人抗HBsAg Fab段基因的序列分析及表达

本文对已建的噬菌体抗体库中分离的人抗HBsAg克隆进行了序列分析和表达研究,发现19个克隆都具有相同的重链可变区基因,轻链可变区基因有4个相同,其余15个未进行序列测定.DNA序列分析表明 V_H、J_H分属V_HⅢ和J_H6,D对段为二个D基因的融合,V_k,J_k属于V_kⅠ和J_k4.构建了可溶性Fab段表达载体,发现在细菌培养上清和质周腔中有类似的表达,其表达量约为5ug/ml,与HBsAg可特异性结合,经测定其亲和系数约为0.5×10~9M~(-1).     

重组人抗HBsAg Fab抗体的纯化方法比较研究

目的研究重组人抗HBsAg Fab抗体的纯化条件。方法采用羊抗人Fab抗体亲和层析柱、14F7单克隆抗体亲和层析柱、离子交换-分子筛层析柱,分别纯化由酵母工程菌(Gs115／Fab)发酵的重组人抗HBsAg Fab抗体,并对3种纯化方法所得Fab抗体的纯度、收率、与HBsAg的结合活性进行比较。结果3种纯化方法中,14W单克隆抗体柱纯化的Fab抗体的纯度达98％左右,Fab抗体柱纯化的Fab抗体的纯度为95％,但这两种亲和柱的目的蛋白收率都不高,分别为35％、55％。而离子交换柱纯化的Fab抗体的纯度为93．8％,经分子筛柱进一步纯化后,可达98％以上,Fab抗体蛋白收率可达80％以上。经ELISA分析,3种方法纯化的Fab抗体均具有较高的HBsAg抗原结合力和特异性。结论通过对3种纯化方法的比较得出,离子交换一分子筛层析法是重组人抗HBsAg Fab抗体的最佳纯化方法,这为抗HBsAg Fab抗体的产业化生产和临床研究打下良好基础。     

人抗HBsAg噬菌体抗体Fab段基因的序列分析及表达

对已建的噬菌体抗体库分离出来的人抗－ＨＢｓ克隆进行了序列分析和表达研究，发现４个克隆中３个克隆的重链和轻链完全相同，ＤＮＡ序列分析表明ＶＨ分别属于ＶＨ１亚群和Ⅱ亚群，其轻链ＶＬ分别属于ＶλⅡ亚群和ＶλⅠ亚群。构建了可溶性Ｆａｂ段表达载体，显示出在细菌中表达的Ｆａｂ段抗体与ＨＢｓＡｇ特异性结合，这说明所筛选出来的噬菌体抗体具有ＨＢdisplay status     

抗结肠癌抗体重链可变区和k轻链基因的克隆

目的：从一株抗结肠癌细胞系ＬＳ１７４Ｔ的单抗细胞株ＣＬ－４中克隆出抗结肠癌抗体重链可变区和ｋ轻链基因，方法：用一步法提取总ＲＮＡ，逆转录形成ｃＤＮＡ，设计并合成一套扩增小鼠抗体重链可变区和完整ｋ轻链的通用引物，通过ＰＣＲ扩增基因，分别克隆入ｐＵＣ１９，作核苷酸序列分析，结果：用重链引物扩增获得长的３６０ｂｐ的片段，用轻链引物扩增获约６４０ｂｐ的片段，序列测定获得它们的ＤＮＡ序列，结论：克隆的重链可     

抗HBsAg人IgG表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

尝试将一株来源于人源性噬菌体抗体库的抗ＨＢｓＡｇ人Ｆａｂ,转换成完整的抗ＨＢｓＡｇ人ＩｇＧ。方法：采用重叠ＰＣＲ方法,在抗ＨＢｓＡｇ人Ｆａｂ的Ｖｋ和ＶＨ基因的５’端接上合工合成的人ｋ链的前导序列,构建表达完整ＩｇＧ１的真核表达载体,转染ＣＨＯ（ＤＨＦＲ＾－）细胞,用ＥＬＩＳＡ、ＲＴ－ＰＣＲ和免疫印迹检测抗ＨＢｓＡｇ人ＩｇＧ的表达,通过ＤＨＦＲ／ＭＴＸ体系及金属离子诱导提高Ｉｇ表达。结果：获得表达量     

