HSV-TK/GCV系统对卵巢癌细胞OVCAR3杀伤作用的研究

目的评价HSV—TK／GCV系统对卵巢癌细胞OVCAR3的杀伤作用及旁观者效应。方法用含HSV—TK重组腺病毒载体转染人卵巢上皮性癌细胞OVCAR3,用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法计算细胞存活率以评价杀伤作用;转染的OVCAR3细胞（TK^＋）与未转染的OVCAR3细胞（TK^-）以不同比例混合,再加入GCV,MTT法计算细胞存活率以评价旁观者效应。结果HSV—TK／GCV系统可明显杀伤OVCAR3细胞,在感染复数（MOI）为100时,平均细胞存活率为26％;HSV—TK／GCV系统对该细胞的杀伤作用有明显的“旁观者效应”,当TK^＋细胞占10％、20％、30％、40％、50％时,细胞平均存活率分别为82％、52％、41％、35％、32％。免疫细胞化学检测OVCAR3细胞的细胞膜上有Cx43的表达。结论HSV—TK／GCV系统对人卵巢上皮性癌细胞OVCAR3有明确的杀伤作用及旁观者效应。     

腺病毒介导的HSV-tk体外抗喉癌作用

目的 :观察 HSV- tk/ GCV系统对喉癌细胞的杀伤作用。方法 :将带有报告基因 Lac Z的 5型缺陷性腺病毒载体 Ad CMVL ac Z感染喉癌细胞 Hep- 2 ,X- gal染色 ,测定腺病毒的转染率。利用同源重组技术构建含 HSV- tk基因的重组腺病毒载体 Ad CMVtk。Ad CMVtk感染 Hep- 2细胞后 ,加入 10 mg/ LGCV,观察瘤细胞存活率及旁观者效应。结果 :随着腺病毒感染复数量 (multiplicity of infection,MOI)增加 ,对 Hep- 2细胞转染率亦增加 ,10 0 %转染所需的 MOI为 2 0 0。 Ad CMVtk/ GCV对 Hep- 2细胞的杀伤强度与 Ad CMVtk量呈正向关系 ,即有浓度依赖性。此杀伤作用存在旁观者效应 ,但较弱。结论 :腺病毒介导的 HSV- tk/ GCV具有杀伤喉癌细胞作用     

HSV-tk/GCV系统对人宫颈癌细胞株ME180旁观者效应的研究

目的：研究以逆转录病毒载体介导的HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞株的旁观者效应。方法：应用脂质体及ploybrene转染技术，将重组逆转录病毒载体PLXSN－HSV－tk，导入PA317包装细胞，以其分泌的逆转录病毒感染宫颈癌ME180细胞（ME），建立ME／TK转化细胞株。观察GCV对ME、ME／TK细胞的存活率及旁观者效应。结果：从病毒滴度、电镜及PCR检查，证实tk基因随病毒的感染已成功地导入PA317及ME180细胞。ME／TK细胞对GCV的敏感性显著高于亲代ME细胞。ME／TK及ME＋ME／TK混合细胞还随GCV浓度的增加受到明显的抑制。ME＋ME／TK混合细胞的存活率，随ME／TK细胞比例的增加而降低，说明TK／GCV系统不但能杀伤tk^ 细胞，也能杀伤未导入tk的细胞，存在明显的旁观者效应。结论：HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞具有明显的杀伤及旁观者效应。     

靶向性双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞的杀伤作用

目的 研究腺病毒介导的前药/血管内皮生长因子受体(KDR)启动子-双自杀基因系统对血管内皮细胞的杀伤作用。方法 应用PCR扩增出KDR启动子、CD基因、TK基因序列,构建pKDR-CDglyTK质粒;以Adeasy-1系统为载体,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带KDR启动子调控下的CD与TK的融合基因腺病毒重组质粒pAdKDR-CDglyTK,重组质粒在293细胞中包装成病毒,并进一步扩增、纯化,以不同的感染复数(MOI)体外感染脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),利用重组病毒携带的绿色荧光蛋白(GFP)基因,荧光显微镜下观察重组腺病毒的感染效率,并给予不同浓度的GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),比较GCV(ganciclovir)和/或5-FC联合对转基因HUVEC细胞的杀伤作用。结果 成功构建了AdKDR-CDglyTK重组病毒,并高效地转染了HUVEC,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高。被转染的HUVEC对GCV和5-FC高度敏感。另外,MOI一定时,细胞存活率随GCV和5-FC浓度增加递减;GCV和5-FC浓度一定时,细胞存活率随MOI升高而降低。不同前药组细胞存活率结果显示:联合应用GCV+5-FC较单用GCV或5-FC对感染细胞的杀伤作用更强(P<0.05)。结论 KDR启动子-双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞具有强烈的杀伤作用,其杀伤效率与GCV和5-FC的浓度及重组腺病毒的MOI相关,联?     

