GRP78在HepG2细胞的亚细胞定位及真核表达

目的 构建GRP78的真核表达载体以检测GRP78在HEK293细胞中的表达和定位.方法采用激光共聚焦显微镜观察GILP78在HepG2细胞中的定位,用RT-PCR方法从HepG2细胞中扩增GRP78 cDNA序列,构建真核表达载体peDNA3.1-GRP78,转染HEK293细胞,分别用Western blotting和激光共聚焦显微镜检测GRP78在HEK293细胞中的表达和定位.结果 GRP78在HepG2细胞的胞膜和胞质均有表达,GRP78在细胞膜上均匀分布.双酶切鉴定和核酸序列分析证实pcDNA3.1-GRP78真核表达质粒构建成功,该表达质粒转染HEK293细胞后可以瞬时表达GRP78蛋白.结论 正常状态下,GRP78在HepG2细胞胞膜和胞质均有表达.pcDNA3.1-GRP78转染HEK293细胞后能瞬时表达GRP78蛋白,为进一步研究GRP78的功能提供了重要工具.     

人转化铁受体基因的克隆和表达

目的探讨人转化铁受体基因（hTfR）克隆和高效表达的方法及临床意义。方法用RT-PCR法从人胚肝、肺组织中克隆hTfR基因，构建重组表达质粒pcDNA3-hTfR和pEGFP-C1-hTfR，转染人胚肾上皮HEK293细胞。用Western印迹法检测pcDNA3-hTfR转染HEK293细胞后hTfR蛋白的表达情况；用荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜观察重组pEGFP-C1-hTfR质粒转染HEK293细胞后hTfR蛋白的表达水平及亚细胞定位。结果经过DNA测序证实，克隆的hTfR基因为全长cDNA序列（2332bp）。Western印迹法检测到转染细胞能有效表达190×10^3的hTfR蛋白，荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白（GFP）-hTfR融合蛋白主要定位于细胞膜。结论从人胚肝、肺组织中可以成功克隆hTfR基因，该基因转染HEK293细胞后可获得hTfR蛋白的高效表达。hTfR主要定位于细胞膜。     

红色荧光-VEGF165融合蛋白载体在细胞内的定位和表达

目的 构建在哺乳动物细胞中表达人VEGF165(hVEGF165)红色荧光蛋白(RFP)的融合表达载体。方法 根据已知的人VEGF165序列,用PCR方法,从质粒pUC18／VEGF165中扩增出去除终止密码子的VEGF165片段,定向克隆至pDsRed1-N1质粒中。重组质粒经限制性内切酶和DNA序列测定鉴定。以DOTAP为介导,将pDsVEGF165Red1-N1转染293-T细胞,48小时后用RT-PCR、激光共聚焦显微镜检测VEGF165在细胞内表达和分布情况。结果 重组的融合蛋白表达载体经酶切、PCR和DNA序列测定证明构建正确,并在293-T细胞中表达。报告基因-红色荧光蛋白在细胞质、细胞核中都有一定的分布。结论 成功构建了pDsVEGF165Red1-N1红色荧光蛋白融合表达载体,该载体能在哺乳动物细胞中表达,为研究VEGF的细胞内定位提供了一个重要而方便的工具。     

丙型肝炎病毒核心蛋白不同区段在HEK293T细胞内的定位

目的：为进一步探讨HCV核心蛋白致癌机制，观察了HCV核心蛋白不同区段在HEK293T细胞内的定位情况。方法：构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和不同长度核心蛋白区段融合表达的pEGFP-C1系列重组载体，对HEK293T细胞进行瞬时转染，并在激光扫描共聚焦显微镜下观察核心蛋白不同区段在细胞内的定位。结果：全长核心蛋白定位于细胞质；核心蛋白1-59aa区段完全定位于细胞核；50～140aa区段和1-140aa区段在细胞核和细胞质中均存在；130～191aa区段完全存在于细胞质中。结论：核心蛋白不同区段在细胞内的定位不同，将导致其参与细胞调节的途径和功能的不同。     

