人骨髓间充质干细胞的免疫调节作用及向神经元样细胞诱导分化

背景:骨髓间充质干细胞作为具有多向分化潜能的干细胞,属于未分化的前体干细胞,其表型分化尚不成熟,因此在同种异体移植后无排斥反应或反应较弱.但是在体外条件下通过化学和生物诱导物使骨髓间充质干细胞转化为神经元,影响骨髓间充质干细胞向神经细胞、胶质细胞系统定向分化的因素比较复杂.目的:观察人骨髓间充质干细胞的免疫调节作用,及向神经元样细胞诱导分化的能力.设计、时间及地点:对比观察,于2008-01/2009-03在无锡市第三人民医院细胞室完成.材料:骨髓来源于人髋关节手术时的松质骨碎片或髂骨游离移植.方法:首先分离和培养骨髓间充质干细胞,建立双向混合淋巴细胞反应体系,在双向混合淋巴细胞反应中,将来自2个志愿者的外周血单个核细胞(各1×10~5/孔)等比例加入96孔板中,根据不同效靶比E/T ratios(骨髓间充质干细胞/外周血单个核细胞)加入丝裂霉紊处理过的骨髓间充质干细胞.在骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞实验中分别选择两种诱导培养基,方法1诱导:DMEM+体积分数为10%胎牛血清+1 μmol/L全反式维甲酸+20 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子+20 μg/L表皮生长因子;方法2诱导:DMEM+2%二甲基亚砜+100 μmol/L 丁羟茴醚.主要观察指标:~3H掺入法测定淋巴细胞增殖率,观察骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的影响;通过条件培养基定向诱导,免疫荧光和免疫组织化学染色观察其分化为神经细胞的能力.结果:①骨髓间充质干细胞与混合淋巴细胞反应体系共同培养抑制了淋巴细胞增殖,其增殖抑制率与加入骨髓间充质干细胞的数量呈正比.②方法1诱导2 h后,光镜下可见骨髓间充质干细胞的细胞质向核收缩,呈典型核周体形态.3～5 h后多数细胞能形成神经元样细胞形态,但细胞数目无明显增加.3 d后大多数细胞转变为双极或多极神经元细胞样形态,部分细胞之间拉成网状.染色可见60%～70%神经元特异性烯醇化酶、45%～50%胶质纤维酸性蛋白阳性,巢蛋白阳性细胞下降为3.4%.方法2诱导2 h即可见细胞体积变小,形成双极或多极的细胞体,可持续诱导48 h,后大部分细胞浮起死亡.染色可见40%～50%神经元特异性烯醇化酶,35%～40%胶质纤维酸性蛋白阳性,巢蛋白阳性细胞在诱导2 h时一过性上升到63%,48 h时下降为1.6%.结论:骨髓间充质干细胞具有向神经细胞分化能力并且可以抑制混合淋巴细胞反应体系中淋巴细胞的增殖,对同种异体免疫反应具有负调节作用.     

细胞密度与骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景:细胞种植密度是影响干细胞分化的因素之一,对于细胞种植密度在骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中的作用尚缺乏深入研究.目的:观察细胞种植密度对骨髓间充质干细胞诱导向神经元样细胞分化的影响.方法:采用贴壁培养法分离大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代后将其按2×102,2×103,4×103,8×103,2×104,4×104/cm2种植于六孔板,每组均加入碱性成纤维细胞生长因子+表皮生长因子+维甲酸诱导向神经元样细胞分化,并通过免疫组织化学染色鉴定,计算每组细胞出现神经元样细胞的比例,比较各组的分化率.结果与结论:各组骨髓间充质干细胞加入诱导剂后均出现神经元样细胞,Nestin、NSE、GFAP细胞化学染色呈阳性.不同种植密度组出现神经元样细胞比例不同,以8×103/cm2组神经元样细胞比例最高,且神经元样存活时间最长,达7 d.结果说明骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化与细胞接种密度有关,过高或过低细胞密度均不利分化.     