腺病毒介导的HSV—tk体外抗喉癌作用

目的：观察HSV－tk/GCV系统对喉癌细胞的杀伤作用。方法：将带有报告基因LacZ的5型缺陷性腺病毒载体AdCMVLacZ感染喉癌细胞Hep-2,X-gal染色，测定腺病毒的转染率。利用同源重组技术构建含HSV－tk基因的重组腺病毒载体AcCMVtk。AdCMVtk感染Hep-2细胞后，加入10mg/LGCV,佼 活率及旁观者效应。结果：随着腺病毒感染复数量（multiplicity of infection,MOI)增加，对Hep-2细胞转染率亦增加，100％转染所需的MOI为200。AdCMVtk/GCV对Hep-2细胞的杀伤强度与AdCMVtk量呈正向关系，即有浓度依赖性。此杀伤作用存在旁观者效应，但较弱。结论：腺病毒介导的HSV－tk/GCV具有杀伤喉癌细胞作用。     

hTERT启动子引导的NIS基因重组腺病毒的构建

目的：构建在人端粒酶逆转录酶（hTERT）核心启动子引导钠碘转运体（NIS）基因的重组腺病毒。方法：PCR扩增目的片断;通过荧光分析实验,选取启动效果最好的hTERT启动子片断;建立3个重组腺病毒：Ad—hTERT—NIS、Ad—CMV—NIS及Ad—CMV-TPO,培养胶质瘤细胞系U87、U251及细胞系MRC-5（正常人胚胎成纤维细胞系）,然后转染病毒并进行westem bolt分析等实验。结果：胶质瘤细胞U87及U251中端粒酶为阳性,hTERT启动子片段204启动效率比较其他片段效率高。该启动子片段可以引导NIS基因的靶向性表达。结论：成功构建在hTERT核心启动子引导NIS基因的Ad—hTERT—NIS及重组腺病毒Ad—CMV—NIS和Ad-CMV—TPO,该重组腺病毒转染胶质细胞U87和U251后能成功表达NIS及TPO基因。     

HRE增强hTERT启动子-tk/GCV基因系统对缺氧环境肿瘤细胞的杀伤作用

目的：探讨缺氧反应元件(HRE)增强hTERT启动子-tk/GCV逆转录病毒基因系统对缺氧环境肿瘤细胞的体外杀伤作用。 方法：构建由HRE缺氧反应元件修饰的hTERT杂合启动子和hTERT单一启动子引导单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因表达的重组逆转录病毒载体,在脂质体介导下分别转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆。将重组病毒感染人肺癌细胞SPC-A1和人肝癌细胞Bel-7402,G418筛选出抗性克隆肿瘤细胞。实验分为对照组、SPC-A1/tk组和Bel-7402/tk组。在缺氧处理条件下,MTT法检测前体药物丙氧鸟苷(GCV)对SPC-A1/tk和Bel-7402/tk细胞的杀伤效应,流式细胞仪检测其细胞凋亡率和细胞周期的变化。 结果:与对照组比较,缺氧环境培养的SPC-A1/tk和Bel-7402/tk细胞对GCV的敏感性明显增强,其中细胞凋亡率明显升高（P<0.001）,细胞周期各期细胞数有所减少（P<0.05）。与hTERT启动子引导的tk基因系统组细胞比较,［HRE］hTERT杂合启动子引导的tk基因系统组肿瘤细胞存活率更低（P<0.01）,诱导肿瘤细胞凋亡率明显升高（P<0.01）,G₁期和^G0期细胞数有所增高（P<0.05）,S期细胞数减少（P<0.05）。结论：HRE能增强hTERT启动子-tk/GCV自杀基因系统对缺氧环境中肿瘤细胞的体外杀伤作用。     

拓扑替康和更昔洛韦单独或联合应用对SKOV3／tk细胞生长的影响

目的：探讨更昔洛韦(GCV)与拓扑替康(TPT)单独或联合应用对携带有hTERT启动子调控的HSV-tk基因的SKOV3细胞生长的影响。方法：将hTERT启动子调控的HSV-tk基因重组逆转录病毒载体成功转染人卵巢癌SKOV3细胞(SKOV3／tk细胞)，用MTT法观察SKOV3／tk细胞对GCV、TPT的敏感性；观察合用GCV和TPT对SKOV3／tk细胞的杀伤作用。结果GCV及TPT对SKOV3／tk细胞的最低有效浓度分别为10mg／L和10ug／L，100mg／LGCV与TPT合用时TPT对SKOV3／tk细胞的最低有效浓度为5ug／L。结论：GCV合用TPT较TPT单用更能抑制携带有HSV-tk基因的SKOV3细胞的增殖。     

