p21和p27在兔晶状体上皮细胞中的表达

目的:研究细胞周期蛋白激酶抑制因子p21和p27蛋白在不同年龄段兔晶状体上皮细胞（lens epithelial cells,LECs）中的表达规律。方法:分别取10,20,30周龄兔晶状体前囊膜组织,采用RT-PCR和Western-blot检测该组织中p21和p27的mRNA水平和蛋白水平。结果:兔晶状体前囊膜组织中p21与p27的mRNA水平和蛋白水平相似,青年最高,老年次之,中年最低。p21和p27在青年、中年及老年兔LECs中的表达水平有差异（P<0.05）。结论:p21和p27在兔LECs周期调控过程中可能起着平衡作用,对防止PCO的研究具有一定参考价值。     

人MRG15基因荧光真核表达载体的构建及其在培养人晶状体上皮细胞的表达

目的克隆人MRG15(MORF4-related gene on chromosome15)的编码基因，构建荧光表达载体，并检测其在培养人晶状体上皮细胞中的表达，为研究MRG15与年龄相关性白内障(age related cataract，ARC)的相关性奠定基础。方法用RT—PCR的方法从人ARC的晶状体前囊膜中扩增MRG15的编码基因，克隆至pMD18-T载体并测序，结果正确后亚克隆至荧光真核表达载体pEGFP—N2中，酶切鉴定正确后采用脂质体法，瞬时转染培养人晶状体上皮细胞，荧光显微镜下检测MRG15-pEGFP-N2的定位。结果测序证实．从人ARC晶状体前囊膜中扩增出的MRG15编码基因的序列及读框全部正确。重组质粒MRG15-pEGFP-N2经酶切后产生与理论预期长度相符的片段。脂质体法转染后24h．观察到其主要在培养人晶状体上皮细胞的细胞核中表达。结论克隆了人MRG15的编码基因，成功构建了荧光真核表达载体MRG15-pEGFP-N2，并可在培养人晶状体上皮细胞中表达。     

TGF-β1基因转染对人晶状体上皮细胞周期调控的影响

目的:探讨脂质体介导的TGF-β1基因(pEGFP-TGF-β1)转染诱导人晶状体上皮细胞系-B3(HLEC-B3)细胞周期蛋白激酶抑制因子p21及细胞周期蛋白激酶CDK2的表达及其对细胞周期调控的影响。方法:将pEGFP-TGF-β1转染人晶状体上皮细胞系-B3(HLEC-B3),采用RT-PCR和Western-blot方法检测pEGFP-TGF-β1转染后24,48,72,96hp21,CDK2和Smad4mRNA和蛋白的表达,设立正常细胞组及pEGFP-C2转染组为对照组。结果:pEGFP-TGF-β1转染组TGF-β124h开始升高,48h达到最高,72h略有减少,96h明显减少,但仍高于正常组,而空载体组与正常细胞组则无明显变化。p21变化趋势和TGF-β1相符,CDK2组变化趋势则正好相反,Smad4组48h明显升高,72h下降明显,96h基本恢复正常。结论:TGF-β1通过活化凋亡基因p21,降低细胞周期蛋白激酶CDK2。     

晶状体上皮细胞凋亡调控基因与白内障的研究

白内障是最常见的致盲眼病之一,晶状体上皮细胞的凋亡是除先天性白内障以外的所有类型白内障发生的共同细胞学基础。近些年的研究表明:多种调控基因参与了晶状体上皮细胞凋亡。我们将近年来晶状体上皮细胞凋亡调控基因与白内障的研究情况做一综述。     