骨髓源性神经样细胞体外存活、增殖的特性

目的:寻找骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样/星形胶质样细胞的有效方法,并评价其体外存活和增殖特性。方法:实验于2005-07/2006-08在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成。采用贴壁筛选法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。收集第5代骨髓间充质干细胞单细胞悬液,以1×109L-1置入6孔培养板中,加入DMEM 20%胎牛血清生长培养基,24h后更换生长培养基为DMEM/F12 2?7 40μg/L碱性成纤维生长因子 20μg/L内皮生长因子诱导分化培养基,诱导10～20d,即采用多因子分阶段逐步诱导方法定向诱导骨髓间充质干细胞分化为神经前体样细胞。更换诱导分化培养基为DMEM/5%胎牛血清生长培养基,分两组进行诱导:一组向神经元样诱导分化:全反式维甲酸连续加样,首次浓度0.5μmol/L,以后每天全量加样;二组向星形胶质样细胞诱导分化:10μg/L血小板衍生生长因子BB首次加样,以后每天半量加样,均连续诱导10～14d,进而分化为神经元样/星形胶质样细胞。应用活细胞计数试剂盒CCK-8检测神经元样/星形胶质样细胞的增殖及存活情况,绘制生长曲线及细胞存活曲线。结果:①碱性成纤维生长因子 表皮生长因子连续诱导7d后骨髓间充质干细胞分化为球团样的神经前体样细胞,巢蛋白表达阳性。②全反式维甲酸、血小板衍生生长因子BB分别连续诱导10d后骨髓间充质干细胞逐步分化出神经元样、星形胶质样细胞,并分别表达纤维丝蛋白200及胶质纤维酸性阳性蛋白。③神经元样细胞早期生长较缓慢,具有一定的增殖能力,六七天后达到高峰,此后增殖能力明显下降,细胞存活率明显下降,十四五天之后细胞存活率下降到7.6%以下,难以传代培养。星形胶质样细胞初期生长慢,5d后生长加速,进入对数生长期,七八天后进入平台期,仍保持较高的细胞存活率。结论:采用多因子分阶段诱导方法可成功诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样/星形胶质样细胞。神经元样细胞存活、增殖能力较差,难以传代,星形胶质样细胞存活、增殖能力较强,可建立传代的二倍体细胞系。     

预诱导与全反式维甲酸并脑源性神经营养因子体外诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞的分化

背景:骨髓基质干细胞可定向诱导分化为神经元样细胞,但目前培养的方法尚不统一.目的:采用预诱导与全反式维甲酸和脑源性神经营养因子为培养体系,拟在体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向神经细胞分化.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-12/2008-06在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心干细胞室完成.材料:清洁级雄性SD大鼠2只,由新疆医科大学动物试验中心提供.方法:采用贴壁法体外分离培养大鼠骨髓基质干细胞,经反复传代细胞逐渐纯化.取生长状态良好的第3代骨髓基质干细胞,按8×107L-1密度接种后,改换含10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子的神经干细胞培养体系进行预诱导,48 h后去除预诱导液,加入含10 μg/L脑源性神经生长因子、1 μmol/L全反式维甲酸的神经干细胞培养体系定向诱导骨髓基质干细胞分化为神经细胞.以未诱导的骨髓基质干细胞作为对照.主要观察指标:流式细胞仪检测第3代骨髓基质干细胞表面标志的表达,诱导后免疫荧光染色和流式细胞仪检测巢蛋白阳性的表达,免疫荧光染色鉴定神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达.结果:第3代骨髓基质干细胞CD29,CD44表达率分别为97.1%,99%,CD45表达率为0.5%,CD34呈阴性表达.预诱导48 h后巢蛋白阳性率为24%,而对照组仅为4.6%.诱导48 h后,巢蛋白染色呈阳性,并可见大量神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞出现;对照组均呈阴性表达.结论:神经干细胞培养体系联合全反式维甲酸与脑源性神经生长因子,可在体外高效、稳定地诱导骨髓基质干细胞转化为神经元样细胞,并进一步向神经元和神经胶质细胞方向分化.     