BALB/c小鼠I-Adαβ链和恒定链Ii在COS-7中的共定位

目的：研究BALB／c小鼠I-A^d αβ链和恒定链Ii分子p41在COS-7／细胞中的定位，探索抗原提呈的分子规律。方法：构建了带有红色荧光蛋白标签的I-A^d αβ链真核双顺反子表达载体pRed-IRES-I-A^d和带有绿色荧光蛋白标签的恒定链真核表达载体pEGFP—Ii，使用Lipofectamine 2000转染COS-7细胞，用激光共聚焦显微镜观察2个外源蛋白在细胞中的共定位。结果：I-A^d αβ分子在COS-7细胞中能够形成聚集状态，并且和Ii链共同定位于细胞的内膜系统。结论：小鼠mIip41能够和I-A^d αβ分子在COS-7细胞中形成聚集体结构，mlip41分子的导向肽并不具有选择性导向作用，聚集体向细胞膜表面的移动很可能是通过胞吐的方式进行。     

乙型肝炎病毒e抗原在肝细胞内作用蛋白AK026018亚细胞定位的研究

目的：确定肝细胞内乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)作用蛋白AK026018的亚细胞定位，初步研究该蛋白的生物学功能。方法：应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术，从HepG2细胞中扩增编码AK026018蛋白的全基因，构建真核表达载体pEGFP-AK，转染HepG2、293T细胞系，在激光共聚焦荧光显微镜下与转染空载体pEGFP-N1的细胞比较观察。结果：经限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定构建的重组表达载体正确。通过激光共聚焦荧光显微镜观察，转染了重组栽体pEGFP-AK的细胞绿色荧光信号较集中分布于胞浆中。而空载体pEGFP-N1转染的细胞绿色荧光信号在整个细胞中均匀分布。结论：成功分离了AK026018全基因序列并构建了真核表达载体，该基因表达产物亚细胞定位于细胞浆中。     

红色荧光-VEGF_(165)融合蛋白载体在细胞内的定位和表达

目的　构建在哺乳动物细胞中表达人VEGF1 65(hVEGF1 65)红色荧光蛋白 (RFP)的融合表达载体。方法　根据已知的人VEGF1 65序列 ,用PCR方法 ,从质粒pUC1 8/VEGF1 65中扩增出去除终止密码子的VEGF1 65片段 ,定向克隆至pDsRed1 N1质粒中。重组质粒经限制性内切酶和DNA序列测定鉴定。以DOTAP为介导 ,将pDsVEGF1 65Red1 N1转染 2 93 T细胞 ,4 8小时后用RT PCR、激光共聚焦显微镜检测VEGF1 65在细胞内表达和分布情况。结果　重组的融合蛋白表达载体经酶切、PCR和DNA序列测定证明构建正确 ,并在2 93 T细胞中表达。报告基因 -红色荧光蛋白在细胞质、细胞核中都有一定的分布。结论　成功构建了pDsVEGF1 65Red1 N1红色荧光蛋白融合表达载体 ,该载体能在哺乳动物细胞中表达 ,为研究VEGF的细胞内定位提供了一个重要而方便的工具     

人MCHR2基因shRNA真核表达载体构建及鉴定

目的 构建针对人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)的shRNA真核表达载体,并在人胚肾293(HEK293)细胞中观察其对MCHR2基因表达的影响.方法 根据MCHR2基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,并将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定.用脂质体将重组质粒转染到HEK293细胞中,观察其在mRNA和蛋白水平对MCHR2的影响.结果 通过酶切鉴定和序列测定,成功构建四条表达短发夹RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到HEK293细胞株中.四条shRNA真核表达载体在mRNA水平对MCHR2抑制率分别为54.9%、66.4%、56.9%、45.8%;在蛋白水平对MCHR2抑制率分别为62.0%、81.0%、73.3%、44.2%.结论 针对人MCHR2的shRNA真核表达载体成功构建及鉴定为进一步研究MCHR2功能奠定了良好的基础.     

