脑源性神经营养因子基因修饰人骨髓间充质干细胞有限细胞系的建立

目的：建立脑源性神经营养因子基因修饰的人骨髓间充质干细胞系。方法：实验于2004—02／2005—06在解放军军事医学科学院干细胞研究中心完成。人类骨髓细胞来源于解放军三О七医院骨髓移植治疗的6名健康成年骨髓供者，男3名，女3名，年龄25-45岁。常规分离培养人骨髓间充质干细胞，流式细胞术检测骨髓间充质干细胞表面分子CD34、CD44、CD45，采用重组逆转录病毒载体将脑源性神经营养因子基因转入人骨髓间充质干细胞。检测脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞的增殖特性，细胞内脑源性神经营养因子的蛋白表达，细胞培养液中脑源性神经营养因子含量，以及PCR检测脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞中外源性脑源性神经营养因子基因DNA。结果：①人工分离培养出的骨髓间充质干细胞，形态、大小一致，呈长梭型或长多边形，从P0至P20基本保持一致，P2代骨髓间充质干细胞表达基质细胞表面标志CD44，不表达造血系细胞表面标志CD34、CD45。②反转录病毒感染骨髓间充质干细胞的感染效率约为10％，修饰后形成的脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞在形态上始终保持一致，与骨髓间充质干细胞几乎完全一样，生长速率与未经基因修饰的骨髓间充质干细胞基本相同，培养10代后细胞停止分裂，免疫细胞化学染色显示脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞的脑源性神经营养因子阳性率超过98％，培养72h后培养基中脑源性神经营养因子的含量较之骨髓间充质干细胞提高约20000倍。③PCR对脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞基因组DNA进行扩增，得到外源性脑源性神经营养因子条带。结论：利用反转录病毒载体进行基因修饰得到了稳定的脑源性神经营养因子基因修饰的人骨髓间充质干细胞有限细胞系，为基因治疗提供了一种以多潜能成体干细胞为载体的种子细胞。     

脑源性神经营养因子真核表达载体转染人脐带间充质干细胞

背景：干细胞移植是神经损伤修复领域的研究热点,目前多数研究集中于神经干细胞和骨髓于细胞移植研究,而脐带间充质干细胞相关研究目前国内刚刚起步,后者较前者具有来源广泛,伦理限制少等优势。目的：构建脑源性神经营养因子真核表达载体,并将其转染至人脐带间充质干细胞中,建立稳定表达脑源性神经营养因子的细胞模型。方法：应用反转录PCR获得脑源性神经营养因子的基因序列,然后将脑源性神经营养因子的基因序列插入到pcDNAⅢ载体的多克隆位点,构建脑源性神经营养因子蛋白表达载体,并转染脐带间充质干细胞;Western Blot体外检测携带脑源性冲经营养因子基因的脐带间充质于细胞的脑源性神经营养因子蛋白表达水平：取培养好的PC12细胞和胎鼠皮质神经元加入含脑源性神经营养因子的脐带间充质干细胞培养基,检测脑源性神经营养因子蛋白的生物活性。结果与结论：成功构建脑源性神经营养因子真核表达载体,该载体能在脐带间充质干细胞中高水平表达脑源性神经营养因子蛋白,表达的脑源性神经营养因子蛋白体外检测具有生物活性。可见脐带间充质干细胞有可能作为脑源性神经营养因子真核表达载体用于神经损伤修复研究。     

