人血小板衍生生长因子B链成熟肽基因克隆及表达

目的 获得足量的PDGF-BB蛋白,作为PDGF-BB促进骨折愈合及创伤修复等进一步功能研究和临床应用的基础。方法 用基因重组技术构建pQE-PDGF-B原核表达载体,在M15大肠杆菌中进行PDGF-B单体蛋白的表达。结果 经酶切鉴定、PCR鉴定及基因测序证明,pQE30载体上成功地插入了PDGF-B成熟肽基因;重组表达载体pQE-PDGF-B在M15大肠杆菌中得到了高效表达,表达量约占全菌蛋白的15％,表达的PDGF-B单体蛋白经SDS PAGE电泳,显示了一条特异蛋白带,分子量为15kD左右。结论 PDGF-B原核表达载体的成功构建和PDGF-B单体蛋白制备纯化为生产活性PDGF-BB蛋白及其进一步功能研究奠定了基础。     

人arresten基因的克隆表达及其对内皮细胞增殖的影响

目的克隆表达血管生成抑制因子arresten基因，并探讨其生物学活性。方法利用基因重组技术，从含有人arresten基因的克隆载体pGEMArr上切下目的基因片段，亚克隆至含T7启动子的原核表达载体pRSET中，构建表达载体pRSETAN。将重组质粒pRSETAN转化入宿主菌E.coli BL21(DE3)中，用IPTG进行诱导表达。菌体经超声波破碎，镍柱亲和层析纯化并复性。采用噻唑蓝(MTT)比色法测定表达蛋白抑制血管内皮细胞的活性。结果酶切鉴定和测序验证，表达载体构建正确。在表达宿主菌中，arresten基因获得了高效表达，表达量占菌体总蛋白质的27％；表达产物经亲和层析纯化后，蛋白质纯度达96％。经复性，重组蛋白可显著抑制血管内皮细胞生长因子促脐静脉内皮细胞的增殖作用。结论人arresten基因能在pRSET表达系统中得到高效表达；复性后表达蛋白能有效抑制血管内皮细胞的增殖。     

人成骨蛋白-1成熟肽在大肠杆菌中的克隆、表达和诱骨活性测定

目的：扩增、克隆人成骨蛋白-1(human osteogenie protein-1，hOP-1)成熟肽eDNA基因，并利用大肠杆菌表达hOP-1成熟肽。方法：PCR扩增hOP-1成熟肽cDNA基因，将其克隆入受控于含有PR；PE启动子的温控型人肠杆菌表达载体pDH，构建成的重组质粒pDOPm以大肠杆菌DH5α为宿主菌进行温度诱导表达，表达产物纯化和复性后，以小鼠肌袋模型检测诱骨活性．结果：扩增得到hOP-1成熟肽基因；含重组质粒pDOPm的工程菌经42℃诱导后在SDS-PAGE上出现一条新蛋白条带，分了量约为16ku，表达量占菌体总蛋白的21％，以包涵体形式存在，经纯化和复性处理，得到纯度高于85%、具有良好的异位诱导成骨活性的hOP-1成熟肽。结论：成功克隆出hOP-1成熟肽基因，并在大肠杆菌中得到高效表达，复性后具有诱骨活性。     

人精子表面蛋白P34H重组表达载体的构建及诱导表达

目的 :获得纯化的人精子表面蛋白P34H用于基础和临床研究。　方法 :在克隆到P34H基因编码区全长的基础上 ,将P34H基因亚克隆至原核表达载体pQE 30中 ,构建重组表达载体pQE 30 /P34H。将pQE 30 /P34H转化至大肠埃希菌后 ,用异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达 ,通过Ni NTA树脂进行亲和层析纯化上清中可溶性形式的重组蛋白P34H。对表达纯化重组蛋白的质粒进行DNA测序 ,并对重组蛋白P34H行十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析 ,鉴定其是否为所需目的蛋白。　结果 :经PCR和双酶切鉴定 ,重组表达载体pQE 30 /P34H为正确克隆。SDS PAGE和DNA测序证实 ,所获的重组蛋白确系所需目的蛋白。　结论 :用上述原核表达的方法可获得纯化的人精子表面蛋白P34H。     