骨髓间充质干细胞体外转化为神经细胞的环境特征

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养条件,体外定向诱导传代骨髓间充质干细胞向神经干细胞转化并进一步向神经细胞分化的环境,并对分化的神经元进行鉴定。方法:实验于2005-08/2007-03在南京大学医学院附属鼓楼医院科研部完成。①选用健康SD大鼠,分离纯化并培养大鼠骨髓间充质干细胞。②应用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达,通过免疫表型鉴定骨髓间充质干细胞.③贴壁培养诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化,分为对照组和诱导剂组,对照组中不加诱导剂,诱导剂组分两步诱导:首先加入含终浓度均为10μg/L的表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子诱导分化剂,连续培养12 d:然后应用20μg/L的脑源性神经营养因子和1μmol/L的全反式维甲酸继续诱导6 d,分别收集诱导1 d,6 d,12 d,18 d的细胞进行细胞免疫荧光鉴定。结果:①传代第3代骨髓间充质干细胞为梭形成纤维样细胞,均一稳定的表达与间充质干细胞相关的表面抗原标记物CD29,CD44,CD90、阳性率分别为98.88%,96.90%.95.86%,但极少表达造血细胞标志CD34。②经碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子诱导12 d后诱导剂组巢蛋白阳性表达率为(89.24±2.12)%,而对照组细胞未表达巢蛋白。③经脑源性伸经营养因子和全反式维甲酸联合诱导6 d后,诱导剂组均可见微管相关蛋白2阳性细胞,大部分细胞转变为神经元样细胞形态;对照组微管相关蛋白2阴性.细胞形态仍为梭形成纤维样细胞。结论:实验采用并改良了全骨髓贴壁法,操作简单快速.细胞活性好,是一种较为理想的分离和纯化骨髓间充质干细胞的方法.骨髓间充质干细胞可分化成神经干细胞,进一步诱导分化为神经细胞。     

骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞后电生理特性的改变

背景:目前体外实验对骨髓间充质干细胞来源的神经元样细胞的研究多集中于形态学层面和神经标志物方面,对分化后的电生理功能研究较少.目的:观察脑源性神经营养因子/碱性成纤维细胞生长因子/全反式维甲酸诱导Wistar大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞后电生理特性的变化.设计、时间及地点:细胞学体外培养,对比观察,于2005-06/2007-10在天津市环湖医院细胞室和南开大学生命科学院完成.材料:6周龄雄性Wistar大鼠3只,体质量160g左右.方法:贴壁培养法体外分离纯化间充质干细胞,用脑源性神经营养因子/碱性成纤维细胞生长因子/全反式维甲酸联合诱导间充质干细胞向神经元样细胞分化.诱导前和诱导3 d后分别用膜片钳技术检测细胞膜电流.主要观察指标:流式细胞仪检测间充质干细胞表型:倒置显微镜观察诱导分化前后细胞形态变化;免疫细胞化学鉴定神经元特异性烯醇化酶的表达,以及全细胞电流测定结果.结果:①流式细胞仪检测结果显示,CD90阳性率(99±3)%,CD31阳性率(3.4±0.8)%,CD34阳性率(0.3±0.1)%.说明这一细胞群大部分处于未分化的干细胞状态,其纯度可达95%.②光镜下可见未经诱导的间充质干细胞多为扁平形带突起的细胞,似纤维样细胞,诱导3 d后出现神经元样细胞.③免疫细胞化学结果显示,诱导前间充质干细胞的神经元特异性烯醇化酶呈弱阳性,诱导后呈强阳性.诱导72 h时分化率为(24.01±3.76)%.④诱导组神经元样细胞外向电流峰值及最大外向电流密度高于对照组(P＜0.05),但未发现内向钠电流.结论:脑源性神经营养因子/碱性成纤维细胞生长因子/全反式维甲酸诱导方法可以诱导间充质干细胞向神经元方向分化,虽未发现具有成熟神经元电生理功能,但有向成熟神经元分化的趋势.     

β-淀粉样蛋白诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中Tau蛋白的过度磷酸化

背景:大多数学者认为β-淀粉样蛋白是阿尔茨海默病发病的始动因素,而Tau蛋白过度磷酸化可能是阿尔茨海默病最重要的分子病理变化之一.目的:观察β-淀粉样蛋白25~35对大鼠骨髓间充质干细胞分化的神经元样细胞Tau蛋白磷酸化的影响.方法:体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,将第4代骨髓间充质干细胞分为两组:实验组中加入预诱导培养基和20 μmol/L β-淀粉样蛋白25~35,24 h后用含2%二甲基亚砜和200 μmol/L丁羟茴醚的DMEM诱导其向神经细胞分化,5 h后收取细胞.对照组诱导方法同实验组,但在诱导过程中未加入β-淀粉样蛋白25~35.结果与结论:光镜下可见纺锤状的骨髓间充质干细胞诱导后出现长突起,呈现神经细胞样形态,但实验组突起数量和长度均少于对照组;免疫细胞化学法检测两组诱导后的神经元样细胞为神经元特异性烯醇化酶阳性;免疫蛋白印记法证明实验组的GSK-3β、Tau[pSer262]和Tau[pSer396]表达均显著高于对照组.结果提示β-淀粉样蛋白25~35能够通过GSK-3β途径诱导骨髓间充质干细胞分化的神经元样细胞Tau蛋白过度磷酸化.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外向神经元样细胞的诱导