携带绿色荧光蛋白的可诱导性真核表达载体的构建及其表达

目的　构建携带绿色荧光蛋白 (GFP)的可诱导性真核表达载体。方法　将GFPcDNA片段克隆到可诱导性真核表达载体pMD neo上 ,构建成携带绿色荧光蛋白的可诱导性真核表达载体pMD GFP ;再采用脂质体转染法 ,将GFP基因转入HCC 92 0 4细胞中 ,用荧光显微镜观察其表达情况。结果　成功构建了携带绿色荧光蛋白的可诱导性真核表达载体pMD GFP ;荧光显微镜观察显示 ,在转染GFP基因的HCC 92 0 4 /GFP细胞中 ,荧光均匀地分布于整个细胞。结论　携带绿色荧光蛋白的可诱导性真核表达载体的构建 ,为进一步观察活体内肿瘤的生长和转移提供了基础。     

真核表达东方马脑炎病毒衣壳蛋白Capsid抑制IFNγ应答基因转录

目的克隆东方马脑炎病毒（EEEV）衣壳蛋白（Capsid）基因,构建其真核表达载体,检测该基因在293细胞中的表达,并初步研究其对干扰素（IFN）应答基因表达的影响。方法构建包含EEEV capsid基因的真核表达载体pcDNA3-Flag-capsid,以威格拉斯脂质体转染293细胞进行瞬时表达,Western印迹检测其表达情况;应用定量PCR比较IFN效应基因Gbp1,Gbp2和Isg15在pcDNA3-Flag-capsid和空载体转染细胞中mRNA表达差异。结果构建了EEEV Capsid真核表达质粒,并且该质粒能够在293细胞中有效表达,同时定量PCR结果表明,与空载体转染对照组相比,外源导入EEEV Capsid抑制IFN应答基因Gbp1,Gbp2和Isg15的转录。结论真核表达EEEVCapsid抑制细胞内IFN应答基因的表达,为研究EEEV致病机制奠定基础。     

具有多种剪接形式的RNA结合蛋白基因的克隆、表达及其细胞内定位

目的：构建具有多种剪接形式的RNA结合蛋白（RBPMS）基因的真核表达载体,并在真核细胞中进行表达,确定RBPMS在细胞中的定位.方法：采用PCR技术,从人卵巢文库中扩增RBPMS基因的完整编码序列,将所扩增基因克隆到带FLAG标签的真核表达载体上,转染人胚肾细胞293T,Western印迹鉴定RBPMS的表达.然后将所扩增基因克隆到带绿色荧光标签的pEGFP-C1表达载体上,转染乳癌细胞ZR75-1,观察RBPMS在细胞中的定位情况.结果：经限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定构建的重组表达载体正确,Western印迹实验证明RBPMS表达成功,通过激光共聚焦显微镜观察,RBPMS分布在胞质中,在40%～50%细胞中RBPMS呈聚集状分布.结论：成功构建了RBPMS基因的真核表达载体,该基因产物分布在胞质中,在40%～50%细胞中RBPMS呈聚集状分布.     

HT29细胞黏着斑激酶表达与其对5-氟尿嘧啶敏感性的关系研究

目的构建人结肠癌细胞株HT29的RNA干扰(RNAi)表达载体以抑制黏着斑激酶(FAK),检测FAK沉默后细胞对5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感性的变化。方法利用针对FAK基因的特异性寡核苷酸序列及对照序列构建重组体,酶切并测序鉴定,用脂质体2000转染细胞,G418筛选。采用RT-PCR和免疫组化检测干扰前后细胞内FAK的表达变化,MTT法检测细胞对5-FU敏感性的变化。结果酶切鉴定和测序证实插入序列完全正确。靶向FAK干扰后,免疫组化显示FAK蛋白表达显著降低,RT-PCR显示FAKmRNA的表达下调了76.94%,MTT显示HT29细胞对5-FU敏感性较其他组显著提高,IC50值明显下降(P<0.05)。结论成功构建靶向FAK的RNAi载体并有效抑制了FAK的表达,后者显著提高了HT29细胞对5-FU的敏感性,为寻求新的基因治疗方法提供了可能。     