DOC-1基因的原核表达载体构建及其重组蛋白的表达纯化

目的：克隆DOC-1基因、构建原核表达载体并纯化出其重组蛋白。方法：从人胎脑组织中提取总RNA，经逆转录一聚合酶链式反应（RT—PCR）扩增DOC-1的CDS序列，再通过基因重组技术将该基因片段依次克隆到pMO18-T和pGEX-4T-1载体中，构建融合表达载体pGEX-4T-1-DOC-1，经酶切、测序鉴定后，用该重组质粒转化E．coliBL21，用IPTG诱导表达，Glutathlone Sepharose 4B柱亲和层析纯化重组蛋白。结果：电泳证实RT-PCR扩增产物与预期目的基因DOC-1长度一致，测序结果与GenBank公布的DOC-1基因序列完全一致，IPTG诱导后经SDS—PAGE电泳分析表明，在相对分子质量38000左右出现新的蛋白表达条带，经亲和层析柱纯化后得到高纯度的GST-p12重组蛋白。结论：成功构建了pGEX-4T-1-DOC-1原核表达载体，表达并纯化出GST-p12重组蛋白，为进一步研究p12^DOC-1蛋白打下了实验基础。     

人成骨蛋白-1成熟肽在大肠杆菌中的克隆、表达和诱骨活性测定

目的:扩增、克隆人成骨蛋白-1(human osteogenic protein-1,hOP-1)成熟肽cDNA基因,并利用大肠杆菌表达hOP-1成熟肽.方法:PCR扩增hOP-1成熟肽cDNA基因,将其克隆入受控于含有PRPL启动子的温控型大肠杆菌表达载体pDH,构建成的重组质粒pDOPm以大肠杆菌DH5α为宿主菌进行温度诱导表达,表达产物纯化和复性后,以小鼠肌袋模型检测诱骨活性.结果:扩增得到hOP-1成熟肽基因;含重组质粒pDOPm的工程菌经42℃诱导后在SDS-PAGE上出现一条新蛋白条带,分子量约为16ku,表达量占菌体总蛋白的21%,以包涵体形式存在,经纯化和复性处理,得到纯度高于85%、具有良好异位诱导成骨活性的hOP-1成熟肽.结论:成功克隆出hOP-1成熟肽基因,并在大肠杆菌中得到高效表达,复性后具有诱骨活性.     

荧光素酶编码基因luc在大肠杆菌中的克隆、表达及纯化

以荧光虫荧光素酶报告载体pXP2 DNA为模板,扩增得到编码萤火虫荧光素酶(LUC)的基因(luc),构建了诱导型表达载体pQE30-luc.将载体导入 E.coli M15获得高效诱导表达萤火虫荧光素酶基因的重组菌M15/pQE30-luc.SDS-PAGE电泳分析显示:重组蛋白的相对分子质量为 60 000 ,表达量占全菌胞内可溶性蛋白质的50.9 %. 利用表达载体pQE30上的His*Tag标记选用Ni柱纯化表达具有活性的萤火虫荧光素酶(LUC),纯化后比酶活达到1.43×10 9 RFU/ mg,纯化倍数达10.6倍,回收率为25.3%.     

真核表达载体 pcDNA3.1-h转化生长因子-β1的构建

目的：为研究软骨细胞基因转染的可行性创造条件,从而为基因修饰的软骨组织工程研究奠定基础。方法：应用基因重组技术和限制性内切酶酶切构建并鉴定pcDNA3.1-TGF-β1真核表达载体,经Fugene6介导质粒转染3T3细胞后应用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测hTGF-β1 mRNA在真核细胞中的表达。结果：重组真核表达载体pcDNA3.1-TGF-β1经限制性内切酶Xho I和Hind Ⅲ酶切,电泳后显示1．35kb的hTGF-β1目的片段和5．40kb的pcDNA3.1载体片段,证明重组质粒连接正确;经RT－PCR检测了hTGF-β1在转录水平mRNA的表达情况,表明质粒转染3T3细胞后hTGF-β1mRNA的表达明显增强。结论：重组真核表达载体构建正确,并能在真核细胞3T3中表达hTGF-β1 mRNA,为其在软骨组织工程中的基因转染奠定了基础。     

