骨髓间充质干细胞体外分离技术探讨

骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离，所使用的细胞分离液多为Percoll。我科自2002年至今多次对大鼠股骨、胫骨、骨髓腔骨髓干细胞进行抽取和分离，并采用不同的分离液（percoll和ficoll），分别对两种分离液进行离散密度，离心时间、速度、温度、培养基成份等各种条件下的实验研究，现将结果报道如下。     

成人骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的 对成人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)进行体外分离培养与鉴定,研究其生物学特性.方法 将密度梯度离心法获得的单个核细胞,用贴壁培养法分离纯化、扩增获得大量hBMSCs,观察细胞形态,分析细胞生长特性,并经流式细胞仪检测细胞表面抗原、细胞周期,和进行成骨诱导鉴定.结果 经密度梯度离心和贴壁培养法可成功分离纯化、扩增得到大量hBMSCs,其细胞形态、分化特性和表型均符合干细胞特点,在特定培养条件下能向成骨细胞分化.结论 骨髓间充质干细胞分离扩增容易,细胞增殖能力和成骨性能好,是骨组织工程理想的种子细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及初步鉴定

目的 探讨体外培养大鼠骨髓间充质干细胞的可行性,分析其部分表型特点,为细胞移植治疗中枢神经系统疾病奠定基础.方法 采用贴壁筛选法分离纯化大鼠MSCs,进行培养,传代扩增,免疫组化鉴定细胞是否表达具有干细胞特性的标记抗原-神经巢蛋白(nestin),并用流式细胞仪进行荧光检测初步鉴定.结果 分离后的MSCs出现增殖性生长,免疫组化显示巢蛋白(nestin)表达阳性,经流式细胞仪检测显示CD44,CD90阳性,CD45阴性.结论 在体外可培养出较大丰度大鼠骨髓间充质干细胞,而且此方法简单易行.     

胎盘间充质干细胞与骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性研究

目的探讨兔胎盘间充质干细胞(placenta-derived mesenchymal stem cells,PMSCs)和兔骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived MSCs,BMSCs)体外分离培养、增殖,对其生物学性状进行比较观察。方法取足月待产新西兰大耳白兔1只,采用密度梯度离心法及贴壁培养技术从兔胎盘对PMSCs进行分离、纯化和传代培养。取2周龄新西兰大耳白兔1只,采用直接贴壁法从后肢骨髓中对BMSCs进行分离、纯化和传代培养。用倒置相差显微镜观察两种细胞形态。免疫组织化学染色对第3代细胞表面标志(CD44、CD105、CD34、CD40L)进行鉴定。将BMSCs与PMSCs第2代细胞分别与生物衍生骨进行复合培养5d,每条材料接种(1.0~1.5)×106个细胞,苏木素染色观察细胞与材料复合培养情况。扫描电镜观察两种细胞分别与材料复合培养3d和8d的情况。结果在倒置相差显微镜下观察,两种细胞均为贴壁生长,形态为均一成纤维细胞样。PMSCs增殖力强,细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降,细胞体外培养10代后,生长速度减慢。两种细胞均表达CD44、CD105,不表达CD34、CD40L。复合培养5d,PMSCs和BMSCs在生物衍生骨表面生长,大量黏附,细胞积聚成团,相互连接成网状,孔隙内也可见细胞生长和增殖,并分泌基质。扫描电镜观察:复合培养3d,可见较多量的细胞在生物衍生骨上黏附,呈梭形或多角形;8d两种细胞均已大量增长,呈层状排列,细胞连接紧密,分泌大量基质,细胞周围有较多的网状胶原形成。结论PMSCs与BMSCs有相似的生物学特性,可作为组织工程的另一成体干细胞来源。     

体外培养对骨髓间充质干细胞凋亡的影响

目的 :研究成人骨髓间充质干细胞在体外培养条件下 ,传代次数与细胞凋亡的关系。方法 :采用An nexinV/PI双染色法 ,在流式细胞仪上检测不同传代数的成人骨髓间充质干细胞的凋亡情况。结果 :传代次数越多 ,骨髓间充质干细胞的凋亡率及死亡率越高 ,存活的正常细胞越少。结论 :第 4代以内的细胞增殖能力强 ,凋亡率低 ,适宜于组织工程研究     