胶质源性神经营养因子基因修饰骨髓间充质干细胞与缺氧复氧神经细胞的共培养

背景：课题组前期研究表明,胶质源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞能稳定地表达胶质源性神经营养因mRNA,但骨髓间充质干细胞/胶质源性神经营养因子分泌的胶质源性神经营养因子蛋白对缺氧复氧损伤的神经细胞是否积极影响,尚不清楚。目的：观察胶质源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞对缺氧复氧神经细胞的保护作用。方法：胶质源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞经诱导后与缺氧复氧神经细胞共培养,采用Hoechst33258细胞免疫荧光染色分别检测神经细胞凋亡及生长相关蛋白43在共培养细胞中的表达。结果与结论：骨髓间充质干细胞/胶质源性神经营养因子组的神经细胞凋亡率显著低于骨髓间充质干细胞组和缺氧组（P〈0.05）,骨髓间充质干细胞/胶质源性神经营养因子组表达生长相关蛋白43的吸光度值明显高于骨髓间充质干细胞组（P〈0.05）。提示骨髓间充质干细胞/胶质源性神经营养因子通过抑制缺氧复氧神经细胞凋亡和促进共培养细胞生长相关蛋白4表达发挥神经保护作用。     

脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间充质干细胞治疗坐骨神经损伤

背景:对周围神经损伤的治疗,目前希望能提高损伤局部的脑源性神经营养因子浓度来促进神经的修复再生.目的:观察坐骨神经损伤大鼠体内植入脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞后神经纤维的再通及运动功能的恢复情况.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-05/2008-05在福建省神经病学研究所完成.材料:无菌条件下取2月龄F344雄性大鼠股骨、胫骨制备骨髓间充质干细胞.利用构建好的慢病毒载体PNL-BDNF-IRES2-EGFP制备脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间质干细胞.方法:将60只成年SD大鼠经钳夹制作成右坐骨神经损伤模型,随机分为磷酸盐缓冲液组,骨髓间质干细胞组,脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间质干细胞组.在损伤处分别注射磷酸盐缓冲液2 μ L,骨髓间质干细胞混悬液2 μ L和脑源性神绛营养因子基因修饰骨髓间质干细胞混悬液2 μL.主要观察指标:在术后2,4周,通过辣根过氧化物酶示踪观察损伤侧L4,5脊髓前角存活的神经细胞数目,通过测量坐骨神经功能指数值观察大鼠损伤侧肢体运动功能恢复情况,同时应用荧光激发及免疫组化技术检测骨髓间质干细胞存活和脑源性神经营养因子表达情况.结果:脑源性神终营养因子基因修饰骨髓间质干细胞组损伤侧L4,5脊髓前角细胞的存活数目多于磷酸盐缓冲液组和骨髓间质干细胞组,并且神经功能恢复也比其他两组好.骨髓间质干细胞组和脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间质干细胞组可观察到神经损伤处有较多的骨髓间质干细胞存活,并且脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间质干细胞组脑源性神经营养因子表达明显比骨髓间质干细胞组多.结论:脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间质干细胞对周围神经损伤后神经纤维的再通及功能恢复有促进作用.     

人骨髓间充质细胞在低氧培养条件下脑源性神经营养因子的表达

目的:观察低氧培养条件下人骨髓间充质细胞中脑源性神经营养因子的表达情况,为其用于脑缺血治疗提供依据。方法:实验于2005-09/12在暨南大学医学院血液病研究所完成。生长至次融合状态的第5代人骨髓间充质细胞在低氧混合气(体积分数0.90氮气、体积分数0.05二氧化碳和体积分数0.05氧气)条件下培养,应用半定量反转录聚合酶链反应和酶联免疫技术检测其脑源性神经营养因子基因表达。结果:①骨髓间充质细胞常氧压培养时表达脑源性神经营养因子mRNA和蛋白水平低:半定量反转录聚合酶链反应检测脑源性神经营养因子mRNA与β-肌动蛋白mRNA信号百分比为(6.35±2.39)%,酶联免疫法检测脑源性神经营养因子蛋白为(137.6±12.3)ng/L。②低氧培养显著增加骨髓间充质细胞表达脑源性神经营养因子mRNA和蛋白水平:低氧培养2h时脑源性神经营养因子mRNA与β-肌动蛋白mRNA信号百分比明显高于常氧压培养时表达水平,8h时达到高峰水平[低氧培养2h:(13.94±3.07)%,F=14.66,P<0.01;8h:(27.49±7.18)%]。低氧培养4h时脑源性神经营养因子蛋白显著增高,明显高于常氧培养组,16h时达到高峰水平[低氧培养4h:(165.6±13.9)ng/L,F=11.70,P<0.01;16h:(237.4±15.1)ng/L]。结论:合适低氧条件可增强骨髓间充质细胞表达脑源性神经营养因子,提示其在脑缺血组织等低氧环境下可能产生脑源性神经营养因子样生物学作用,可用于治疗脑缺血等疾病。     

