导的NB4细胞凋亡的发生机制中、p21、sur-vivin、cdc2及Weel可能发挥着重要作用。     

硼替佐米联合三氧化二砷诱导NB4细胞凋亡及相关机制的研究

本研究旨在探索硼替佐米(bortezomib)联合三氧化二砷(As2O3)诱导急性早幼粒细胞白血病NB4细胞株的凋亡及相关调控机制。用流式细胞术AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡;Hoechst染色法观察凋亡细胞形态;Western blot检测caspase-3,caspase-9的活化以及NOXA蛋白的表达;以小干扰RNA(siRNA)技术特异性"沉默"NOXA基因;用脂质体Lipofectamine2000转染pEGFP-Noxa质粒和空载体pEGFP。结果表明,bortezomib(10 nmol/L)联合As2O3(0.5μmol/L)诱导NB4细胞凋亡率较单药As2O3(0.5μmol/L)诱导时增加,相应的caspase-3,-9的活化明显加强。单药As2O3诱导的NB4细胞中Noxa蛋白水平未发生改变,bortezomib和As2O3联合诱导的NB4中NOXA蛋白水平上调。特异性"沉默"NOXA基因后bortezomib和As2O3联合诱导的NB4细胞中caspase-3的活化程度降低,细胞凋亡率也明显下降。通过转染质粒高表达NOXA蛋白,单药As2O3诱导的NB4细胞中caspase-3的活化程度增加。结论:bortezomib可以增加NB4细胞对As2O3诱导凋亡的敏感性,这可能和促凋亡蛋白NOXA的表达上调有关。     

氨肽酶抑制剂Bestatin通过激活半胱天冬酶3诱导HL-60细胞凋亡

目的 研究半胱天冬酶3在国产氨肽酶N抑制剂Bestatin(商品名百士欣,BS）诱导人白血病细胞凋亡过程中的变化及其意义。方法 用光学显微镜观察细胞形态结构的改变,通过DNA片段原位末端标记法及流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡。用发色底物法检测细胞半胱天冬酶3活性。Rhodamin(Rh)123染色后,采用FCM检测细胞线粒体跨膜电位。结果 典型的细胞形态改变、DNA片段化、DNA末端原位标记及FCM结果,均证实BS能诱导HL－60细胞凋亡。凋亡率与药物剂量和作用时间呈依赖关系。BS诱导细胞凋亡过程中,半胱天冬酶3活性明显升高,而AC0DEVD－CHO能抑制BS诱导的细胞凋亡。经BS处理的HL－60细胞出现线粒体跨膜电位（ΔΨm)下降。结论 BS通过激活半胱天冬酶3而诱导白血病细胞凋亡。     

三氧化二砷对NB4及Jurkat细胞系端粒酶活性的抑制效应

为了探讨三氧化二砷(As2O3)对白血病细胞系NB4及Jurkat细胞端粒酶活性的调节作用和机制，采用MTT、基因组DNA电泳、蛋白／DNA双参数流式细胞术，端粒重复扩增(TRAP)-SYBR Green I染色及RT—PCR等方法研究了As2O3对两种细胞的增殖及端粒酶活性的影响。研究发现，随着As2O3作用时间的延长，NB4及Jurkat细胞增殖明显受到抑制，DNA电泳出现“梯状”条带；流式细胞术检出亚Gl峰，细胞周期阻滞于Gl和G2／M期，端粒酶活性显著降低，部分细胞周期及凋亡相关的调控蛋白的表达发生变化。结论：As2O3在抑制NB4及Jurkat细胞增殖和诱导其凋亡过程中导致端粒酶的活性下调，细胞周期及凋亡相关蛋白的表达改变可能参与了部分作用机制。     