背景:选择合适的诱导方法诱导骨髓间充质干细胞为神经元样细胞是临床治疗神经损伤的关键.目的:在大鼠骨髓间充质干细胞中加入大鼠齿状回蛋白提取物,观察其诱导分化为神经元样细胞的可行性.方法:应用20,40,60,80 mg/L齿状回蛋白提取物诱导分化大鼠骨髓间充质干细胞,蛋白印记检测神经元分化情况,筛选最佳剂量.收集诱导后的神经元样细胞,倒置显微镜下观察分化后细胞的形态学变化,用蛋白印记技术检测NSE、NeuN的表达,免疫荧光技术检测细胞内NeuN的表达.结果与结论:诱导分化7d后,经蛋白印记检测可见60mg/L的齿状回蛋白提取物为最佳诱导剂量,随质量浓度的增加NSE与NeuN的表达量逐渐增加,当质量浓度为80 mg/L时,细胞表达的NSE与NeuN减少;选择60 mg/L齿状回蛋白提取物诱导分化骨髓间充质干细胞,诱导后的细胞变长,有突触:免疫荧光NeuN染色发现,诱导分化后的神经元样细胞有阳性表达.结果提示齿状回提取物是一种可以诱导骨髓间充质干细胞分化的有效生物诱导剂.     

碱性成纤维细胞生长因子预诱导后加入丹参酮ⅡA体外定向培养骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景：采用中药作为诱导剂对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向诱导分化是否会有效果呢？目的：验证碱性成纤维细胞生长因子预诱导后加入中药丹参酮ⅡA体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的效应。方法：采用Percoll分离液密度梯度离心法获取骨髓间充质干细胞,取第3代细胞利用碱性成纤维细胞生长因子联合丹参酮ⅡA诱导其向神经元样细胞分化,全反式维甲酸无血清培养基诱导液及不进行诱导的细胞做为对照。结果与结论：①骨髓间充质干细胞能稳定表达间质细胞特异性的标记物CD44,表达阳性率为（91.00±1.58）%,但不表达CD34、CD45,流式细胞学检测其纯度高达95.5%。②诱导分化后经扫描电镜检测可观察到典型的神经元样细胞结构;免疫组织化学检测细胞表达神经元特导性烯醇化酶,神经元特导性烯醇化酶阳性率为（75.60±2.31）%,Nestin呈一过性表达增加后随着诱导时间延长逐渐减低至阴性,不表达神经胶质纤维酸性蛋白。说明经碱性成纤维细胞生长因子预诱导后加入丹参酮ⅡA能高效地定向诱导神经元样细胞的分化。     

人脐血间充质干细胞体外向神经元样细胞分化的实验研究

目的:探讨来源于人脐带血的间充质干细胞体外诱导分化成神经元样细胞的可行性。方法:采用密度梯度离心方法分离人脐带血单个核细胞,用MesenCult培养液体外扩增生长传代培养,于倒置显微镜下观察其生长特性。取第3代的脐血间充质干细胞,用10μg／L成纤维细胞生长因子和30μmol／L全反式维甲酸诱导培养的细胞向神经细胞分化。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,于诱导前、诱导后5 d和10 d分别进行神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色。结果:培养3代的脐血间充质干细胞经全反式维甲酸和成纤维细胞生长因子诱导后发生形态改变,呈双极或多极的神经元样形态,诱导5 d时神经元特异性烯醇化酶表达率为(30.3±5.2)％,而诱导10 d时达到(53．9±6.5)％,二者差异有统计学意义(P<0．05),不表达胶质纤维酸性蛋白。结论:脐血间充质干细胞经成纤维细胞生长因子和全反式维甲酸体外诱导,能够分化为神经元样细胞。     