榄香烯对人晶状体上皮细胞增生及细胞周期的影响

目的探讨中药单体榄香烯（Ele）对人晶状体上皮细胞株（HLE-B3）增生及细胞周期的影响。方法利用重组人碱性成纤维细胞生长因子（rhbFGF）诱导HLE-B3增生,将80mg/L的Ele作用在处于增生状态下的HLE-B324h后,四甲基偶氮唑蓝法（MTT）检测Ele对HLE-B3增生的抑制作用;苏木精-伊红染色观察Ele作用后HLE-B3细胞形态的改变;流式细胞术（FCM）检测Ele对HLE-B3细胞周期的影响。结果MTT检测显示：rhbFGF组HLE-B3吸光度值（0.5990±0.0531）较正常组（0.4091±0.0422）显著升高,Ele组HLE-B3吸光度值（0.4500±0.0614）较rhbFGF组显著降低,抑制率达24.90%（P〈0.01）。苏木精-伊红染色后光学显微镜下观察到rhbFGF组较正常组细胞数量增多,细胞形态清晰,胞浆丰富,胞核清晰,交织呈网状结构;Ele组细胞数量明显减少,胞浆减少,轮廓不清,交织的网状结构减少,甚至有的细胞变圆,细胞核凝集,见核固缩现象,胞浆嗜酸性染色。FCM检测细胞周期变化时发现：G1期的细胞在rhbFGF组（42.062%±1.270%）较正常组（46.422%±3.765%）减少（P〈0.05）,Ele组（60.665%±2.069%）较rhbFGF组明显增加（P〈0.01）;S期的细胞在rhbFGF组（51.647%±1.123%）较正常组（31.842%±2.798%）明显增加（P〈0.01）,Ele组（30.222%±3.429%）较rhbFGF组明显减少（P〈0.01）;G2期的细胞在rhbFGF组（6.288%±0.966%）较正常组（21.735%±3.806%）明显减少（P〈0.01）,Ele组（9.112%±1.659%）较rhbFGF组明显增加（P〈0.01）。结论Ele能通过改变HLE-B3细胞形态及细胞周期的进程而有效抑制rhbFGF诱导的HLE-B3增生,有望成为防治后发性白内障的理想药物。     

层黏连蛋白促进人晶状体上皮细胞蛋白激酶B的活性

目的:探讨层黏连蛋白(Ln)对传代培养的人晶状体上皮细胞(hLECs)的蛋白激酶B(PKB)活性的影响,以及Ln激活PKB的信号分子途径。方法:选取第5代hLECs,分为对照组和处理组,在处理组的培养液中加入层黏连蛋白,终浓度为5mg/L。分别在处理后0,10,20,40,60min取出细胞,[γ-32P]-ATP掺入法测定胞膜和胞质PKB比活性。以PI3K的特异性抑制剂Wortmannin(终浓度100nmol/L)预处理1h,再加入层黏连蛋白,0,10,20,40,60min测定胞膜和胞质PKB比活性。结果:hLECs胞膜和胞质PKB比活性在层黏连蛋白作用40min时达到最高值,分别为空白对照的2.72和2.00倍。层黏连蛋白处理的各组胞膜和胞质PKB比活性显著高于对照组(P<0.05)。经Wortmannin预处理后,再加入层黏连蛋白,胞膜和胞质PKB比活性与未经预处理的各时间组相比均显著下降(P<0.05)。结论:层黏连蛋白通过PI3K途径激活人晶状体上皮细胞的PKB活性,比活性随时间变化而发生改变。     

白内障晶状体上皮细胞中色素上皮细胞衍生因子的表达

目的:观察色素上皮细胞衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)在人类白内障晶状体上皮细胞中的表达,以探讨PEDF在白内障发病机制中的作用。方法:白内障超声乳化手术中,实施前囊膜环形撕囊时摘取晶状体前囊连同晶状体上皮细胞,采用免疫组化的方法检测PEDF和VEGF在晶状体上皮细胞中的表达。结果:老年性白内障晶状体上皮细胞虽然PEDF存在高强度表达,与VEGF相比,这种表达还是较弱。结论:老年性白内障晶状体上皮细胞存在PEDF和VEGF的表达,而且二者之间存在着一定的相互作用,由此推断PEDF和VEGF在老年性白内障的发病机制中处于重要的作用。     