抗结肠癌抗体重链可变区和κ轻链基因的克隆

目的：从一株抗结肠癌细胞系ＬＳ１７４Ｔ的单抗细胞株ＣＬ－４中克隆出抗结肠癌抗体重链可变区和κ轻链基因。方法：用一步法提取总ＲＮＡ，逆转录形成ｃＤＮＡ，设计并合成一套扩增小鼠抗体重链可变区和完整κ轻链的通用引物，通过ＰＣＲ扩增基因，分别克隆入ｐＵＣ１９，作核苷酸序列分析。结果：用重链引物扩增获得长约３６０ｂｐ的片段；用轻链引物扩增获得约６４０ｂｐ的片段，序列测定获得它们的ＤＮＡ序列。结论：克隆的重链可变区基因长度为３６０ｂｐ，属于小鼠重链可变区Ｉ（Ｂ）亚族；κ轻链长度为６４２ｂｐ，其中可变区为３２１ｂｐ，属于小鼠κ轻链Ⅴ亚族。     

抗HBsAg人IgG在CHO细胞中表达影响因素的研究

目的：为了提高抗体的产量,本文初步探讨了CHO－HB2细胞株表达抗HBsAg人IgG的几种影响因素。方法：采用静置和滚瓶培养,分别观察了CHO－HB2细胞表达抗体的稳定性;不同培养基以及添加剂的效用：细胞接种密度和培养持续时间的选择;金属离子Zn^2 的诱导表达作用;滚瓶的培养效果。结果：CHO－HB2细胞的亚克隆株（F4）经氮冻存半年多复苏后,在无MTX的培养基中连续传代第2个月抗体表达量已开始下降,5个月接近MTX加压前的基础水平;在培养基中添加多种氨基酸和维生素,并加入适量的Zn^2 诱导金属硫蛋白启动子可使表达量明显增加。滚瓶培养又进一步增加了抗体的表达量,其中CHO－HB2在无蛋白的无血清培养基中的表达量从6．2μg/ml提高到28μg/ml。结论：应及时用MTX对细胞株进行再加压筛选以及保存,以保持细胞稳定表达抗体的能力;通过优化培养条件,使用完全无蛋白的无血清培养基可收到较好的效果,有利于表达抗体的纯化。     

丙型肝炎病毒核心蛋白抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

为制备抗丙型肝炎病毒核心蛋白的抗独特型单链可变区抗体（抗－Id scFv),采用噬菌体表面展示技术，将抗－HCV核心蛋白的单克隆抗体固相包被于Nunc板，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，获得可与HCV核心蛋白单克隆抗体结合的抗独特型人源单链可变区抗体的噬菌体集落。随机挑选60个克隆，利用酶联免疫吸附法（ELISA）、交叉反应和竞争抑制实验，对其进行免疫学检测和鉴定。获得与HCV核心蛋白单克隆抗体结合活性较强的抗－Id scFv阳性克隆，并对HCV核心蛋白特异性抗－Id scFv的编码序列进行测定分析。结果经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选，在随机挑选的60个克隆中，有20株克隆ELISA的吸光度（A450nm)值较高，这些噬菌体上清与牛血清白蛋白（BSA）进行交叉反应后，确定了其中有6株交叉反应较弱，结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果，最后确定1株阳性克隆，提取质粒，进行DNA序列测定，DNA大小为768bp。本实验结果提示用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗－HCV核心蛋白的抗－Id scFv，为开展用抗－Id scFv防治慢性丙型肝炎的研究创造了条件。     