非病毒载体介导脑源性神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞:脂质体及电穿孔转染法的比较

背景:基因转染细胞有病毒及非病毒载体法,因病毒载体面临安全性、免疫排斥等问题,实验探讨脂质体及电穿孔转染法.目的:比较脂质体及电穿孔法介导人脑源性神经营养因子基因转染骨髓间允质干细胞的细胞转染特性和体外表达情况,建立基因工程细胞.方法:①脂质体法:取体外分离、培养的第3代豚鼠骨髓间充质干细胞,将质粒-脂质体混合物加入含细胞的培养基中培养6 h,再加入胎牛血清的培养基,孵育48 h后行免疫组织化学检测,即为瞬时表达.48 h后加入含G418培养基筛选.②电穿孔法:取骨髓间充质干细胞,胰酶消化,用无血清培养基重悬细胞,将细胞悬液加入电转化池中,加入质粒,将电转化池移至电极间放电转导.转染48 h后,检测目的基因瞬时表达.48 h后加入含G418培养基筛选.用免疫组织化学及RT-PCR检测两种方法脑源性神经营养因子基因表达情况.结果与结论:免疫组织化学显示脂质体介导转染的脑源性神经营养因了瞬时表达率约为5.80%,电穿孔法约为24.29%.脂质体法转染筛选14 d后细胞几乎全部死亡;电穿孔法转染后筛选并扩大培养建立工程细胞,免疫组织化学显示工程细胞脑源性神经营养因子阳性表达率达90%以上,RT-PCR扩增产物电泳证实目的基因阳性条带.结果表明,用电穿孔法可成功建立脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间充质干细胞的工程细胞,并用免疫组织化学和RT-PCR办法证实细胞体外表达目的基因.     

脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间质干细胞移植痴呆大鼠大脑皮质及海马tau蛋白、β-淀粉样蛋白及神经元超微结构的变化

背景:课题组前期的研究表明,重组脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间质干细胞脑内移植可以改善阿尔茨海默病鼠的认知功能.目的:观察脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞移植对阿尔茨海默病鼠大脑皮质及海马tau蛋白磷酸化、β-淀粉样蛋白及海马CA1区神经元超微结构的影响.方法:采用侧脑室立体定向注射β-淀粉样肽建立阿尔茨海默病动物模型,取单纯或经脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间质干细胞移植,1个月后采用Western bloting 方法检测大脑皮质及海马组织总tau蛋白及磷酸化的tau蛋白表达,以ELISA方法检测β-淀粉样蛋白40,β-淀粉样蛋白42含量,同时透射电镜观察海马CA1区神经元超微结构的变化.结果与结论:①脑源性神经营养因子修饰的骨髓间质干细胞能够降低大脑皮质及海马组织总tau蛋白及磷酸化的tau蛋白表达,降低大脑皮质及海马β-淀粉样蛋白40和β-淀粉样蛋白42表达.②模型组大鼠海马CA1区神经元出现粗面内质网扩张、膜断裂,线粒体数目减少、线粒体肿胀、核膜不清等改变,脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间质干细胞对上述改变有减轻作用,较骨髓间质干细胞未修饰组明显.     