应用纳米技术研究p21cip1基因对人RPE增殖的抑制作用

目的:通过新兴的纳米粒子基因载体观察p21cip1基因对视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞增殖的抑制情况。方法:制备p21cip1基因纳米粒子,将其转染到培养的人RPE细胞,通过免疫组织化学检测p21cip1蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞周期的相关细胞量的变化。结果:p21cip1纳米粒子的DNA含量为3%,包封效率为78%,p21cip1基因在体内由于PLGA-PVA载体的保护作用,可以维持比质粒更长时间的有效期,减少质粒易被生物体内核酸酶降解的问题。流式细胞仪检测显示转染了目的基因的RPE细胞发生G1期阻滞,细胞增殖明显受到抑制。免疫组织化学检测结果显示转染了目的基因的RPE细胞p21cip1蛋白表达明显增强。结论:p21cip1基因有可能作为一个目的基因,借助新兴的基因载体纳米粒子用于抑制细胞增殖的基因治疗。     

LY294002对人晶状体上皮细胞蛋白激酶B活化的影响

背景蛋白激酶B（Akt）与许多细胞信号转导通路密切相关,从而参与多种细胞功能活动的调控,包括细胞的增生、迁移和代谢等,其中磷脂酰肌醇3-激酶（P13K）可催化Akt活性并启动各种相关的细胞信号通路。P13K抑制剂能够抑制Akt活性,但是否影响后发性白内障发生过程中残留的晶状体上皮细胞（LECs）的生物学行为尚不清楚。目的观察P13K抑制剂LY294002对人LECs中Akt活化的影响。方法对人LECs系HLEC-B3细胞进行常规培养和传代,然后接种于96孔板中,培养24h后在培养板中加入LY294002,终浓度分别为0、10、20、30、40、50、60、70、80μmol／L,继续培养24h后采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测各组细胞的增生抑制率。在同一批接种于6孔板内无菌盖玻片上的传代细胞中加入10μg／L转化生长因子-β2（TGF—β2）为诱导组,用20μmol／LLY294002预培养1h后再加入10Ixg／LTGF—β2进行共培养为TGF—B,与LY294005共培养组,以未加入TGF,p：和LY294002的细胞作为对照组,应用激光扫描共焦显微镜观察各组细胞中磷酸化Akt（p-Akt）的荧光表达情况,并用Westernblot法检测各组细胞中p-Akt表达量的差异。结果CCK-8法检测结果显示,随着LY294002浓度的增加,HLEC—B3的吸光度（A）值逐渐减小,即LY294002对HLEC—B3细胞增生的抑制作用随浓度的增加而逐渐增强,不同浓度LY294002组间HLEC—B3的A值比较差异有统计学意义（F分组=9．72,P=0．00）;随着检测时间点的延长,HLEC—B3的4值逐渐增大,不同检测时间点A值比较差异有统计学意义（F时间=1737．54,P=0．00）。激光扫描共焦显微镜观察显示,对照组细胞仅有微量的p-Akt红色荧光,诱导组p-Akt表达明显增多,并向细胞膜聚集,细胞轮廓清晰,而TGF—β2与LY294005共培养组细胞中p-Akt表达的红色荧光明显减弱,细胞形态不清。Westernblot法检测结果显示,对照组、诱导组和TGF—β2与LY294005共培养组细胞中p-Akt的表达量分别为0．91±0．08、1．48±0．13和0．95±0．19,3个组间差异有统计学意义（F=15．04,P=0．00）。结论LY294002能够拈抗TGF—β2诱导的Akt磷酸化激活过程,有望成为新的有效防治后发性白内障的药物。     