腺病毒介导HSV-tk/GCV系统杀伤脑胶质瘤C6细胞

目的 :观察腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶 /丙氧鸟甘 (herpessimplexvirusthymidinekinase/ganci clovir HSV tk/GCV)系统对脑胶质瘤细胞的杀伤作用 .方法 :将AdCMVLacZ感染胶质瘤细胞C6,X gal染色 ,测定腺病毒的转染率 .AdCMVtk感染C6细胞后加入 10mg·L-1GCV ,观察肿瘤细胞存活率及旁观者效应 .结果 :tk基因对C6细胞的转染率随着腺病毒的感染复数 (MOI)量增加而增加 (r=0 .819,P<0 .0 5 ) ,10 0 %转染所需要的MOI为 10 0 .AdCMVtk/GCV对C6细胞的杀伤强度与AdCMVtk的量成正相关 (r =0 .870 ,P <0 .0 5 ) .此杀伤作用存在旁观者效应 ,且较强 .结论 :腺病毒介导的HSV tk/GCV系统具有杀伤脑胶质瘤的作用     

CD、TK双自杀基因对消化道肿瘤细胞的体外抑制作用

目的 用粘粒法构建含有胞嘧啶脱氨酶（CD）、单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－tk)双自杀基因的腺病毒载体，检测双自杀基因对不同消化道恶性肿瘤细胞的体外抑制作用。方法 利用重组腺病毒载体介导的CD、HSV－tk融合基因感染人结肠腺癌细胞系LoVo、胃癌细胞系SGC－7901、肝癌细胞系BEL－7402，通过MTT法测定细胞存活率，通过细胞集落形成实验分析GCV（丙氧鸟苷）、5－FC（5－氟胞嘧啶）双前药（double prodrugs)对肿瘤细胞的杀伤作用和旁观效应的大小。结果 Western blot检测分析融合基因的表达，显示重组腺病毒介导的双自杀基因可以在3种肿瘤细胞中高效表达。使用前药GCV和5－FC后，各组肿瘤细胞的集落形成和细胞存活率显低于对照组。感染细胞在混合细胞中比例较低时，就能获得明显的旁观效应。联合两种前药能获得最大的细胞抑制作用，并且CD／5－FC系统对于消化道肿瘤细胞的杀伤作用强于HSV－tk/GCV系统。结论 CD、TK融合基因联合双前药治疗对消化道肿瘤有显的体外抑制作用。     

pAdKDR/CD/TK自杀基因系统对大肠癌SW480细胞体外杀伤作用的实验研究

目的研究腺病毒介导的KDR/CD/TK双自杀基因系统对大肠癌SW480细胞的杀伤作用。方法构建pAdKDR/CD/TK重组腺病毒,采用不同感染复数（MOI）的重组腺病毒感染大肠癌SW480细胞、ECV304细胞及LS174T细胞,再加入不同浓度前药（GCV、5-FC）培养后,以MTT法检测细胞生长抑制率,观察重组腺病毒联合GCV和5-FC对大肠癌SW480细胞、ECV304细胞和LS174T细胞的杀伤作用,了解前药GCV、5-FC、GCV/5-FC对3种细胞的杀伤作用及KDR启动子的靶向杀伤作用。结果 pAdKDR/CD/TK重组腺病毒对3种细胞具有相似的感染率,感染腺病毒的3种细胞中除LS174T细胞外,均检测到目的基因的表达。当转基因细胞的比率为50%时,SW480和ECV304细胞分别有（31.3±5.64）%、（33.5±5.4）%的存活,而LS174T细胞存活率仍为（98.1±0.95）%（P均〈0.01）。单用GCV浓度为80μg/ml时,SW480细胞、ECV304细胞、LS174T细胞的生存率分别为（45.6±6.5）%、（45.9±5.4）%、（99.5±4.7）%,单用5-FC浓度为1000μg/ml时,三者生存率分别为（40.4±5.8）%、（45.3±4.7）%、（97.0±6.2）%,联合用药（80μg/ml＋1000μg/ml）时,三者生存率分别为（20.5±0.46）%、（25.6±1.33）%、（97.3±3.96）%。联合用药分别与GCV及5-FC单独用药生存率比较,差异均有统计学意义（P均〈0.05）。提示单独应用GCV及5-FC对SW480细胞、ECV304细胞有较强的杀伤作用,联合用药效果更佳。结论含KDR启动子的融合基因,具有选择性杀伤作用。前药GCV、5-FC对转染融合基因的大肠癌SW480细胞具有体外抑制作用,且有较强的旁观者效应。     