人源抗HBsAg噬菌体抗体的筛选、鉴定及基因序列分析

目的筛选与鉴定人源抗乙肝表面抗原(HBsAg)噬菌体抗体,并对其进行基因序列分析。方法利用噬菌体表面递呈技术,从人的外周淋巴细胞中分离和扩增抗体基因,构建抗体组合文库,经亲和淘洗从该文库中筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体,通过ELISA及竞争抑制实验鉴定其活性和特异性,并分析获得的抗HBsAg人源抗体重链和轻链基因序列。结果从第3轮淘洗洗脱下来的噬菌体感染细菌长出的菌落中挑出30个,进行ELISA检测,取A490值最高(1.47±0.08)的一株进行竞争抑制试验,结果A490为0.35±0.10,抑制率为76%,所筛出的噬菌体抗体为HBsAg的特异性抗体,酶切分析显示其包含重链和轻链基因,序列分析表明重链可变区(VH)属人免疫球蛋白VHⅠ亚群,轻链可变区(VL)属于VκⅠ和VκⅢ亚群。结论从所构建的抗体库中,筛选出能特异结合HBsAg的抗HBsAg噬菌体抗体,说明通过噬菌体抗体库筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体在技术上是可行的,这为抗HBsAg基因工程抗体的应用以及设计针对乙型肝炎的新型靶向治疗策略奠定了基础。     

丙型肝炎病毒NS4A抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

为探索新型治疗方法，制备抗丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS4A的抗独特型人源单链可变区抗体（抗－Id scFv),采用噬菌体表面展示技术，将抗HCV NS4A单克隆抗体固相包被于Nunc板，应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，随机挑选82个克隆，利用酶联免疫吸附法（ELISA）、交叉反应和竞争抑制实验，对其进行免疫学检测和鉴定，获得与HCV NS4A单克隆抗体结合活性较强的抗－Id scFv阳性克隆，并对HCV NS4A特异性抗－Id scFv的编码基因进行序列测定分析。结果：经过筛选82个克隆中有40株克隆ELISA的吸光度（A450nm)值较高，将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白（BSA）进行交叉反应，确定其中有7株交叉反应较弱，结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果，最后确定1株阳性克隆。提取质粒，进行DNA序列测定，DNA为789bp。本实验结果提示，用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗HCV NS4A的抗－Id scFv，为开展用抗－Id scFv防治丙型肝炎的研究创造了条件。     

青果中抗HBsAg/HBeAg成分的研究

青果（ＣａｎａｒｉｕｍａｌｂｕｍＲａｅｕｓｃｈ）经去果核，脱脂，酸水解，水解液回收溶剂后碱萃取，萃取液酸化，再以溶剂提取，回收溶剂，经柱层析，洗脱，重结晶，得纯品，得率０．５％。经测试：ｍｐ＝２３９℃，Ｍ＝１７０，经１ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲ、ＩＲ、ＭＳ检测，鉴定为没食子酸，理化性质与标准品或图谱基本一致。用ＥＬＩＳＡ法检测，抗ＨＢｓＡｇ／ＨＢｅＡｇ均有效，其效果与没食子酸对照品基本相同，认为没食子酸是青果中抗乙肝病毒的有效成分之一。     

苯丙氨酸二肽类化合物073对2．2．15细胞分泌HBsAg和HBeAg的影响

目的观察苯丙氨酸二肽类化合物073对2．2．15细胞分泌HBsAg、HBeAg的影响。方法以2．2．15细胞为研究对象,通过细胞毒性实验确定苯丙氨酸二肽类化合物073对细胞的最大无毒浓度（TC0）,在最大无毒浓度以下将药物用培养液对倍稀释成50、25、12．5μg·mL^-1加入2．2．15细胞进行培养,每4d换同浓度药物培养液;分别收集第4、8天以及停药后4天的培养液上清,酶联免疫法（ELISA）测定HBsAg、HBeAg含量。结果苯丙氨酸二肽类化合物073最大无毒浓度为50μg·mL^-1,在最大无毒浓度时对HBsAg有明显的抑制作用,第8天时的抑制率为59．3％,半数抑制浓度（IC50）为22．9μg·mL^-1,治疗指数（TI）为3．1;但对HBeAg无明显抑制作用,第8天时的抑制率仅为25．5％。结论苯丙氨酸二肽类化合物073对2．2．15细胞HBsAg有显著的抑制作用。     