大鼠骨髓间充质干细胞作为滋养层培养小鼠胚胎干细胞

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)作为滋养层体外培养小鼠胚胎干细胞(embryonic stemcells ESCs)的可能。方法:收集BALB/C小鼠3·5d胎龄的囊胚,接种于大鼠骨髓间充质干细胞的滋养层上,培养5~6d后挑取胚胎干细胞集落,胰酶消化传代。观察细胞集落生长情况,通过碱性磷酸酶染色、细胞核型分析对细胞生物学特性进行检测。结果:ES细胞呈集落性生长,碱性磷酸酶组织化学染色阳性,具有正常核型及多向分化潜能。结论:大鼠MSCs可以作为滋养层体外培养小鼠胚胎干细胞,并能保持未分化状态。     

成人骨髓间充质干细胞体外低氧培养及生物学特征

目的建立人骨髓间充质干细胞（human marrow mesenchymal stem cells,hMSCs）体外低氧培养及向成骨细胞分化的生物模型,研究其生物学特征,为骨组织工程提供实验依据。方法采用人淋巴细胞分离液分离健康成人hMSCs,DMEM-LG（含20%胎牛血清）中培养,10～14d后传代培养。取第2代细胞,根据培养氧浓度及培养基类型分为4组：正常氧组（20%O2加DMEM-LG,A组）、低氧组（1%O2加DMEM-LG,B组）、正常氧成骨诱导组（20%O2加条件培养基,C组）及低氧成骨诱导组（1%O2加条件培养基,D组）,通过细胞计数、细胞增殖测定（MTT法）、集落形成检测、RT-PCR检测、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性检测及茜素红染色,研究低氧环境对hMSCs生物学行为的影响。结果与A组相比,B组及D组中的hMSCs有较高的增殖速度,并且不受条件培养基的影响,比较差异有统计学意义（P〈0.01）。B组中的hMSCs生成的集落逐渐增多,A组9d后生成的集落数基本不发生变化。D组培养的hMSCs的ALP活性逐渐增高,但明显低于C组,两者差异有统计学意义（P〈0.01）。定量RT-PCR检测,C组ALP、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白及骨粘连蛋白mRNA表达量明显增加（P〈0.01）。培养4周后,与其他3组相比,C组可见到明显的钙盐沉积和染成红色的钙结节。结论低氧使hMSCs增殖率增加,集落形成能力增强,抑制向成骨细胞分化。     

体外培养对人骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

目的了解体外培养对人骨髓间充质干细胞(MSCs)生物学行为的影响。方法MSCs来自5个不同个体。体外培养扩增传代后。取2代细胞6份、3代细胞9份、9代细胞2份进行形态学观察和细胞周期检测;取1代细胞2份、2代细胞3份、3至6代细胞各1份进行刀豆蛋白A(ConA)凝集试验;另取第3、9代细胞各1份,接种于严重联合免疫缺陷小鼠,分别在接种后第1、2、3、4周进行大体观察并取接种部位组织进行显微镜下观察。结果随着体外培养时间增加,细胞增殖变缓,体积变大。S期细胞数增高,G0～G1期细胞数减少。但所有检测细胞均为二倍体。ConA试验均未发现细胞凝集。不同培养时间细胞皮下接种均未见有炎性细胞浸润,但局部有胶原组织形成,至第4周消失。结论长期体外培养,细胞增殖能力降低,但并不会引起培养细胞发生恶性变。     

骨髓间充质干细胞及其临床应用

间充质干细胞（MSCs）是广泛存在于人体各组织中的一种成体干细胞，其中骨髓中含量最为丰富。MSCs具有多向分化潜能，不但可以分化为多种中胚层来源的细胞，如成骨细胞和成软骨细胞等，还可以分化为其他胚层来源的细胞，如神经细胞和肾脏细胞等。由于MSCs来源广泛、易于分离培养、能长期存活、不易引起免疫排斥和易于基因转染等特点，使其成为细胞治疗和基因治疗的种子细胞，具有广泛的科研和临床应用价值。     