As2O3和／或TGF-β1诱导NB4细胞凋亡中P27^Kip1、cyclin E、内源性TGF-β1的变化及其意义

本研究探讨三氧化二砷（As2O3）和／或转化生长因子-β1（TGF-β1）作用于NB4细胞后的细胞凋亡情况、P27^Kip1、cyclin E及内源性TGF—β1 mRNA水平的变化及其意义。用MTT法检测As2O3对NB4细胞的细胞毒性及IC50用瑞氏-姬姆萨染色观察凋亡细胞形态学的变化,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,半定量RT—PCR检测P27^Kip1、cyclin E以及内源性TGF-β1的mRNA水平。结果表明：As2O3、TGF-β1均能明显抑制NB4细胞的生长,促进NB4细胞的凋亡;As2O3对NB4细胞的抑制及促凋亡作用均呈剂量-时间依赖关系,24小时的IC50约为12μmol／L,48小时的IC50约为5μmol／L,72小时的IC50约为3μmol／L。As2O3和／或TGF—β1均可使NB4细胞出现细胞周期阻滞,5μmol／L As2O3使NB4细胞阻滞在G2／M期,5ng／ml TGF-β1使NB4细胞阻滞在G1期,两者联合处理组主要使S期阻滞。As2O3、TGF-β1分别作用于NB4细胞时均可见P27^Kip1及内源性TGF-β1的mRNA表达上调,而cyclin E的mRNA表达下调;联合处理组结果显示TGF—β1可增强As2O3上述作用。结论：As2O3及TGF-β1均可诱导NB4细胞凋亡,引起细胞周期分布异常;As2O3及外源性TGF—β1可能通过上调内源性TGF-β1使P27^Kip1高表达以诱导细胞凋亡;TGF-β1可能直接抑制了cyclin E的表达,或者通过上调P27^Kip1的表达而反馈抑制cyclin E的活性,从而导致NB4细胞周期阻滞。     

WT1基因转染增加白血病细胞凋亡的实验研究

为了探讨WT1基因异构体对急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4凋亡的影响及其分子机制,应用电穿孔的方法将携带WT1基因异构体WTA（-17AA/-KTS）全长cDNA的真核表达载体及其对照质粒pCB6^＋转导白血病细胞株NB4,建立WT1基因异构体表达比例改变的单克隆细胞株;用MTT、形态学观察、DNA凝胶电泳、An-nexin V结合力测定等方法观察WT1基因异构体表达比例的转变对白血病细胞NB4诱导凋亡的影响;用RT-PCR方法检测细胞中p21、p53、bcl-2、bcl-XL、和c-myc等凋亡相关基因表达的改变.研究结果表明,MTT显示NB4/WTA细胞对As2O3的IC50值较对照组明显降低;经As2O3作用48小时,NB4/WTA细胞Annexin V结合力较对照组细胞升高,出现更为典型的凋亡形态学改变;在DNA凝胶电泳可见更为明显的DNA梯形条带,RT-PCR检测提示NB4/WTA细胞p21、c-myc基因的表达较对照组高,bcl-2表达下降,p53、bcl-XL基因表达无明显改变.结论：增加外源性WT1基因异构体WTA的表达从而将WT1基因异构体表达的比例由＋17AA/＋KTS优势型转变为-17AA/-KTS优势型,能使NB4细胞对As2O3引起的凋亡更为敏感,这些改变可能与p21、c-myc等基因的表达上调和bcl-2基因的表达下调有关.     

蛋白磷酸酶2A在三氧化二砷诱导NB4、MR2细胞株凋亡过程中的变化

本研究探讨三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）诱导NB4、MR2细胞凋亡过程中蛋白磷酸酶2A（PP2A）活性与表达的变化．不同浓度ATO单用或与冈田酸（OKA）联合作用于NB4、MR2细胞，然后采用MTT法测定药物对细胞增殖的影响，用瑞氏染色法观察细胞形态学变化，流式细胞术测定细胞凋亡率，丝／苏氨酸磷酸化酶检测试剂盒分析药物对细胞内PP2A活性的影响，Western blot检测细胞内PP2A各亚基表达。结果表明：蛋白磷酸酶抑制剂OKA能明显增强ATO对NB4、MR2细胞的增殖抑制；OKA能促进ATO诱导的NB4、MR2细胞凋亡；ATO诱导NB4、MR2细胞凋亡过程中PP2A活性均下降，且随ATO浓度的增加PP2A活性下降越明显；与OKA连用后PP2A活性下降更加明显；在ATO诱导NB4、MR2细胞凋亡过程中，PP2A／A表达较对照组均明显减少，而B和C亚基表达与对照组比较变化不明显。结论：在ATO诱导的NB4、MR2细胞凋亡过程中，细胞内PP2A／A表达减少，PP2A活性降低．且随ATO浓度增加PP2A活性下降越明显，抑制PP2A活性有助于ATO诱导的NB4、MR2细胞凋亡，     