低强度2450 MHz微波阻断兔晶状体上皮细胞周期及对相关基因表达的影响

目的　探讨不同剂量微波辐射对兔晶状体上皮细胞 (RLEC)细胞周期的阻断作用 ,以及微波辐射对细胞周期调控基因P2 1WAF1、P2 7Kip1及c myc表达的影响。 方法　应用频率为 2 4 5 0MHz、功率密度分别为 0 10 (A组 )、0 2 5 (B组 )、0 5 0 (C组 )、1 0 0 (D组 )及 2 0 0mW /cm2 (E组 )的微波连续辐射体外培养的RLEC 8h ,光镜下观察辐射前、后细胞形态学的改变 ,采用流式细胞技术测定细胞周期 ,Western印迹法检测功率密度 2 0 0mW /cm2 的微波辐射 4、6及 8h对P2 1WAF1、P2 7Kip1及c myc基因表达的影响。以无微波辐射对照者为F组 ,进行对照研究。结果　微波辐射 8h后 ,C、D及E组RLEC肿胀和聚集 ,甚至出现细胞固缩和脱壁现象 ,G0 /G1期细胞所占比例明显升高 (P <0 0 5 )。功率密度 2 0 0mW /cm2 的微波辐射 4h ,P2 7Kip1表达水平即开始明显升高 ,而c myc表达水平开始逐渐下降 ,P2 1WAF1表达无变化。结论　功率密度≥ 0 5 0mW/cm2 的微波可阻断RLEC细胞周期 ,并使细胞停滞于G0 /G1期 ;这种阻断作用可能是通过调节调控细胞周期转换的基因P2 7Kip1和c myc而实现。     

反义c-myc基因转染抑制人晶状体上皮细胞增殖的研究

目的探讨腺病毒介导的反义cmyc基因(AdASmyc)转染对人晶状体上皮细胞(HLEC)系B3(HLEB3)增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法将AdASmyc转染HLEB3,观察细胞形态变化;采用生长曲线法、噻唑蓝比色法分析细胞增殖改变;使用流式细胞仪测定细胞凋亡变化、分析细胞周期改变(DNA倍体法);采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法、Western免疫印迹法检测细胞cmycmRNA及其蛋白产物表达的变化。结果AdASmyc成功转染后,HLEB3逐渐变圆、脱壁。转染后24~96h细胞的增殖受到抑制,与相应对照组比较,差异均有统计学意义(P<001);凋亡细胞比例(转染48h为1833%,转染96h为2693%)明显升高,与相应对照组(48h为319%,96h为175%)比较,差异均有统计学意义(P<001);细胞出现G1期阻滞现象,表现为G1期细胞比例[转染48h为(6050±759)%,转染96h为(8190±860)%]增加和S期细胞比例[转染48h为(2840±338)%,转染96h为(1675±897)%]下降,与相应对照组比较,差异均有统计学意义(P<001);RTPCR法和Western免疫印迹法检测发现cmycmRNA及其蛋白产物水平特异性下调。结论AdASmyc可成功转染HLEB3,并特异性抑制cmyc基因的表达,诱发细胞G1期阻滞,有效抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

羟基喜树碱对培养的兔晶状体上皮细胞的影响

目的 探讨羟基喜树碱（hydroxycamptothecine,HCPT)对兔晶状体上皮细胞（rabbit lens epithelial,RLECs)细胞周期的阻断作用和诱导细胞凋的作用,并研究其对Fas/FasL表达的影响。方法 使用流式细胞仪分析检测HCPT对RLECs细胞周期的阻断作用,以光镜和电子显微镜观察细胞形态的变化,应用末端脱氧核酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法检测HCPT诱导的细胞凋亡情况,应用免疫组化方法检测HCPT对Fas/FasL表达的影响。结果 HCPT可将RLECs阻断于细胞周期的S期并诱导其凋亡;凋亡细胞具有典型的形态;脱氧尿苷三磷酸标记显示散在阳性细胞,且凋亡细胞的数量随HCPT药物浓度的增加而增多。HCPT对RLECs的Fas/FasL表达无明显影响。结论 HCPT不仅可阻断RLECs的分裂,而且可诱导细胞发生凋亡;Fas/FasL介导途径未参与HCPT诱发RLECs凋亡的过程。     