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰骨髓基质干细胞移植脑出血大鼠神经营养因子的表达

背景:研究证实,细胞移植和神经营养因子相结合治疗脑损伤能促进大鼠神经功能的恢复。目的:观察移植胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的骨髓基质干细胞对大鼠脑出血后神经营养因子表达的影响。方法:通过脑立体定位仪向SD大鼠脑尾壳核注射胶原酶和肝素建立脑出血动物模型,将48只模型鼠随机分为3组,骨髓基质干细胞组、胶质细胞源性神经营养因子/骨髓基质干细胞组和对照组于建模后第3天在脑出血部位分别移植骨髓基质干细胞、胶质细胞源性神经营养因子/骨髓基质干细胞以及生理盐水。结果与结论:与对照组和骨髓基质干细胞组相比,胶质细胞源性神经营养因子/骨髓基质干细胞组大鼠神经功能恢复更好;与对照组相比,移植后1,2周其他2组各神经营养因子表达均显著增加(P<0.05)。提示胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的骨髓基质干细胞移植治疗脑出血大鼠比单纯骨髓基质干细胞有更好的神经保护作用。     

人骨髓间充质细胞在低氧培养条件下脑源性神经营养因子的表达

目的：观察低氧培养条件下人骨髓间充质细胞中脑源性神经营养因子的表达情况，为其用于脑缺血治疗提供依据。 方法：实验于2005-09／12在暨南大学医学院血液病研究所完成。生长至次融合状态的第5代～骨髓间充质细胞在低氧混合气（体积分数0．90氮气、体积分数0．05二氧化碳和体积分数0．05氧气）条件下培养，应用半定量反转录聚合酶链反应和酶联免疫技术检测其脑源性神经营养因子基因表达。 结果：①骨髓间充质细胞常氧压培养时表达脑源性神经营养因子mRNA和蛋白水平低：半定量反转录聚合酶链反应检测脑源性神经营养因子mRNA与β-肌动蛋白mRNA信号百分比为（6．35&;#177;2．39）％，酶联免疫法检测脑源性神经营养因子蛋白为（137．6&;#177;12．3）ng／L。②低氧培养显著增加骨髓间充质细胞表达脑源性神经营养因子mRNA和蛋白水平：低氧培养2h时脑源性神经营养因子mRNA与β-肌动蛋白mRNA信号百分比明显高于常氧压培养时表达水平，8h时达到高峰水平【低氧培养2h：（13．94&;#177;3．07）％，F=14．66，P〈0．0l；8h：（27．49&;#177;7．18）％1。低氧培养4h时脑源性神经营养因子蛋白显著增高，明显高于常氧培养组，16h时达到高峰水平【低氧培养4h：（165．6&;#177;13．9）ng／L，F=11.70，P〈0．0l；16h：（237．4&;#177;15．1）ng／L】。 结论：合适低氧条件可增强骨髓间充质细胞表达脑源性神经营养因子，提示其在脑缺血组织等低氧环境下可能产生脑源性神经营养因子样生物学作用，可用于治疗脑缺血等疾病。     

骨髓间充质干细胞向功能性神经元的横向分化

背景：骨髓间充质干细胞定向分化为神经干细胞并探讨提高分化效率的方法,具有重要的理论与实际应用意义。目的：建立以小同诱导方法横向分化大鼠骨髓间充质干细胞为功能神经元的方法。方法：分离、纯化得到骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测骨髓间充质于细胞表面标志物。将骨髓间充质干细胞分为神经营养因子诱导组、化学诱导组和对照组,骨髓间充质干细胞分别加入脑源性神经营养因子和碱性成纤维细胞生长因子、二甲哑砜和丁香茴醚、PBS进行诱导。结果与结论：神经营养因子诱导组和化学诱导组诱导后的细胞均表达神经元特异性烯醇化酶和微管相关蛋白2,且2组细胞的表达量接近（P〉0．05）,而对照组未发现神经元特异性烯醇化酶和微管相关蛋白2阳性表达。膜片钳系统检测发现神经营养因子诱导组诱导后的细胞具有神经细胞特征性的动作电位和兴奋性突触后电流,而化学诱导组和对照组均未发现动作电位和兴奋性突触后电流。提示脑源性神经营养因子联合碱性成纤维细胞生长因子足一种诱导骨髓间充质干细胞横向分化为功能神经元的可靠方法。     