三种因子联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景:间充质干细胞的生物学特性及影响分化调控因子的研究认为,体外原代培养的间充质干细胞自然分化为肝细胞的比例较低,选择一种合适的诱导剂提高其分化为肝细胞的比例尤为必要.目的:以肝细胞生长因子、表皮生长因子及成纤维生长因子体外联合,验证其诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-08在潍坊医学院实验中心完成.材料:Sprague-Dawley大鼠40只,由潍坊医学院实验动物中心提供.方法:采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,取传至第3代细胞,设立2组:空白对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基;联合诱导组在此基础上,另加入10 μg/L成纤维生长因子、8 pg/L.肝细胞生长因子、8 μg/L表皮生长因子.主要观察指标:倒置显微镜观察诱导后细胞形态变化,免疫荧光染色观察甲胎蛋白及白蛋白的表达,PAS检测糖原的表达,靛青绿摄入情况,酶学检测谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的水平.结果:联合诱导组细胞呈多角形、卵圆形或圆形细胞的特征性改变,空白对照组骨髓间充质干细胞仍保持梭形或纺锤形.联合诱导组培养14 d可见白蛋白和甲胎蛋白免疫反应阳性细胞:诱导7 d时偶见PAS阳性细胞与靛青绿阳性细胞,随诱导时间延长,阳性细胞逐渐增多;诱导14 d时开始检测到谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的合成,21 d达高峰,之后下降.上述各指标空白对照组细胞均呈阴性.结论:成纤维生长因子、肝细胞生长因子与表皮生长因子体外联合应用,能够成功诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化.     

不同体积分数富血小板血浆对犬骨髓间充质干细胞增殖的影响

背景:间充质干细胞的增殖和分化与富血小板血浆中的血小板浓度密切相关,浓集倍数过小可能达不到应有效应,太大则对骨再生产生抑制作用.目的:观察不同体积分数的富血小板血浆对犬骨髓间充质干细胞增殖的影响.设计:细胞学体外观察.材料:健康12月龄雄性比格犬,由中南大学湘雅医学院实验动物部提供.方法:取生长良好的第5代犬骨髓间充质干细胞,调整细胞浓度至3×10~8L~(-1),以200μL/孔接种于96孔板,常规培养24 h后,弃原培养液及未贴附的细胞.取制备好的富血小板血浆凝胶,加入含青霉素、链霉素的无血清低糖DMEM培养基分别稀释成5%,6.25%,7.5%,8.75%,10%共5个体积分数,向上述96孔板中每孔加入200μL,放入培养箱内,并设立空白对照.主要观察指标:MTT法观察不同体积分数富血小板血浆对犬骨髓间充质干细胞增殖活性的影响.结果:与空白对照组比较,干预早期各体积分数的富血小板血浆组均可促进犬骨髓间充质干细胞增殖.随干预时间的延长,体积分数为8.75%,10%富血小板血浆组在第6天增殖速度开始呈缓慢上升,进入平台期;体积分数为5%,6.25%富血小板血浆组细胞数量呈快速增殖,尤以体积分数为6.25%富血小板血浆组为甚.结论:富血小板血浆可在干预早期显著促进犬骨髓间充质干细胞增殖,其增殖强度与富血小板血浆体积分数相关,低体积分数条件下普遍取得较佳的增殖效应.     