氧化砷对白血病细胞内PML／PML—RARa蛋白的影响

探讨急性早幼粒细胞白血病的分子标志ＰＭＬ－ＲＡＲａ在氧化砷诱导的细胞凋亡中的可能作用。观察Ａｓ２Ｏ３对ＰＭＬ－ＲＡＲａ蛋白在亚细胞定位的影响。结论Ａｓ２Ｏ３诱导细胞凋亡的过程不依赖维甲酸信号途径，可能通过ＰＭＬ／ＰＭＬ－ＲＡＲａ及其它相关基因或蛋白的主财控来实现。     

三氧化二砷对HL-60细胞及NB4细胞端粒酶活性的调节

目的 了解三氧化二砷（Ａｓ２Ｏ３）对ＨＬ－６０细胞及ＮＢ４细胞端粒酶活性的调节作用。方法 利用透射电镜、流式细胞仪、半定量端粒重复扩增、－银染色等手段,检测细胞的分化、凋亡,ｂｃｌ－２表达及端粒酶活性。结果 低浓度Ａｓ２Ｏ３对ＨＬ－６０及ＮＢ４细胞的诱导分化作用不及全反式维甲酸（ＡＴＲＡ）,但对其端粒酶活性的下调作用却比ＡＴＲＡ强烈和迅速。较高浓度Ａｓ２Ｏ３在有效诱导两种细胞凋亡过程中,伴随粒酶活     

酪氨酸激酶和磷酸酶及蛋白激酶C在As2O3调控NB4细胞和皮层神经元凋亡中的作用

目的　研究蛋白酪氨酸激酶和蛋白酪氨酸磷酸酶及蛋白激酶C(PKC)在三氧化二砷 (As2O3 )调控白血病细胞和人脑皮层神经元凋亡中的作用 ,观察As2 O3 对人脑皮层神经元和白血病细胞的胞浆游离钙 ([Ca2 ]i)浓度的影响。方法　用Fluo 3/AM荧光探针标记人白血病细胞和人脑皮层神经元[Ca2 ]i,激光共聚焦显微镜实时测定不同浓度As2 O3 干预后 [Ca2 ]i的变化并观察蛋白酪氨酸激酶和磷酸酶抑制剂对 [Ca2 ]i变化的影响。磷基转移法测定细胞膜和胞浆的PKC活性。琼脂糖凝胶电泳法观察细胞DNA的片段化。结果　 1μmol /L的As2 O3 使NB4细胞的 [Ca2 ]i明显增高 ,而对人脑皮层神经元 [Ca2 ]i影响不明显。 2 μmol /L以上的As2 O3 引起两种细胞 [Ca2 ]i增高 ,此作用被磷酸酶抑制剂钒酸盐呈浓度依赖性促进 ,被蛋白酪氨酸激酶抑制剂金雀异黄素呈浓度依赖性抑制 ,2 ,5 ,10μmol/L钒酸盐作用 2 4 0s时NB4细胞的 [Ca2 ]i总增加率分别为 (6 .5± 2 .3) % ,(2 1.7± 2 .1) %和 (4 9.2± 2 .5 ) % ;人脑皮层神经元为 (6 .7± 2 .1) % ,(19.4± 2 .5 ) %和 (5 2 .3± 2 .7) % ;2 ,5 ,10 μmol/L金雀异黄素作用 2 4 0s时NB4细胞的总抑制率分别为 (6 .7± 2 .9) % ,(2 5 .6± 2 .5 ) %和 (5 2 .2± 3.5 ) % ;人脑皮层     

