DNA介导免疫的研究进展

DNA介导免疫是指将质粒DNA导入动物组织后，质粒DNA原位表达并产生特异的体液和细胞免疫应答。目前主要应用的基因导入方法是质粒DNA直接注射骨骼肌，并可在质粒DNA注射前应用再生诱导剂提高导入基因的蛋白表达水平以增强免疫效果。DNA介导免疫多被应用于抗感染免疫研制成核酸疫苗。     

乙肝表面抗原核酸疫苗在小鼠体内的阳性表达

目的 :用乙肝表面抗原核酸疫苗免疫小鼠 ,探讨其在体内的表达。方法 :用含乙肝表面抗原基因的质粒载体肌注小鼠 ,免疫组化法检测HBsAg在注射部位肌组织、局部淋巴结、脾脏的表达 ;进一步用ELISA法检测血清中抗HBsAg抗体 ;脾淋巴细胞特异及非特异性增殖试验。结果 :一次免疫后 ,在注射部位肌组织可见HBsAg阳性表达 ;二次免疫后 ,在脾、局部淋巴结可见HBsAg阳性染色。血清抗体出现阳性 ;特异性抗原及ConA均可刺激脾淋巴细胞增殖。结论 :乙肝核酸疫苗肌注小鼠后 ,在骨骼肌、淋巴结、脾脏组织中HBsAg呈阳性表达 ,并出现了一定免疫应答效应。     

脂质体介导弓形虫SAG1与SAG3复合基因诱导小鼠免疫应答研究

目的评价弓形虫SAG1与SAG3基因真核表达质粒DNA免疫小鼠的免疫应答效果。方法以PCR方法扩增出SAG1与SAG3目的基因片段,并插入载体pEGFP-N3以构建重组质粒pE- SAG1／SAG3,瞬时转染细胞Cos-7。质粒pESAG1／SAG3以10μg剂量,脂质体介导肌肉注射BALB／c小鼠,免疫3次,最后一次免疫后4周,观察体液和细胞免疫。RT-PCR方法检测注射部位目的基因的转录;斑点杂交方法检测目的基因是否与小鼠染色体基因组整合。结果质粒pESAG1／SAG3转染细胞后观察到绿色荧光;Western blot显示pESAG1/SAG3表达识别条带在相对分子质量(Mr)66．2×103附近。小鼠免疫后,血清产生抗弓形虫速殖子抗体,诱导IFN-γ及IL-2水平高于对照组。RT-PCR显示首次免疫15 d后,目的基因在肌肉组织中仍有转录,斑点杂交显示目的基因未与小鼠的基因组发生整合,混合质粒注射的小鼠抗弓形虫感染的存活时间延长。结论脂质体介导弓形虫SAG1与SAG3复合编码基因质粒接种小鼠能明显诱导体液和细胞免疫应答。     

以TF为靶点的裸DNA疫苗脾内转染对结直肠癌的免疫抑制作用

目的:探讨以组织因子(tissue factor,TF)为靶点的裸DNA疫苗pγ1.Ig H.SPTT重组质粒脾内单次注射对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的免疫抑制作用。方法:采用分子生物学技术构建携带TF靶向肽SPTT和免疫球蛋白H链基因的裸DNA质粒pγ1.Ig H.SPTT,质粒脾内单次注射后,检测外周血转基因产物SPTT-Ig H浓度,分析质粒脾内转染效率、特性及其对CRC的作用。结果:重组pγ1.Ig H.SPTT质粒脾内单次注射后第4周脾组织即有SPTT-Ig H融合基因强表达,12周强度开始下降,至16周消失;转染质粒后第2周外周血SPTT-Ig H浓度为7.2μg/L,后逐渐升高,第8周达高峰为13.11μg/L;质粒脾内注射后转录基因定向在脾组织表达,淋巴结、骨髓、肝、肾、等组织未发现目的基因转染;pγ1.Ig H.SPTT重组质粒脾内转染对结直肠癌具有抑制作用(P0.01)。结论:以TF为靶点的裸DNA疫苗pγ1.Ig H.SPTT单次脾内注射可以激发机体对结直肠癌的保护性免疫反应,是治疗CRC的一种安全有效的免疫方法。本课题研究为裸DNA疫苗抗肿瘤免疫治疗提供了新的思路。     

猪囊尾蚴保护性抗原cC1的疫苗研究

囊虫病是由猪带绦虫幼虫-囊尾蚴寄生于人和猪体引起的人、畜共患病,在我国囊虫病也有广泛的流行区域.抗原cC1是以囊虫病患者、病猪血清为探针从猪囊尾蚴cDNA文库中筛选出的具有高度特异性的人、猪共同抗原[1].以抗原cC1为目的基因构建了含有全长cC1 cDNA的重组质粒p3-cC1,同时制备并纯化了重组抗原cC1,以p3-cC1为DNA疫苗,cC1蛋白加弗氏佐剂为抗原佐剂疫苗,用这两种不同形式的疫苗免疫接种小鼠观察免疫应答.     