5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:骨髓基质干细胞具有扩增迅速、分化潜能广泛等特点,因此建立骨髓基质干细胞的体外定向诱导模型有利于组织工程学研究.目的:探讨应用5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化的可能性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-06/2008-06在辽宁医学院附属第一医院中心实验室完成.材料:SD大鼠20只,由辽宁医学院实验动物中心提供.5-氮胞苷为Sigma公司产品.方法:大鼠麻醉后,分离股骨和胫骨,全骨髓法+贴壁法分离培养骨髓基质干细胞,待细胞生长融合至90%后传代扩增.取P3代骨髓基质干细胞,以2×10~4/孔密度接种于24孔培养板,分别加入5,10,15,20 μmol/L 5-氮胞苷诱导培养,同时设立不加诱导剂的空白对照,诱导24 h后更换为正常培养液继续培养至3周.主要观察指标:细胞形态及生长曲线,诱导后细胞形态变化,诱导后细胞连接蛋白43和α-横纹肌肌动蛋白的表达.结果:①培养的骨髓基质干细胞大多呈梭形,有时可见细胞融合,P3代细胞接种后第1,2天为静止生长期,从第3天开始进入对数生长期,第9天达高峰,以后进入平台期,第12天细胞数量开始减少.②5 μmol/L 5-氮胞苷诱导后,骨髓基质干细胞形态无明显变化;10 μmol/L 5-氮胞苷诱导后骨髓基质干细胞变长,宽大,并朝一个方向延伸,具有肌管形成细胞的形态特点;15 μmol/L 5-氮胞苷诱导后,24孔板周边区有少量细胞存活;20 μmol/L 5-氮胞苷诱导后细胞死亡.③经10 μmol/L5-氮胞苷诱导3周后.骨髓基质干细胞胞浆内可见连接蛋白43和α-横纹肌肌动蛋白的表达;空白对照组均呈阴性表达.结论:骨髓基质干细胞自身无法向心肌细胞方向转化,体外经5-氮胞苷诱导后具有向心肌细胞分化的潜能.5-氮胞苷浓度过低不能起到诱导分化作用,浓度过高则会造成细胞大量死亡,10 μmol/L为较适宜的诱导浓度.     

不同种类超顺磁性氧化铁标记猪骨髓间充质干细胞的体外MR成像

背景:干细胞磁性标记是新近开展的一项干细胞体外标记技术,结合MR成像设备可以活体监控移植入体内的干细胞.目的:明确超顺磁性氧化铁粒子体外标记猪骨髓间充质干细胞的方法、不同种类超顺磁性氧化铁标记细胞经MR成像的特征及可成像的最低标记细胞量.设计、时间及地点:对比观察,于2006-09/2007-03在苏州大学医学部心血管外科实验室及苏州大学附属第一医院影像中心完成.材料:猪髂骨骨髓由太湖梅山猪新鲜采集:超顺磁性氧化铁纳米颗粒为德国Schering公司产品;超微型超顺磁性氧化铁纳米颗粒由苏州大学化学与化工学院提供:铁颗粒晶核表面包被葡聚糖,3种超微型超顺磁性氧化铁包被葡聚糖后根据颗粒大小(12,15,20 nm)分别依次简称为1#,2#,3#.方法:分离、纯化、培养猪骨髓间充质干细胞,体外进行不同种类超顺磁性氧化铁标记,染色及荧光显微镜观察;测量并绘制未标记细胞和标记细胞的MTT生长曲线;选取不同的细胞量组(Feridex标记细胞分别选取1×106、5×105及1×105L-1量组,未标记细胞选取5×105L-1量组,1#、2#及3#超微型超顺磁性氧化铁标记细胞均选取5×105L-1量组)进行标记后MR成像,测量不同扫描序列标记细胞管的信号强度改变,并进行统计学分析.主要观察指标:超顺磁性氧化铁标记干细胞的普鲁士蓝染色检测标记率:标记干细胞的MTT生长曲线;双染色法检测细胞凋亡;不同Ependoff管内细胞团T1WI、T2WI和FFE图像的信号强度.结果:应用多聚赖氨酸介导干细胞磁标记方法标记骨髓间充质干细胞有效率为100%,普鲁士蓝染色见细胞浆内有多少不等的蓝染铁颗粒;超顺磁性氧化铁标记的间充质干细胞在T2WI尤其是FFE(T2WI)序列信号明显降低;在25 mg/L Fe培养液标记浓度下,MR成像的最低细胞量为1×105;在不同种类超顺磁性氧化铁标记下,2#、3#USPIO与Feridex在T2WI及T2*WI上有显著性差异(P<0.01);而1#USPIO与Feridex在T2WI及T2WI上差异无显著性意义(P>0.05):Feridex标记间充质干细胞在T2WI及T2WI上与T1WI相比,差异均有显著性意义(P<0.01).结论:超顺磁性氧化铁可以简便标记间充质干细胞并且在适当浓度下对间充质干细胞的生物学活性没有影响,MR T2WI和T2*WI序列可敏感显像磁性标记的干细胞.     