天花粉蛋白诱导NB4人白血病细胞凋亡研究

为了研究单链核糖体失活蛋白天花粉蛋白(trichosanthin，TCS)诱导人类白血病细胞株NIM细胞的凋亡及增长抑制的影响，采用流式细胞术分析NB4细胞经TCS诱导后细胞膜联蛋白V(annexin V)表达及线粒体膜电位(△ψm)的改变：用MTT比色法测定TCS对NB4细胞的增长抑制率，用琼脂糖凝胶电泳做细胞凋亡DNA分析。结果表明：小TCS对NB4细胞具有明显的增长抑制作用，并随TCS浓度的升高及作用时间的延长，抑制现象愈加显著；②NB4细胞经TCS诱导后，annexin V呈阳性表达，随作用时间延长阳性率进一步升高；③线粒体△ψm随着凋亡细胞的增加而逐渐降低；④DNA电泳呈梯状条带，表明TCS对NB4细胞确实存在诱导凋亡作用。结论：天花粉蛋白在体外能够明显抑制NB4细胞的增长，并诱导细胞凋亡，为今后TCS应用于急性早幼粒白血病的临床治疗提供重要的实验依据。     

氧化砷诱导早幼粒细胞白血病细胞凋亡及其分子机制的初步研究

目的：了解氧化砷（Ａｓ２Ｏ３）治疗急性早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ）的细胞和分子机制。方法：以早幼粒细胞白血病细胞株ＮＢ４细胞等为研究对象，利用流式细胞仪，ＤＮＡ电泳，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ、Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹，免疫组化等手段，观察Ａｓ２Ｏ３对ＡＰＬ的作用。结果：Ａｓ２Ｏ３能显著诱导ＮＢ４细胞凋亡，而不影响ＨＬ－６０和Ｕ９３７的生长和存活。氧化砷能有效降低ＮＢ４细胞中ｂｃｌ－２基因的表达，而对其它几种凋亡相关基因（包括ｐ５３、ｃ－ｍｙｃ、ｂａｘ和ｂｃｌ－ＸＬ）的ｍＲＮＡ水平无影响。结论：这可能是Ａｓ２Ｏ３诱导ＮＢ４细胞凋亡的分子机制之一。     

硝普钠诱导K562细胞凋亡机制的研究

为了研究外源性一氧化氮供体硝普钠诱导K562细胞凋亡机制,将不同浓度的硝普钠与K562细胞在体外培养,同时设高铁氰化钾（PFC）对照组和空白对照.用Annexin-V/PI双标记、DNA片段原位末端标记法、DNA凝胶电泳、DNA含量及细胞周期分析等方法检测细胞凋亡;用Rh123/PI测定线粒体跨膜电位（△ψm）;以双氢罗丹明123（dihydrorhodamin123,DRH）和2′,7′-二氯双氢荧光素二乙酸酯（2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA）为荧光探针,测定线粒体内和细胞胞质内过氧化物;用流式细胞术测定线粒体膜蛋白和bcl-2、bax、bad、p53和Fas凋亡调控基因蛋白.结果表明：K562细胞经硝普钠作用后出现典型的细胞形态改变,DNA片段化,亚G1峰检出并显著增加,annexin-V/PI和DNA片段原位末端标记表达增加,这些结果均证实NO能诱导K562细胞凋亡,大部分细胞阻滞于G0/G1期.硝普钠诱导K562细胞凋亡过程中,胞质和线粒体内活性氧自由基增加,线粒体跨膜电位降低,bcl-2基因蛋白表达下调,同时bax、bad、p53、Fas和线粒体膜蛋白表达均上调.结论：NO诱导k562细胞凋亡是通过产生活性氧自由基,使p53基因表达增加,下调bcl-2基因和使bax、bad基因表达上调,线粒体膜通渗性转运孔开放,△ψm降低来实现的,此外还存在Fas系统激活途径.