pET14b-His-TAT-ERK2和无活性突变体pET14b-His-TAT-ERK2(AF)原核表达载体的构建和表达

目的：构建基于转录激活因子（TAT）技术的细胞外信号调节激酶（ERK）2及其无活性突变体ERK2（AF）原核载体并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。方法：采用聚合酶链式反应（PCR）技术从pcDNA3-Flag-ERK2和pcDNA3-Flag-ERK2（AF）质粒中扩增出ERK2和ERK2（AF）基因,插入pET14b-His-TAT载体中,构建重组质粒pET14b-His-TAT-ERK2和pET14b-His-TAT-ERK2（AF）,并诱导原核表达、纯化融合蛋白。采用Western blot方法检测表达蛋白的His标签。结果：酶切和测序结果表明,扩增的ERK2和ERK2（AF）基因正确,大小为1082bp;10%SDS-PAGE凝胶电泳可见原核表达纯化得到高纯度目的蛋白,大小为41 kD;Western blot检测显示,原核蛋白带有His标签。结论：成功构建了ERK2和ERK2（AF）的原核表达载体,该载体能在大肠杆菌中表达,纯化得到了His-TAT-ERK2和His-TAT-ERK2（AF）蛋白,为研究ERK2蛋白的功能提供了重要工具。     

人B7-1基因与GPI信号肽序列融和基因的原核表达载体的构建及表达

目的 构建GPI锚定蛋白基因与B7-1分子融合的原核高效表达载体(GPI-B7-1),观察融合蛋白的抗肿瘤效应.方法 分别从新鲜胎盘和ConA刺激的外周血单核细胞中克隆人胎盘碱性磷酸酶(hPLAP-1)C末端信号肽序列(GPI)和CD80(B7-1)基因.利用PCR技术将GPI和B7-1胞外编码区基因进行融合,并将融合基因亚克隆入原核表达载体(pET-30a)中.重组载体pET-30a-GPI-B7-1转化表达菌株E.coli BL,纯化GPI-B7-1融合蛋白,SDS-PAGE、Western blot分析鉴定其免疫活性.结果 PCR和RT-PCR产物经电泳鉴定,在100～250 bp处可见到133 bp的GPI目的 条带.在750 bp左右可见到792 bp的B7-1胞外编码区基因目的 条带.重组载体pET-30a-GPI-B7-1经PCR检测获得900 bp左右的目的 片段,经EcoRⅠ、SAlⅠ双酶切鉴定,得到5000 bp和900 bp左右大小2个片段,实现了融合蛋白(GPI-B7-1)在大肠杆菌中的高效表达,在非变性条件下纯化该融合蛋白,SDS-PAGE分析显示,表达蛋白的分子量约为38 kDa,Western blotting证实38 kDa处出现一条特异的显色带,该融合蛋白即为目的 蛋白.结论 GPI-B7-1表达载体可在大肠杆菌中高效表达获取融合蛋白,为肿瘤免疫治疗奠定了基础.     

人骨形成蛋白-7成熟肽在大肠杆菌中的高效表达

目的：利用大肠杆菌高效表达人骨形成蛋白-7（human bone morphogenetic protein-7，hBMP-7）成熟肽。方法：将编码hBMP-7成熟肽cDNA的基因片段克隆入受控于PRPL启动子的温控型大肠杆菌表达载体pDH，构建成的重组质粒pDHB-7m以大肠杆菌DH5a为宿主菌进行温度诱导表达。结果：含重组质粒的工程菌经42℃诱导表达后在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上显现出一条新蛋白区带，分子量约为16ku，表达量占菌体总蛋白的20％～25％，以包涵体形式存在，经简单纯化处理，得到纯度高于80％的人骨形成蛋白-7成熟肽。结论：hBMP-7成熟肽在大肠杆菌中得到高效表达，为深入研究其生物学活性和临床应用奠定了基础。     

人Eppin基因的原核表达及抗原性鉴定

目的 构建人附睾蛋白酶抑制蛋白(epididymal protease inhibitor,eppin)基因原核表达质粒,表达并纯化重组蛋白,并探讨其抗原性及应用价值.方法 以健康人睾丸组织cDNA为模板进行PCR扩增,将其克隆到原核表达载体pET-32a,并转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化,并对纯化产物进行Western印迹鉴定.结果 重组质粒经双酶切分析和测序鉴定后证实构建成功;SDS-PAGE结果显示表达产物为相对分子质量36KD的融合蛋白,Western印迹检测纯化后蛋白显示特异性条带.结论 成功构建了pET-32a-Eppin重组质粒,并获得了具有抗原特异性的可溶性Eppin蛋白,为进一步研究其生物学活性及免疫性避孕效应奠定了基础.     