体外诱导糖尿病鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮样细胞分化的研究

目的 观察链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外培养方法和向血管内皮样细胞分化的能力.方法 利用密度梯度离心分离和贴壁培养相结合的方法从STZ诱导的糖尿病大鼠骨髓中提纯单个核细胞,体外扩增3代,倒置显微镜观察细胞生长及形态,流式细胞仪检测BMSCs表面抗原表达.取扩增第3代的BMSCs,分为2组,诱导组加入诱导培养剂[含10％胎牛血清、10μg/L血管内皮生长因子(VEGF)、2μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素的M199培养基]中诱导分化,对照组则不加任何细胞因子.2周后行细胞形态学观察,免疫细胞化学法检测VEGF受体(VEGFR)-2表达,流式细胞仪测定CD34表达量,紫外线分光光度法测定一氧化碳(NO)含量,电镜观测胞质WeibelPalade小体.结果 STZ腹腔注射可诱导糖尿病大鼠模型.流式细胞仪显示第3代BMSCs表达表面抗原:CD44和CD90阳性细胞表达率分别为(97.8±0.9)％和(96.8±1.4)％,而CD11 b/c和CD34阳性细胞表达率分别为(13.2±0.6)％和(1.2±0.5)％.诱导组大部分细胞形态变化不明显,呈长梭形、杆状、多角形,诱导组VEGFR-2、CD34阳性表达率分别为(97.1±1.0)％和(65.0±3.9)％,而对照组则为(7.0±1.0)％和(0.9±0.3)％,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);诱导组胞外NO含量(94.14±3.25) μmol/L亦明显高于对照组(70.37±2.10) μmol/L(P ＜0.05);电镜两组均未观察到胞质Weibel Palade小体.结论 经密度梯度离心分离和贴壁培养相结合的方法可从骨髓中提纯BMSCs.糖尿病鼠BMSCs可在体外诱导向血管内皮样细胞方向分化,BMSCs有望作为治疗糖尿病下肢缺血性疾病的种子细胞.     

诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的体外研究

目的 探讨转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF—β1）、胰岛素样生长因子1（insulinlike growth factor1，IGF-1）在诱导骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem ceils，MSCs）向软骨细胞分化过程中的相互作用，并研究细胞密度对MSCs向软骨细胞分化的影响。方法 取健康昆明种小白鼠骨髓，用全骨髓贴壁法筛选获得MSCs，体外培养传代。采用特定的诱导培养使MSCs向软骨细胞分化，按培养基内添加生长因子的不同分成3个实验组和对照组。实验组分别为：TGF—β1＋IGF-1联合应用组（TGF—β1 10ng／ml、IGF-1 50ng／m1）；TGF—β1单独应用组（TGF—β1 10ng／m1）；IGF-1单独应用组（IGF-1 50ng／m1）；对照组不添加任何生长因子。TGF—β1＋IGF-1联合应用组于诱导14d和21d，分别进行甲苯胺蓝染色及免疫荧光双染法鉴定；于诱导7、14和21d各组分别提取诱导细胞总RNA，进行RT—PCR扩增，检测TGF—β1、IGF-1对诱导细胞Ⅱ型胶原表达量的影响；比较MSCs在平板培养及细胞团培养时，Ⅱ型胶原表达量的差异。结果TGF—β1＋IGF-1联合应用组诱导培养14d，诱导软骨细胞甲苯胺蓝染色呈阳性，免疫荧光染色可见诱导软骨细胞的细胞外基质含有Ⅱ型胶原。各组基因扩增产物的凝胶电泳可见，TGF—β1＋IGF-1联合应用组和TGF—β1单独应用组Ⅱ型胶原扩增片段呈阳性；IGF-1单独应用组和对照组，未见Ⅱ型胶原扩增条带；凝胶成像系统灰度扫描示Ⅱ型胶原表达量TGF—β1＋IGF-1联合应用组各时间点均比TGF—β1单独应用组明显增加（P〈0．05）。细胞团培养模式下，诱导细胞表达Ⅱ型胶原比平板培养模式更加显著。结论 MSCs向软骨细胞诱导分化时，IGF-1对TGF—β1有明显的促进作用；细胞培养密度提高有利于MSCs成软骨细胞表型。     

鹿茸多肽对软骨表型化骨髓间充质干细胞凋亡的影响

目的 通过观察鹿茸多肽对白细胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）诱导软骨表型化骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）凋亡的影响，以优化软骨组织工程的种子细胞。方法新西兰大白兔2只，抽取其骨髓；经密度梯度离心得到单核细胞，经体外分离、培养获得兔MSCs。用转化生长因子β1（transforming growth factorp β1，TGF-β1）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）将其诱导分化软骨表型。将软骨表型化MSCs随机分成A组（空白对照组）：5％胎牛血清的α-MEM培养液；B组（IL-1β组）：5％胎牛血清的α-MEM培养液加入100ngIL-1β；C组（鹿茸多肽组）：5％胎牛血清的α-MEM培养液加入10μg／ml鹿茸多肽作用3d后再加入100ng IL-1β；D组（TGF-β1组）：5％胎牛血清的α-MEM培养液加入10ng／ml TGF-β1作用3d后再加入100ng IL-1β。分别于培养24、48和72h后取样，采用透射电镜观察细胞形态，Annexin V法检测细胞凋亡率，RT-PCR技术分析Caspase-3 mRNA表达水平，ELISA法检测Caspase-3蛋白酶活性。结果透射电镜观察：B组24h后细胞核内染色质开始呈块状凝集，分布于核膜下，核膜不规则；48h后细胞核内染色质凝集加剧；72h后部分细胞内的核碎片凝集成凋亡小体。各时间点C、D组细胞结构改变相对滞后，且数量较少；A组细胞结构几乎无明显改变。各时间点B组MSCs凋亡率、Caspase-3 mRNA表达及蛋白酶活性逐渐增高，与A组比较差异有统计学意义（P〈0．01）；C、D组与B组比较则逐渐下降，且差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 Caspase-3参与MSCs凋亡，鹿茸多肽通过减少Caspase-3 mRNA表达，并抑制其蛋白酶活性，阻止或逆转软骨表型化MSCs凋亡。     