IL-18和HIV-1 gag-gp120嵌合基因DNA疫苗联合免疫小鼠的免疫应答

目的 :探讨IL 18和HIV 1gag gp12 0嵌合基因的DNA疫苗联合免疫小鼠的免疫应答。方法 :构建含IL 18的真核表达质粒pVAXIL18,将他与表达HIV 1gag gp12 0嵌合基因的核酸疫苗质粒pVAXGE共同肌注免疫BALB/c小鼠 ,检测免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体滴度。结果 :联合免疫组小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体水平均显著高于单独免疫组 (P <0 .0 5 ) ,空白质粒对照组 (P <0 .0 1)和PBS对照组 (P <0 .0 1)。结论 :IL 18和HIV 1gag gp12 0嵌合基因的DNA疫苗联合免疫可诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫 ,且IL 18发挥了免疫佐剂的作用。     

信号肽与猪链球菌GDH融合的DNA疫苗构建及体液免疫研究

目的 设计、构建猪链球菌GDH真核表达载体并研究DNA疫苗免疫小鼠的体液免疫.方法 在猪链球菌保护性抗原GDH基因5'末端引入人IL-2信号肽序列,通过PCR进行拼接,得到的融合DNA片段经过酶切克隆入质粒pcDNA3.0,构建核酸疫苗重组质粒pcDNA3.0-gdh.通过肌肉注射途径将重组质粒pcDNA3.0-gdh免疫小鼠,经ELASA实验和Western blot进行检验.结果 构建的表达载体在小鼠体内表达出正确的目的 蛋白,能诱导体液免疫.结论 构建的DNA疫苗能够引起体液免疫,为研究猪链球菌核酸疫苗提供分子工具.     

中国强毒钩端螺旋体膜蛋白基因的真核表达及基因免疫

目的　检测含有强毒赖型钩体OmpL1外膜蛋白基因的 2个重组质粒pBC OmpL1和pcDNA3 OmpL1在哺乳动物细胞中的表达 ,及其作为DNA疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效果。方法　采用脂质体转染法 ,以重组质粒转染COS7细胞 ,通过抗性标志筛选稳定转染入质粒的细胞 ,RT PCR和Westernblot检测被转染细胞OmpL1基因的表达情况。然后 ,将重组质粒以肌注法免疫BALB c小鼠 ,每 2周 1次 ,共 3次 ,ELISA检测小鼠的体液免疫应答水平。结果　RT PCR结果显示 ,重组质粒转染组在约 1kb处出现特异的扩增带 ;Westernblot检测显示 ,重组质粒转染组总蛋白样品在相对分子质量 (Mr)为 33.5× 10 3 处出现特异的蛋白带 ,而空质粒载体转染组均没有此相应的DNA或蛋白质条带。两质粒第 2次免疫小鼠 2周后 ,10 0 μg重组质粒pBC OmpL1和pcDNA3 OmpL1DNA免疫组产生了效价为 1 196 83的高滴度抗体 ,注射 5 0 μgpcDNA3 OmpL1+5 0 μgpcDNA3的小鼠产生滴度为 1 6 5 6 1较高的抗体 ,第 3次免疫 2周后 ,抗体水平下降。结论　两重组质粒者均能在体外培养的哺乳动物细胞中表达钩体OmpL1蛋白质 ,以其免疫小鼠后 ,均诱导产生高滴度的特异性抗体 ,其效价与全钩体疫苗相当。     

034 核酸疫苗抗原提呈机理研究进展

核酸疫苗即是将外源基因克隆到真核质粒表达载体上,然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内,使外源基因在活体内表达、产生抗原激活机体免疫系统,引起免疫反应.核酸疫苗为疫苗的研制提供了新的方法,但其引起的免疫机理尚不十分清楚.本文仅就核酸疫苗不同的免疫方式,包括皮内、肌肉和粘膜接种所涉及的抗原提呈机理作一综述.     

赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的真核表达及基因免疫

目的 在哺乳动物细胞中表达含有赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的重组质粒,并检测其作为DNA疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效果.方法 以赖型钩端螺旋体全基因组为模板,PCR扩增出目的基因HlyX,以质粒pcDNA3.1为载体,双酶切构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,双酶切、PCR及测序鉴定重组质粒.将构建成功的重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Western blot鉴定目的基因的表达.将重组质粒免疫BALB/c小鼠,每两周1次,共3次,ELISA法检测小鼠的体液免疫应答水平.结果 扩增出全长约1100 bp的HlyX基因,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定表明重组质粒构建成功.RT-PCR检测显示重组质粒转染组能扩增出约1100 bp的目的基因片段,Western blot分析可见在相对分子质量(Mr)40×103左右出现特异性的目的条带.DNA免疫后诱导小鼠产生了较高的抗体水平(1∶6561～1∶19 683).结论 赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX真核表达质粒能够诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体,为其作为钩体DNA疫苗的研究和开发奠定了基础.