大鼠小肠转化生长因子β1重组腺病毒载体的构建和表达

目的构建可调控性大鼠小肠TGF-β1表达的重组腺病毒载体。方法按RNA提取试剂（TRIzol Reagent）说明书步骤从大鼠小肠组织抽提总RNA，克隆TGF-β1基因；经穿梭载体与可调控性腺病毒载体骨架连接，鉴定后在HEK293细胞包装。获得高滴度病毒后。取上清检测绿色荧光蛋白（GFP）的表达，观察目的基因的表达情况。结果扩增出与预期大小一致的cDNA片段，其中TGF-β1大小为1173bp；其基因序列与GenBank登录的大鼠TGF-β1基因序列完全一致。重组TGF-β1腺病毒获得的滴度约为10nPFU／ml；病毒包装后绿色荧光蛋白表达的检测结果显示，绿色荧光蛋白随着时间的延长，表达量逐渐增高；与预期结果一致。结论构建的可调控性大鼠小肠TGF-β1重组腺病毒载体得到了正确表达，为进一步研究TGF-β1干扰树突状细胞分化成熟诱导小肠移植免疫耐受提供了依据。     

骨形成蛋白-2和转化生长因子-β1双基因真核表达载体的构建

目的 构建骨形成蛋白(BMP)-2、转化牛长因子(TCF)-β1双基因真核表达载体.方法 以pGEM-T-BMP-2及pGEM-T-TGF-β1两个质粒为模板,分别用引入新的酶切位点引物,PCR扩增出长度为1188 bp的BMP-2和1 173 bp的TGF-β1两个目基因片段;将其分别定向连入真核双基因表达载体plRES;酶切分析及序列测定重组子.结果 双酶切分析电泳可见长度为1188bp的BMP-2条带和1 173 bo的TGF-β1条带,核酸序列测定证实重组质粒pIRES-BMP-2-TGF-β1构建正确.结论 成功构建了BMP-2及TGF-β1双基因真核表达载体.     

MGP基因的重组及在大肠杆菌中的表达

目的重组骨质疏松候选基因基质Gla蛋白（MGP）基因使其蛋白在大肠杆菌中高效表达。方法利用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）从正常人肺组织总RNA中扩增出MGP基因cDNA序列，与克隆pGEM—Teasy载体相连，测序为完整的编码序列后与表达载体pTrcHisB构建重组体，转化入大肠杆菌Top10后用IPTG诱导，Western bloting证实蛋白表达。结果克隆至pGEM-Teasy载体及pTreHisB载体中的MGP基因cDNA序列与基因库完全一致。转入大肠杆菌后经IPTG诱导有蛋白的表达，Western bloting证实诱导后2、3、4h蛋白的表达量显著增加。结论成功重组的人MGP基因，重组体在大肠杆菌内能成功高效地表达。IPTG诱导后蛋白的表达为时间依赖性。     

人生长激素基因的克隆、高效表达及纯化

目的 研究人生长激素(hGH)基因在原核中的高效表达、纯化及鉴定。方法 设计带双酶切位点引物,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得hGH cDNA片段,并亚克隆入pUC19质粒中进行 DNA序列测定。将 hGH cDNA片段克隆入原核表达载体 pBV220中进行表达。表达产物经 7mol/L 盐酸胍裂解变性、复性、层析等一系列纯化研究,纯化产物经SDS-PAGE电泳,高压液相色谱法(HPLC)纯度分析及活性测定,并通过N末端氨基酸序列测定鉴定表达产物。结果 RT-PCR扩增所得片段大小与预期值一致。pBV220-hGH表达产物经SDS-PAGE电泳显示,分子量为 22×10~3与预计结果相符。rhGH表达量占菌体总蛋白量的 40％。表达产物纯化后,纯度达 97％以上,比活性大于 3.0 IU/mg。纯化产物经 N末端 15个氨基酸测定验证,为重组人生长激素。结论 成功构建了 pBV220-hGH原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达,表达产物经纯化得到纯度≥97％的 rhGH,比活性大于 3.0 IU/mg。该研究为 rhGH的中试生产奠定了基础。     