胚胎源脊髓组织诱导骨髓间质干细胞向神经元样细胞的分化

背景:研究发现骨髓间质干细胞在体外专门的诱导体系中能产生类似神经元烯醇化酶克隆球样神经球结构,故骨髓间质干细胞成为中枢神经损伤修复种子细胞的热门候选。目的:观察体外分化体系诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的情况。设计:观察性实验。单位:深圳市第二人民医院脊柱外科。材料:选用孕16d及2月龄的SD大鼠,由华中科大同济医学院动物中心提供。神经元烯醇化酶单抗、胶质纤维酸性蛋白多抗、神经中丝蛋白单抗均购自武汉博士德公司。方法:实验于2006-09在华中科技大学同济医学院基础医学部免疫室开放实验室及本院中心实验室完成。取大鼠下肢骨,离心分离鼠骨髓间质干细胞。提取孕16d大鼠胚胎脊髓组织匀浆,制备诱导液,诱导骨髓间质干细胞的分化。另取胚胎肌组织同法制备肌组织匀浆作对照。主要观察指标:对诱导后骨髓间质干细胞进行形态学观察及用抗神经元烯醇化酶、NF200、抗胶质纤维酸性蛋白分别标记神经元,星形胶质细胞。反应阳性诱导细胞免疫组化染色后光镜下随机数取10个非重叠视野进行观察,计算神经元烯醇化酶和神经中丝蛋白阳性细胞占总细胞数的比例。结果:①大鼠骨髓间质干细胞在诱导后细胞形态变化:诱导早期光镜下即见部分细胞胞体回缩,突起变长,变细;逐渐出现分化细胞突起生长,并相互交织,类似神经细胞,有的分支类似树突状分枝,对照组细胞形态变化不大。②诱导1周后,骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化相关抗原表达情况:脊髓匀浆组多数细胞表现为神经元烯醇化酶和神经中丝蛋白阳性;少数细胞表达胶质纤维酸性蛋白,对照组无神经细胞抗体阳性染色出现。而对照组未见神经细胞抗原反应阳性。免疫组化发现分化细胞神经元烯醇化酶、神经中丝蛋白表达阳性率分别为(68±1.7)%,(76.2±2.9)%。结论:胚胎脊髓组织匀浆可诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

壳聚糖支架上骨髓间充质干细胞的浓度及黏附生长

背景:组织工程的研究重点是利用少量的细胞经体外培养、扩增后, 在一定环境下附着在三维多孔支架上并良好生长为后期的组织器官重建修复做好基础。目的:对不同浓度兔骨髓间充质干细胞复合至壳聚糖支架用于组织工程再生修复进行评价。方法:取 5×105脱乙酰度为 95%的壳聚糖粉末通过冷冻干燥法制备壳聚糖支架,取 1×106,1×107,1×108,1×109 L-1细胞体积各 100 μL复合至壳聚糖支架后 1,3,5,7,9 d 以光镜,扫描电镜,MTT 法观察骨髓间充质干细胞的生长与分裂增殖情况。结果与结论:壳聚糖海绵状多孔支架为 5 mm×5 mm×3 mm,孔径 190~380 μm,平均孔径 290 μm,孔相通性较好,空隙率为(84.00±4.62)%。细胞/支架共培养 72 h 后各浓度细胞组均可渗入壳聚糖支架多孔结构内黏附生长。1×107,1×108,1× 109 L-1浓度细胞组在支架上成蔟生长,部分细胞与支架融合。结果提示,1×107,1×108L-1组细胞更利于骨髓间充质干细胞在壳聚糖支架的黏附生长,用于组织再生修复。     