逼尿肌不稳定中缝隙连接蛋白Cx43表达定位分析及其意义

目的：观察膀胱出口梗阻（BOO）后逼尿肌不稳定（DI）中缝隙连接蛋白Cx43定位表达。方法：通过改良的不全结扎大鼠膀胱颈部和/或近端尿道的方法,建立BOO后引起DI的动物模型,根据尿动力学检查结果分为DI组和正常对照组,采用间接免疫荧光染色方法,LSCM下观察Cx43抗原表达及定位情况。结果：荧光标记染色膀胱逼尿肌细胞呈单层贴壁生长,Cx43在DI组中呈现较强的FITC绿色荧光,大量强阳性反应产物主要密集分布于细胞膜上。结论：功能性缝隙连接通道在DI发生中有重要作用。     

外源性WAF1-S基因表达对喉癌细胞生长的作用

目的 探索WA1F-S基因在喉癌细胞内表达的作用,为喉癌的基因治疗提供理论依据。方法 采用亚克隆技术,构建WAF1-S真核表达载体pcDNA3-WAF1-S。利用lipofectamine介导,将外源野生型WAF1-S基因导入喉癌细胞系Hep-2,筛选阳性克隆,采用打点杂交技术观察WAF1-S基因mRNA在喉癌细胞中的表达,用Western blot及激光共聚焦方法定量分析WAF1-S基因的蛋白表达产物,MTT及流式细胞仪检测Hep-2细胞的生长状态。同时以空载体质粒pcDNA3为对照,分析WAF1基因对喉癌细胞生长的影响。结果 打点杂交证实转染WAF1-S基因的Hep-2细胞有外源WAF1-S基因的表达,外源基因WAF1-S在Hep-2细胞系中的表达能抑制Hep-2细胞系的生长。转染后喉癌细胞中WAF1-S的蛋白表达明显高于对照组。流式细胞仪计数证实WAF1-S能诱导喉癌细胞系Hep-2发生凋亡并导致其发生G1期阻滞。结论 导入外源野生型WAF1-S基因可抑制喉癌细胞生长。     

利用PCR方法获得shRNA抑制内外源性基因的表达

目的探讨PCR法获得的shRNA对外源性基因和内源性基因表达的抑制效果。方法选择绿色荧光蛋白(GFP)和大鼠肾脏系膜细胞高丰度表达的纤维连接蛋白(FN)分别作为外源性和内源性基因的靶基因,设计特异性引物,利用PCR扩增获得shGFPRNA和shFNRNA。前者与pEGFP质粒共转染至293T细胞,48h后进行激光共聚焦检测细胞表达GFP阳性率;后者转染至大鼠系膜细胞(RMC)中,48h后提取总RNA逆转录成cDNA,经realtimeRTPCR检测FN的mRNA表达水平,提取细胞总蛋白进行Westernblot检测FN蛋白表达水平。结果PCR获得的shGFPRNA产物能有效抑制外源性基因GFP的表达,抑制效率可达70%±3.2%;shRNA转染组内源性基因FN的表达水平明显下降,与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。结论PCR方法可快速简单、廉价地获得shRNA,对内源性或外源性基因进行特异性抑制。     

Quantitative measurements obtained by micro-computed tomography and confocal laser scanning microscopy

OBJECTIVES: To compare measurements obtained by micro-CT with those obtained by confocal laser scanning microscope in simulative internal resorption cavities. METHODS: An extracted human maxillary central incisor tooth was divided into two in the coronal plane. Four artificial internal resorption cavities were prepared with standardized burs on each section, and diameters and volumes were measured using a laser scanning electron confocal microscope and a desktop cone beam micro-CT-40. Differences between means of quantitative measurements for both methods were tested using the paired t-test; the correlation between quantitative measurements was tested by regression analysis. RESULTS: Mean diameter and volume differences between the two methods were 0.061 mm and 0.004 mm(3), respectively. Average diameter and volume calculations obtained by micro-CT were significantly lower (P < 0.001 for diameter and P < 0.01 for volume). A significantly strong relationship was found in the average diameters (R(2) = 92.9%) and calculated volumes (R(2) = 91%), (P < 0.001). CONCLUSIONS: Although a strong correlation between both methods was found, micro-CT significantly underestimated the diameters and volumes.     