成人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的研究

目的研究成人骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）体外分化为血管内皮细胞的能力并探讨其诱导条件。方法分离成人骨髓单个核细胞，经贴壁法获取MSCs。所获细胞分4组进行诱导：组1、2以5×10^3／cm^2细胞密度接分别接种于含2％和15％胎牛血清的L—DMEM培养基；组3、4以5×10^4／cm^2细胞密度分别接种于上述两种血清浓度的培养基，各组细胞经血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）辅以牛脑提取物的诱导，对照组为正常传代培养的MSCs。在诱导的第14、21天分别测定表面分子CD34、VEGFR-2、CD31和Ⅶ因子相关抗原（factor Ⅷ—related antigen，又称von Willebrand factor，vWF）以及体外成血管实验对分化细胞进行鉴定，同时测定不同诱导条件下的细胞增殖指数（proliferation index，PI）。结果组3细胞经诱导后，内皮系表面分子CD34、VEGFR-2、CD31、vWF于第14天均有不同程度表达，分别为8．5％、12．0％、40．0％、30．0％．其中CD34、VEGFR-2在第21天表达上调，为15．5％、20．0％，余各诱导组细胞未表达上述表面分子；诱导后的组3细胞呈低增殖状态（PI值约为10．4％），在半固体培养基中还可形成血管腔样结构。结论从成人骨髓中分离培养的MSCs，在较高细胞接种密度和低增殖状态下，经VEGF、牛脑垂体提取物诱导后，可分化为血管内皮细胞，可作为治疗性血管生成及组织工程理想的种子细胞。     

人骨髓间质干细胞的优化培养

目的探索人骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的优化培养条件.方法应用不同条件,研究原代培养方法、接种密度、首次换液时间、培养基、血清浓度及种类对细胞生长的影响,并以选定的条件培养、扩增MSCs,扩增后向成骨细胞和软骨细胞诱导.结果在其它条件不变的前提下,密度梯度分离法优于全骨髓法,2.5×105/cm2是人MSCs原代培养的适宜接种密度,原代第5天首次换液为最佳换液时间,DMEM培养基优于α-MEM培养基,血清C为适宜的血清,10%为适宜的血清浓度.所选条件培养的MSCs可在体外扩增15代以上,形态保持不变,并具有良好的分化潜能.结论建立了人MSCs的体外优化培养条件,为其在组织工程方面的应用作出了新的探索.     

骨髓间充质干细胞在肌组织局部成肌分化的实验研究

目的 探讨骨髓问充质干细胞(marrow mesenchmal stem cells，MSCs)移植至肌肉组织后的原位成肌分化情况。方法 以BalB／C雌性小鼠36只，建立放射损伤合并创伤(切割伤 冻伤)的严重肌损伤模型，再将分离扩增的雄性小鼠的单纯MSCs及经10μmol／L 5-氮杂胞苷(5-azacytidine，5-Aza—CR)诱导24h的MSCs以局部注射移植法，植入雌性小鼠正常肌肉组织和创伤后的肌肉组织，采用荧光标记的原位杂交法、免疫组织化学法在移植后1、3、6、9、12及15d检测植入的MSCs在肌肉组织原位的数量变化及成肌分化情况。结果 植入的MSCs数量随着时相延长而减少；单纯MSCs植入正常肌肉组织15d，5-Aza-CR诱导后的MSCs植入正常肌肉组织6d，可见MSCs分化为肌细胞，表达desmin阳性；5-Aza-CR诱导的MSCs植入损伤肌肉组织3d，单纯MSCs植入损伤肌肉组织6d，可见MSCs分化为肌细胞，表达desmin阳性。结论 MSCs局部移植至肌肉组织局部可实现成肌分化，但经5-Aza-CR诱导后的MSCs植入损伤肌肉组织的MSCs其成肌分化时相明显早于单纯MSCs植入正常肌组织的MSCs。     