绿色荧光蛋白基因腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的实验

背景:以骨髓间充质干细胞作为种子细胞,把干细胞和基因治疗结合起来是研究中枢神经系统损伤和肿瘤治疗新的思路和趋势.目的:观察腺病毒载体绿色荧光蛋白基因(Ad-GFP)在兔骨髓问充质干细胞转染和表达的量效关系及对细胞生物学特性的影响,探讨用该载体构建基因修饰骨髓间充质干细胞的可行性.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-08/2009-03在南方医科大学完成.材料:新西兰大白兔,雌雄不拘,质量2.0-3.0 kg.方法:体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞免疫表型,293细胞包装制备病毒,以不同滴度的Ad.GFP(1×10~3～1×10~(10)PFU/mL)转染骨髓间充质干细胞,细胞计数法分析转染率.主要观察指标:倒置显微镜观察细胞形态学改变,CCK8法检测细胞增殖活性,用血清撤离加入β-巯基乙醇诱导感染Ad-GFPBMSCs向神经样细胞的定向分化.结果:3-6代骨髓间充质干细胞表面标志CD34、CD45阴性,而CD29、CD44阳性.当病毒滴度为1×10~7PFU/mL时感染率为55%,1×10~9,1 ×10~(10)PFU/mL感染率均为85%,但1×10~(10)PFU/mL时出现细胞病理现象,7 d荧光表达最强,28 d仍可见荧光表达.感染Ad-GFP的骨髓间充质干细胞经β-巯基乙醇诱导可分化为神经元样细胞,神经元特异性烯醇化酶表达阳性.结论:合适滴度的Ad-GFP可以高效感染骨髓间充质干细胞,对细胞的生物学特性影响较小,不影响诱导分化功能,骨髓间充质干细胞可以作为Ad-GFP载体系统进行基因治疗研究的种子细胞.     

外源性碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肌源性干细胞增殖的影响

背景:肌源性干细胞在体外培养过程中存在纯化、扩增、定向分化等难题,碱性成纤维细胞生长因子作为生物活性因子的一员,因其生物活性的多效性而备受关注.目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肌源性干细胞体外增殖的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-04/07在沈阳医学院完成.材料:健康雄性Wister大鼠5只,由沈阳医学院实验动物中心提供.碱性成纤维细胞生长因子为珠海生物制品有限公司产品.方法:无菌条件下取大鼠左前肢肱三头肌,采用酶消化法分离肌源性干细胞,应用密度梯度离心法和差速贴壁法进行纯化.取第2代肌源性干细胞,分别用终浓度为6.25,12.50,25.00,50.00,100.00μg/L碱性成纤维细胞生长因子进行干预;以单纯加入200 μL生长培养基作为空白对照组,以加入200μL生长培养基+肌源性干细胞作为阴性对照组.分别于培养24,48,72,96 h加入MTT溶液.主要观察指标:免疫细胞化学法鉴定大鼠肌源性干细胞,MTT比色法检测细胞增殖情况.结果:肌源性干细胞多呈Sca-1阳性反应,少数呈Desmin阳性反应.①不同浓度碱性成纤维细胞生长因子对肌源性干细胞的促增殖效应:与阴性对照组比较,各浓度碱性成纤维细胞生长因子组对肌源性干细胞均有明显的促增殖效应(P<0.05);浓度为6.25-50.00 μg/L时促增殖作用随其质量浓度升高而显著增强(P<0.01),至50.00 μg/L时其促增殖作用接近顶峰.②碱性成纤维细胞生长因子在不同培养时间点对肌源性干细胞的促增殖效应:随培养时间的延长肌源性干细胞明显增殖,与阴性对照组比较,碱性成纤维细胞生长因子组出现显著促增殖效应(P<0.01)的时间为培养96 h.结论:碱性成纤维细胞生长因子可促进体外培养的大鼠肌源性干细胞增殖,且呈浓度一时间依赖性增加,50.00 μg/L与96 h为较佳的体外培养质量浓度和时间.     

5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷标记大鼠骨髓间充质干细胞的有效性

背景：深入准确地研究骨髓间充质干细胞在体内外增殖、分化的规律,寻找安全、有效、灵敏度高、特异性强、简便的标记活细胞的方法至关重要。目的：探索5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的有效性及对其增殖能力的影响。方法：全骨髓贴壁法培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞至第3代。将细胞以5×107L-1浓度接种于96孔板中,掺入法加入终浓度为0,10,20,50μmol/L5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷,分别在培养24,48和72h检测5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷标记细胞的阳性率、标记后的细胞形态,并绘制标记细胞的生长曲线。结果与结论：各浓度组标记率均随标记时间延长而升高（P〈0.05）;各时间点标记率随标记浓度的升高而增加,但其差别无显著性意义（P〉0.05）。10μmol/L5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶标记骨髓间充质干细胞72h即可获得良好的标记率。标记前后各组间充质干细胞生长曲线均呈＂S＂形。说明在实验浓度范围内应用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷体外标记骨髓间充质干细胞有效,不影响细胞的增殖,且10μmol/L5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞72h即可获得良好的标记率。