马尔尼菲青霉菌溶血磷脂酶基因的克隆、表达及纯化

目的 研究马尔尼菲青霉菌(PM)溶血磷脂酶(LysoPLs)基因的克隆、表达和纯化,为研究其致病机制奠定基础.方法 采用生物信息学方法,从PM酵母相全长 cDNA 文库中识别出PMLysoPLs基因的同源序列及其全长编码区.通过PCR方法 扩增PMLysoPLs基因的编码区序列,构建原核表达载体pET 30a(+)-PMLysoPLs,经DNA 序列测定鉴定其序列,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,重组产物采用His-镍蛋白纯化柱进行纯化.结果 PMLysoPLs基因长度为991 bp,其全长编码序列长度为732 bp,编码243个氨基酸,其编码蛋白理论分子量为26.8 kDa.重组表达载体经序列测定及酶切鉴定与理论推测结果 相符.经IPTG诱导,该基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中得到高效的可溶性上清表达,纯化后的重组蛋白分子量为25~35 kDa,其单一蛋白纯度达95%以上.结论 本研究成功构建了PMLysoPLs基因的pET 30a(+)原核重组质粒,获得的可溶性重组蛋白表达效率高,可用于进一步研究PM溶血磷脂酶的功能.     

大鼠小肠转化生长因子β1重组腺病毒载体的构建和表达

目的 构建可调控性大鼠小肠TGF-β1表达的重组腺病毒载体.方法 按RNA提取试剂(TRIzol Reagent)说明书步骤从大鼠小肠组织抽提总RNA,克隆TGF-β1基因;经穿梭载体与可调控性腺病毒载体骨架连接,鉴定后在HEK293细胞包装.获得高滴度病毒后,取上清检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,观察目的 基因的表达情况.结果 扩增出与预期大小一致的cDNA片段,其中TGF-β1大小为1173 bp;其基因序列与GenBank登录的大鼠TGF-β1基因序列完全一致.重组TGF-β1腺病毒获得的滴度约为1012 PFU/ml;病毒包装后绿色荧光蛋白表达的检测结果显示,绿色荧光蛋白随着时间的延长,表达量逐渐增高;与预期结果一致.结论 构建的可调控性大鼠小肠TGF-β1重组腺病毒载体得到了正确表达,为进一步研究TGF-β1干扰树突状细胞分化成熟诱导小肠移植免疫耐受提供了依据.     

JC病毒Agnoprotein在大肠埃希菌中的表达及纯化

目的 构建JC病毒Agnoprotein基因的原核表达载体,表达纯化该蛋白.方法 PCR扩增患者脑脊液中JC病毒晚期调节蛋白Agnoprotein基因,测序正确后克隆入pET-32a(+)原核表达载体,诱导表达Agnoprotein蛋白并纯化.结果 pET-32a(+)-Agnoprotein表达出预期分子量大小的具有免疫活性的重组融合蛋白.结论 成功地表达纯化了Agnoprotein融合蛋白,为进一步研究其生物功能奠定了基础.     

国人瘦素基因原核重组表达载体的构建及鉴定

目的 构建并鉴定瘦素基因原核重组表达载体.方法 以RT-PER法自人脂肪组织制备目的 基因,应用DNA重组技术,克隆至pMD18T载体与pGEX-4T-1原核表达载体,转化大肠杆菌DH5α,EcoR I+Xho I双酶切及测序鉴定.结果 扩增得到520 bp目的 基因并构建原核重组表达载体pGEX-4T-1-leptin.双酶切电泳见520bp目的 条带,测序结果与GenBank收录序列一致.结论 成功构建原核表达载体pGEX-4T-1-leptin,为leptin功能研究及进一步的临床应用提供了条件.