层黏连蛋白和纤维连接蛋白对人晶状体上皮细胞生长特性的影响

目的　探讨层黏连蛋白(Ln)和纤维连接蛋白(Fn)对人晶状体上皮细胞生长特性的影响。方法　选用28只人晶状体的前囊膜,采用组织块法接种于Ln(Ln组)、Fn(Fn组)及2%牛血清白蛋白(对照组)包被的培养皿中。应用倒置显微镜观察组织块周围晶状体上皮细胞生长的时间和形态、成纤维细胞出现的时间。采用间接免疫荧光法显示连接素43、ΔNp63和整合素β1 的表达。采用逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)检测ΔNp63和整合素β1 mRNA的水平。结果　Ln组和Fn组晶状体上皮细胞长出时间早[ (2. 4±0 .2)d]、细胞数量多,且Fn组成纤维细胞的生长时间[ ( 7. 6±0. 4 )d]明显早于Ln组[ (12. 7±0. 5)d] (P<0 .05)。Ln组连接素43表达的阳性率(23 /28)明显高于Fn组(14 /28)和对照组(12 /28) (P<0 .05),Fn组ΔNp63 ( 24 /28 )和整合素β1 ( 25 /28 )表达的阳性率明显高于Ln组和对照组(P<0 .05)。RT- PCR检测结果支持间接免疫荧光法的检测结果。结论　Ln可持久促进原代培养的人晶状体上皮细胞增殖,并具有一定维持正常细胞间、细胞与细胞外基质间稳态平衡的作用;Fn在细胞培养早期具有较强的促进细胞增殖的作用,但同时也具有促进上皮细胞分化和成纤维细胞生长的作用。     

榄香烯抑制人晶状体上皮细胞增殖的蛋白质组研究

目的 探讨中药单体榄香烯对碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)诱导的人晶状体上皮细胞(HLE-B3)增殖的抑制作用及其蛋白质组学规律.方法 实验研究.共分为3组:正常组、rhbFGF组及榄香烯组.正常组为培养的HLE-B3,rhbFGF组加入终浓度为10 μg/L rhbFGF,榄香烯组加入终浓度为10μg/L rhbFGF和80 mg/L榄香烯.24 h后四甲基偶氮唑蓝法检测榄香烯对HLE-B3增殖的抑制作用;蛋白质芯片联合表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术检测分析榄香烯作用于HLE-B3后蛋白质表达谱的改变、寻求差异蛋白.采用单因素方差分析,并通过Dunnett-t检验进行正常组、rhbFGF组、榄香烯组吸光度值的两两比较;对每个质荷比峰值做Kruskal-Wallis秩和检验,采用Nemenyi检验对正常组、rhbFGF组、榄香烯组中每个特定质荷比的蛋白质峰值进行两两比较.结果 (1)四甲基偶氮唑蓝法检测显示:rhbFGF组HLE-B3吸光度A值(0.599±0.053)比正常组(0.409±0.042)显著升高,榄香烯组HLE-B3吸光度A值(0.450±0.061)比rhbFGF组显著降低,抑制率达24.90%,差异有统计学意义(F=28.886,P=0.000).(2)用rhbFGF诱导HLE-B3增殖后,出现了5个差异表达的蛋白点,其中质荷比为8093和9516的2个蛋白点表达上调,质荷比为5361、9666及13 767的3个蛋白点表达下调;榄香烯作用于增殖的HLE-B3后,出现10个差异表达的蛋白点,其中质荷比为2487、4392、8566及11 600的4个蛋白点表达上调,质荷比为3679、4826、6861、9516、9557和9672的6个蛋白点表达下调.结论 榄香烯能有效抑制rhbFGF诱导的HLE-B3增殖,质荷比为9516的蛋白点可能是榄香烯抑制rhbFGF诱导的HLE-B3增殖的作用靶点.     