水芹总酚酸对2．2．15细胞分泌HBsAg与HBeAg的抑制作用

目的观察水芹总酚酸对2．2．15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用。方法以2．2．15细胞为研究对象,通过细胞毒性实验确定水芹总酚酸对细胞的最大无毒浓度（TC0）,在最大无毒浓度以下将药物用培养液对倍稀释成500、250、125μg·mL^-1加入2．2．15细胞进行培养,每4d换同浓度药物培养液;分别收集第4、8天以及停药后4d的培养液,酶联免疫法（ELISA）测定HBsAg、HBeAg含量。结果水芹总酚酸最大无毒浓度为500μg·mL^-1,在最大无毒浓度时对HBsAg、HBeAg具有明显的抑制作用,第8天时的抑制率分别为59．33％和90％,半数抑制浓度（IC50）分别为484．17、379．89μg·mL^-1,治疗指数（TI）分别为3．158、4．025,其中对HBeAg的抑制作用优于HBsAg。结论水芹总酚酸对2．2．15细胞分泌的HBsAg、HBeAg有显著的抑制作用。     

水芹乙酸乙酯提取物在2215细胞培养内对乙型肝炎病毒表面抗原 …

目的：观察水芹乙酸乙酯提取物（简称水芹提取物）在乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因的人吕细胞系（Ｈｅｐ Ｇ２）２２１５细胞培养中,对细胞的毒性及对ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）的抑制效果。方法：水芹提取物用培养液释释成２０００、１０００、５００、２５０、１２５μｇ．ｍｌ＾－１３浓度,分别加入２２１５细胞内培养,于第６、９ｄ收集的培养液,用固相放射免疫法测定ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ,γ－计     

隐匿性HBV感染相关S基因突变对HBsAg检测的影响及其机制

目的 探讨隐匿性HBV感染(OBI)相关S基因突变对多种抗-HBs及HBsAg临床检测试剂的反应性.方法 9种代表性S基因突变株(M1-M9,其中M1-M5为本课题组首次报道)分离自1例OBI患者和3例OBI献血人员血清.分别采用野生型及突变型S基因重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞,分析9种突变株HBsAg表达及其突变蛋白对抗体和检测试剂反应的影响.结果 采用HBsAg罗氏诊断试剂Elecsys定量检测9种突变株胞内HBsAg水平,均较野生株的水平明显下降;相同样品用抗-His抗体检测显示仅M1、M6和M7的HBsAg-His融合蛋白表达水平与野生株比较明显降低.6种抗-HBs与各突变HBsAg的反应性结果(S/CO值)显示,与野生株相比,多数突变株与6种抗-HBs的反应性明显降低,M1、M4、M7和M9产生的HBsAg与抗体4及M9产生的HBsAg与抗体6反应性最差(S/CO＜1).6种商品化HBsAg临床试剂检测结果显示,多数突变株与6种HBsAg试剂反应性较野生株明显降低(P＜0.05),ELISA试剂D、E和F漏检率分别为11.1％、22.2％和55.6％.结论 本实验涉及的突变HBsAg与抗-HBs的结合力降低是引起OBI表现的主要原因之一.当前临床常用HBsAg检测试剂对突变HBsAg的检测能力存在明显不足,亟待提高.     

大剂量HBsAg疫苗对HBV转基因小鼠细胞免疫调节的研究

目的　研究大剂量HBsAg疫苗对HBV转基因小鼠 (Tg鼠 )细胞免疫应答的影响。方法　Tg鼠 4 8只 ,每只注射 6 μg(相当于人产生抗体剂量的 180倍 )的HBsAg疫苗后 ,用流式细胞术、氚 胸腺嘧啶核苷 (3 H TdR)掺入法和ELISA法 ,分别检测其树突状细胞(DC)、T淋巴细胞增殖及其诱生细胞因子IL 2、IFN γ的水平。结果　大剂量HBsAg疫苗组DC表面共刺激分子CD80、CD86和I Ek的阳性百分率 (% )均高于对照组 (P <0 0 5 ) ,特异T淋巴细胞增殖能力 8个月的cpm值 (10 0 77 2± 85 74 0 )显著高于 1周的 (5 32 9 1± 30 86 0 ) (P <0 0 5 ) ;其诱生细胞因子的水平 8个月时IL 2 (46 2 4± 12 2 5pg/ml)、IFN γ(976 1± 5 4 4 1pg/ml)显著高于 1周时IL 2 (15 6 1±78 7)、IFN γ(5 8 3± 4 9 5 ) (P <0 0 1)。结论　大剂量HBsAg疫苗能够增强Tg鼠细胞免疫应答能力 ,恢复对乙型肝炎抗原的应答。     