不同负荷运动对大鼠心肌促血管内皮生长因子表达的影响

目的 :观察并探讨不同运动负荷对大鼠心肌VEGF表达及组织学的影响。方法 :5 4雄性SD大鼠 ,随机分为对照组、中等负荷运动组和大负荷运动组 ,进行游泳训练 ,各运动组又分为训练1周 ,训练 3周和训练 5周 3个亚组 ,每组 6只。训练过程中对各组一般情况进行观察和统计。实验组和对照组同期处死 ,取左心室室前壁心肌组织块切片进行HE染色 ,VEGF表达染色 ,组织化学SDH、LDH和AKP ,5’ -N染色 ,并进行电镜观察和图像分析。结果 :对照组中 3周组和 5周组体重增长明显 (P <0 . 0 1 ) ;中等负荷运动组一般情况基本正常 ,3周组和 5周组体重出现下降 (P <0 . 0 5 ) ;大负荷运动组一般情况较差 ,3周组和 5周组体重较 1周组显著下降 (P <0 . 0 5 )。HE染色可见 ,中等负荷训练 3周组和 5周组心肌毛细血管有增多、增粗的趋势 ,大负荷运动 3周组和 5周组心肌细胞核周隙增宽、组织水肿、心肌细胞浊肿。图像分析结果显示 ,与同期对照组比较 ,中等负荷训练 1周组、3周组和 5周组VEGF着色深度 (平均灰度差 )、面积比均有不同程度增加 (P <0 . 0 1 ,P<0 . 0 5 ) ;而大负荷训练组 3周组和 5周组明显降低 (P <0 . 0 5 ,P <0 . 0 1 ) ,且染色分布不均 ,部分区域不着色。酶组织化学和电镜结果显示 ,持续大负荷训练对心肌线粒     

Near real-time confocal microscopy of amelanotic tissue: detection of dysplasia in ex vivo cervical tissue

RATIONALE AND OBJECTIVES: The authors performed this study to determine whether images of ex vivo tissue obtained with a near real-time confocal microscope can be used to differentiate between normal and dysplastic tissue. MATERIALS AND METHODS: Biopsy specimens of colposcopically normal and abnormal cervical tissue were obtained from 19 patients and imaged at various depths with a confocal microscope. Nuclear morphologic features were extracted from the confocal images; in addition, a group of reviewers examined the images and attempted to identify whether the specimen contained high-grade dysplasia. Results of both analyses were compared with the histopathologic findings of the same specimens provided by a board-certified pathologist with expertise in gynecologic pathology. RESULTS: The morphologic feature measurements compared well with the findings at pathologic examination. The use of the nuclear-cytoplasmic ratio to determine the presence of dysplasia resulted in a sensitivity of 100% and a specificity of 91%. The untrained reviewers had an average sensitivity of 95% and an average specificity of 69% in the determination of dysplasia. CONCLUSION: The results indicate the clinical potential of in vivo confocal imaging in the detection of dysplasia.     

直接接触共培养技术在体外探索细胞间相互作用的应用研究

目的:建立观察直接接触共培养体系中单一种类细胞生长变化的研究方法,探索直接接触共培养技术在体外细胞之间相互作用研究中的应用。方法:大鼠软骨细胞与荧光标记的大鼠骨髓间充质干细胞以1∶2的比例平面共培养7天。共培养2天时,应用共聚焦显微镜观测共培养体系中两种细胞的增殖情况;共培养7天时,应用流式分选技术分选出单一种类细胞,然后分析其成软骨分化特异性基因的表达。结果:经过共培养后,骨髓间充质干细胞比例减少;共培养组中软骨细胞增殖率高于单独培养组;在共培养体系中骨髓间充质干细胞的成软骨分化趋势明显,但软骨细胞成软骨分化特异性基因表达下降。结论:本实验应用流式细胞术以及共聚焦显微镜技术成功检测了直接接触共培养体系中骨髓间充质干细胞和软骨细胞各自的细胞增殖与成软骨分化特异性基因的表达,明确了直接接触共培养技术可以有效地应用于体外细胞间相互作用的研究。