韶关市农村留守儿童孤独感状况调查

目的了解广东省韶关市农村地区留守儿童孤独感现状及其影响因素。方法对韶关市某地区两所农村小学3～6年级学生中的489名留守儿童采用儿童孤独量表和自编调查表进行问卷调查。结果17．6％留守儿童存在孤独感,不同性别孤独感发生率无差异性,不同年龄及不同年级间孤独感发生率差异均有极显著性（P〈0.01）;随年级增加,孤独感发生率呈下降趋势（X^2趋势=5．970,P〈0.05）。留守儿童孤独感与健康状况、学习成绩、学习困难程度、父母教育方式、父母间关系和老师教育方式等因素显著相关（P〈0.01～0．05）。结论农村地区留守儿童中存在一定程度的孤独感问题,老师和家长应以正确的态度和方法对待留守儿童,以减少其孤独感的发生。     

产科新生儿不同部位经皮测黄报警预值的可靠性观察

目的对比观察产科新生儿不同部位经皮胆红素（TCB）报警预值的可靠性。方法132例产科新生儿采取随机数字分组法分为正常产组和剖宫产组各66例,新生儿均于产后第4天同一时间点应用KJ8000经皮测黄仪分别测量额、胸、腹、额胸、额胸腹TCB值,TCB〉12．9mg／dl者,取得亲属同意抽取静脉血检测血清胆红素（SB）,对比分析不同部位TCB及其与sB值的差异。结果两组分别有17例或21例达到TCB报警预值。两组TCB或sB相同方法及相同部位比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;两组TCB不同部位对比,额部值最低、胸部值最高,且与其他部位同组对比差异均有统计学意义（P〈0．01）;两组sB值对比差异无统计学意义（t=1．53,P〉0．05）,与不同部位TCB对比均以胸部数值差异无统计学意义（P〉0．05）,而与其他部位TCB两组差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论正常产与剖宫产新生儿术后sB对比差异无意义;TCB动态监测以胸部结果更接近SB。     

Determination of loss of quality of life

Physiatrists are a valuable resource in legal settings, where assessment of functional capacity to perform work and of future medical needs must be determined. Physiatrists help determine what future medical care is needed to restore and maintain an individual at the maximum level of life function. This article focuses on the use of a quality of life (QOL) rehabilitation model, rather than a medical model, for enhancing functional performance, modifying environments, and facilitating patient coping. We discuss use of the QOL model to describe and influence a patient's physical, psychological, cognitive, vocational/economic, and social/leisure domains.     

肇庆市居民颈椎病流行病学调查

目的 :调查肇庆市居民颈椎病发病情况及相关问题。方法 :通过分层随机抽样选择该市区18～70岁居民5000人为研究对象 ,入户或至单位询问调查。结果 :该市居民颈椎病发病率为8.11% ,男女差异无显著性 ,随着年龄的增长 ,发病率逐渐增加。经多因素分析 :体位姿势不正确、情绪紧张、潮湿、疲劳是发病的主要诱因。结论 :该病严重影响肇庆市居民的健康 ,做好防治应从早做起 ,综合防治。     

中国人四肢瘫日常生活能力评定量表的信度研究

目的研究四肢瘫日常生活能力评定量表评测四肢瘫患者的重测信度及观察者间信度。方法由1位评定者应用四肢瘫日常生活能力评定量表对20例四肢瘫患者进行评定,评定后1周内再次对该患者进行评定;另1位评定者在第1位评定者初次评定后2 d内对该患者进行评定。结果第1位评定者两次评定总分的组内相关系数为0.994(P<0.01);第1位评定者与第2位评定者评定总分的组内相关系数为0.971(P<0.01)。结论四肢瘫日常生活能力评定量表具有良好的重测信度及观察者间信度。