骨形成蛋白2活性多肽体外定向诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的剂量依赖性研究

目的探讨自行合成的骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein2,BMP-2)活性多肽对大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)体外定向诱导成骨的能力,评价BMP-2活性多肽的成骨诱导性及诱导成骨的剂量依赖性。方法取4周龄Wistar大鼠分离培养MSCs,传至第3代时改用条件培养基,培养基中分别加入浓度为300、200、100、50及0μg/ml的BMP-2活性多肽,并依次记为A、B、C、D和E组。细胞培养至5、10、15及20d,检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,测定钙含量,采用实时荧光定量PCR(fluorescent quantitativePCR,FQ-PCR)检测型胶原、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)及骨钙素(osteocalcin,OCN)mRNA的表达,检测不同浓度BMP-2活性多肽体外诱导成骨的能力。结果倒置相差显微镜下观察,用条件培养基培养3～4d后,培养细胞由长梭形转变为短梭形或多角形。随条件培养基中BMP-2活性多肽浓度的增加,细胞发生成骨样改变的时间提前。ALP活性和钙含量检测显示,A组和B组较其他组增加明显,且差异有统计学意义(P<0.05),但A、B组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。FQ-PCR检测发现不同浓度条件培养基培养14d后,型胶原、OPN和OCN mRNA在各组均有表达。Ct值表明其表达量的大小顺序为A、B、C、D组,E组无表达,A组和B组的Ct值明显大于C组和D组,差异有统计学意义(P<0.05),但A组和B组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论BMP-2活性多肽能有效地促进MSCs向成骨方向分化,其诱导作用存在剂量依赖关系,最佳诱导剂量为200μg/ml。     

体外培养版纳微型猪近交系骨髓基质干细胞的生物学特性

目的　分离培养成年版纳微型猪近交系骨髓基质干细胞并探讨其体外生物学特性。方法　成年版纳微型猪骨髓基质干细胞通过密度梯度离心法分离获得 ,用含 15 %小牛血清的 DMEM在 37℃ ,5 % CO2 条件下培养 ;通过克隆生长特性、特异抗原表达和成骨分化能力鉴定其干细胞特性。结果　版纳微型猪近交系骨髓分离获得的基质干细胞具有多种形状 ,但主要为梭形。其具有很强的增殖能力 ,在体外培养条件下可以观察到明显的克隆样生长 ;表达 SH2、SH3、SH4、SB10和 SB2 1等骨髓基质干细胞的特异标记 ;经成骨添加剂诱导培养之后能分化为成骨细胞 ,碱性磷酸酶活性增强并具有细胞外基质矿化能力。结论　成年版纳微型猪近交系骨髓来源的基质干细胞具有干细胞的一般生物学特性     

骨髓间充质干细胞分化为皮肤附属器细胞的初步实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs)分化为创面皮肤附属器细胞的可能性,及其参与创面修复的可能机制。方法无菌条件下取Wistar大鼠股骨骨髓细胞,密度梯度离心分离、纯化MSCs,体外培养扩增后,用BrdU标记细胞。另于同种雄性Wistar大鼠背部正中,制备1cm×1cm全厚皮肤缺损创面模型,将BrdU标记的1×106/mlMSCs从阴茎静脉输注,术后第3天与第7天切取创面组织,行BrdU免疫组织化学单染色,以及BrdU和广谱角蛋白免疫组织化学双染色。结果BrdU阳性细胞出现在创面皮下组织、皮脂腺、毛囊和骨髓腔中。免疫组织化学双染色结果显示,皮脂腺和毛囊有BrdU阳性细胞,同时表达广谱角蛋白。结论创面愈合过程中,MSCs归巢并参与创面修复;在实验性全身皮肤缺损创面微环境下,MSCs可分化为皮肤附属器细胞。     

人骨髓间质干细胞库的初步建立

目的 探讨建立生物学性状稳定的人骨髓间质干细胞(human marrow mesenchymal stem cells，hMSCs)库的可行性，为组织工程种子细胞的来源作初步探索。方法对分离得到的hMSCs采用液氮低温冻存，并在一定时间复苏培养，以流式细胞仪检测其表面抗原，在诱导培养基中对其行成骨和成软骨诱导培养，光镜：电镜观察细胞的形态，采用组织化学、免疫组织化学及分子生物学的方法检测成骨和成软骨诱导的特异标志物：碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原及骨钙素，研究其生物学性状。结果从骨髓中分离得到了纯度达96％以上的hMSCs，复苏后的hMSCs形态和表面抗原保持不变，可继续扩增10代以上，倍增时间40h。复苏后第2、6、10代hMSCs均保持较强的向软骨细胞、成骨细胞的分化能力。结论初步建立了hMSCs库，可为骨及软骨组织工程提供较好的种子细胞。