过氧化氢对人晶状体上皮细胞内细胞质膜微囊蛋白的影响

目的探讨过氧化氢（H2O2）对人晶状体上皮细胞的细胞质膜微囊蛋白（CP）及磷酸化CP-1分布与表达的影响。方法给予人晶状体上皮细胞（SRA01／04）不同浓度及不同时间点的H2O2刺激。用激光共聚焦显微镜和免疫荧光显微镜观察CP及磷酸化CP-1的分布。通过免疫印迹试验观察CP表达水平的变化以及磷酸化CP—1的表达。结果通过激光共聚焦显微镜和荧光显微镜,观察到人晶状体上皮细胞的质膜和细胞质内含有丰富的CP;当给予细胞H2O2刺激后,细胞质内CP的分布增多;当刺激时间达到1h,细胞膜被破坏,但仍可观察到CP的分布情况。此外,H2O2的刺激可以使CP-1发生磷酸化。免疫印迹试验发现,随着H2O2作用时间的延长和刺激浓度的升高,细胞质膜和细胞总蛋白质的CP表达水平呈下调趋势。结论H2O2刺激人晶状体上皮细胞后,CP重新分布并可能破坏了细胞质膜微囊（caveolae）的结构,使得细胞的CP表达下调。细胞质膜微囊和CP可能在人晶状体上皮细胞中具有重要作用。     

人及小鼠白内障晶状体上皮细胞凋亡的超微结构

目的 探讨人老年性白内障及小鼠先天性白内障与其晶状体上皮细胞凋亡的关系。方法 用透射电镜观察４例老年性白内障患者及２例先天性白内障小鼠晶状体上皮细胞凋亡的超微结构,并分别与同类正常晶状体上皮细胞超微结构进行比较。结果 老年性白内障患者及先天性白内障小鼠晶状体上皮细胞中均可见凋亡细胞,而正常晶状体未见凋亡细胞。结论 人老年性白内障及小鼠先天性白内障的发生均与其晶体上皮细胞的凋亡有关。     

人原代晶体上皮细胞bFGF多肽和mRNA的表达

目的 为研究后发性白内障的发生机理,检测生长中人晶体上皮细胞（ＨＬＥＣｓ）自身是否表达碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）。方法 体外培养人晶体上皮细胞,用免疫细胞化学和原位核酸分子杂交的方法,检测ＨＬＥＣｓ中ｂＦＧＦ多肽和其ｍＲＮＡ的表达。结果 用免疫细胞化学和原位核酸分子杂交方法,可检测到生长中的人晶体上皮细胞自身表达碱性成纤维细胞生长因子。结论 结合碱性成纤维细胞生长因子促进人晶体上皮细胞生长     

手机微波辐照对人晶状体上皮细胞DNA的损伤作用及其对细胞增殖活性的影响

目的探讨手机微波对人晶状体上皮细胞(humanlensepithelialcells,hLECs)DNA的损伤作用及其对细胞增殖活性的影响。方法将hLECs分为辐照A、B、C、D组和假照组,置于sXc-1800细胞辐照系统内连续辐照2h,辐照强度[比吸收率(specificabsorptionrate,SAR)]辐照A、B、C、D组分别为1.0、2.0、3.0、4.0W/kg,辐照后0.0、0.5、1.0h分别进行彗星实验,检测细胞DNA的损伤及其修复情况。微波辐照后在培养液中加入溴脱氧尿苷(BrdU),继续培养1h后采用BrdU原位检测试剂盒显色,观察细胞的增殖率。结果辐照A、B组细胞DNA损伤与假照组比较,各个检测时段的差异均无统计学意义(P>0.05);辐照后即刻辐照C、D组DNA损伤与假照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),修复0.5h后差异仍有统计学意义(P<0.05),修复1h后辐照C组的差异消失(P>0.05),而辐照D组的差异持续存在(P<0.01)。BrdU原位检测试剂盒显色结果表明辐照A、B、C组细胞增殖情况无明显变化(P>0.05),辐照D组细胞增殖率降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论SAR≤3W/kg的1.8GHz手机微波短期急性作用对体外培养的hLECs的DNA不产生或产生可修复的损伤,对其后的细胞增殖情况亦无影响,4.0W/kg的辐照剂量可导致细胞DNA不可逆性损伤,使细胞的增殖率下降。