高压氧对慢性肝炎患者体液免疫及肝组织中HBsAg、HBcAg的影响

目的 观察慢性肝炎（CH）高压氧（HBO）治疗前后患者的体液免疫功能和肝组织中HBsAg、HBcAg的变化。方法 用单人纯氧舱治疗（0.25MPa,1.5h/d,10d/couse,6courses)60例CH，用Array TM Protiein System Array160测定治疗前后静脉血α－白蛋白，γ－球蛋白，IgA,IgG,IgM，补体C1，C4；肝穿刺活检，SP法检测肝组织中HBsAg、HBcAg。结果 HBO治疗后CH患者静脉血γ球蛋白，IgA,IgG,IgM，补体C1，C4明显降低，α－白蛋白明显升高，治疗前后差异显著（P＜0．05），CH患者肝组织中HBsAg、HBcAg变化不明显，治疗前后差异不显著（P＞0．05）。结论 HBO治疗CH，可降低患者的体液免疫反应，对CH肝组织中HBsAg、HBcAg抑制作用不明显。     

绿原酸对抗乙肝病毒-HBsAg和HBeAg的抑制作用

目的观察绿原酸对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用。方法以2.2.15细胞为研究对象,通过细胞毒性实验确定绿原酸对细胞的最大无毒浓度,在最大无毒浓度以下将药物用培养液对倍稀释成250、125、62.5μg/ml,加入2.2.15细胞进行培养,每4d换同浓度药物培养液,分别收集第4、8天的培养液,酶联免疫法测定HBsAg、HBeAg含量。结果绿原酸对2.2.15细胞最大无毒浓度为250μg/ml。在最大无毒浓度（250μg/ml）时,两批试验对HBsAg、HBeAg均具有明显的抑制作用。第4、8天时对HBeAg的平均抑制率分别为89.45%、82.00%,对HBsAg的抑制率分别为86.54%、88.00%。结论绿原酸对2.2.15细胞分泌的HBsAg、HBeAg有显著的抑制作用。     

死胎大脑组织中HBsAg检测的临床和病理研究

 目的 观察乙型肝炎病毒是否通过产妇传播并在胎儿大脑组织表达。方法 采集40例乙型肝炎产妇产下的死胎,常规尸检,取大脑组织,SP法检测HBsAg;回访婴母产前静脉血HBV的检测结果。结果 HBsAg阳性颗粒在死胎的大脑胶质细胞浆、血管中点、灶状分布,大脑胶质细胞细胞核不着色。HBsAg阳性、(HBsAg、HBeAb、HBcAb皆阳性)、(HBsAg、HBeAg、HBcAb皆阳性)的婴母分娩的死胎大脑组织中HBsAg阳性几率分别为8／33、0／2、0／5例,三者比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。结论 乙型肝炎病毒可以通过母婴垂直传播在胎儿大脑组织中表达;其表达与孕妇静脉中乙型肝炎病毒标志物(HBVM)无关。     

鸡抗HBs抗体的制备及在人HBsAg检测中的应用

对所制备的抗鸡蛋黄IgY单克隆抗体1G11和3A6进行鉴定,标记后建立了检测鸡蛋黄IgY的间接ELISA方法.用乙型肝炎疫苗免疫25周龄蛋鸡,血清及蛋黄中第8d出现特异性抗体,在第60d效价达1×10~(-5).利用鸡抗HBs抗体,建立了检测血清HBsAg的夹心ELISA方法.检测HBsAg的最低浓度达0.5ng/ml.且特异性较目前商业化试剂盒高