靶向性双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞的杀伤作用

OBJECTIVE: To study the killing effect of adenovirus-mediated double suicide gene under the regulation of kinase domain-containing receptor (KDR) promoter on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). METHODS: The sequences of human KDR promoter gene, CD gene and TK gene were amplified by PCR, and the plasmid pKDR-CDglyTK was constructed. A two-step transformation protocol was employed for the construction of a recombinant adenoviral plasmid pAdKDR-CDglyTK that was transfected into 293 packaging cells to further multiply and purify the adenovirus. HUVECs were infected by the resultant recombinant adenovirus of different multiplicities of infection (MOI), and the infection rate was measured by observing the expression of green fluorescence protein (GFP). The infected cells were cultured in the culture media containing ganciclovir (GCV) and/or 5-fluorocytosine (5-FC) at different concentrations, and the killing effects were evaluated. RESULTS: Recombinant adenovirus AdKDR-CDglyTK were successfully constructed, which could efficiently infect HUVEC cells, with the infection rate associated with the MOI of the recombinant adenovirus. HUVEC cells infected with AdKDR-CDglyTK were highly sensitive to the prodrugs, their survival rate correlated to both the concentration of the prodrugs and the MOI of the recombinant adenovirus. The killing effect of the two produrgs used in combination was much stronger than that of exclusive use of GCV or 5-FC. CONCLUSIONS: Prodrug/KDR-CdglyTK system is effective in killing HUVEC cells, and its killing effect is correlated with the concentration of the prodrugs and the MOI of the recombinant adenovirus. Combination of the two prodrugs produces stronger killing effect on the cells.     

腺病毒介导的HSV-tk/GCV系统对肺癌细胞的杀伤作用

目的：用含HSV-tk重组腺病毒载体转染Lewis肺癌细胞,探讨其对肺癌细胞的杀伤作用。 方法：利用同源重组技术构建含HSV-tk基因的重组腺病毒载体(AdCMVtk),将含LacZ基因的腺病毒载体(AdCMVLacZ)转染Lewis肺癌细胞,X-gal染色后,测定腺病毒对该细胞的转染率,并观察AdCMVtk/GCV系统对Lewis肺癌细胞存活率的影响。 结果：随着AdCMVLacZ的病毒量（MOI）增加,对Lewis细胞转染率也增加,当MOI为500时,转染率可达100%。AdCMVtk/GCV系统可明显杀伤Lewis细胞, 且随着AdCMVtk的MOI增加,或GCV浓度的增加,细胞存活率减少,但单独使用AdCMVtk或GCV时,对Lewis细胞无杀伤作用。AdCMVtk/GCV系统对该细胞的杀伤作用具有明显的旁观者效应,20%Lewis细胞被AdCMVtk转染可引起74%细胞死亡。 结论：AdCMVtk/GCV系统杀伤肿瘤细胞既有效又安全。     

细菌内同源重组法制备腺病毒介导TK基因对肝癌细胞的杀伤作用

目的 探讨用细菌内同源重组法制备含TK自杀基因腺病毒对肝癌细胞的杀伤作用.方法 将TK基因自载体中切出,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成质粒pAdTrack-GFP-TK,将其PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化BJ5183菌,抽提重组体腺病毒基因组质粒DNA,PacⅠ酶切后转染293细胞包装成腺病毒颗粒,观察其对肝癌细胞的感染效率和目的 基因表达情况及肝癌细胞SMMC-7721感染含TK自杀基因腺病毒后加入丙氧鸟苷(GCV)的生存率和旁观者效应的体外观察.结果 纯化所得腺病毒滴度约为2×1012 efu/mL,当病毒感染复数(MOI)=100时,腺病毒感染SMMC-7721细胞的效率＞90%,实验证实在感染重组体腺病毒的细胞中有相应基因产物的表达,SMMC-7721/Ad-TK细胞对GCV高度敏感,半杀伤浓度(IC50)仅为0.2 μmol/L,HSV-TK/GCV系统在SMMC-7721细胞中存在明显的旁杀伤效应.结论 细菌内同源重组法制备重组腺病毒介导的HSV-TK基因能够成功地在体外整合到肝癌细胞SMMC-7721中,并能高效表达,使其对GCV高度敏感.旁观者效应极大地提高了TK基因抗肿瘤活性,使TK基因制剂实际应用于临床治疗恶性肿瘤成为可能.     

放疗联合TK/GCV自杀基因系统对肺腺癌细胞凋亡活性的影响

目的研究放疗联合高效表达的胸苷激酶/丙氧鸟苷(TK/GCV)自杀基因系统对人肺腺癌细胞株A549细胞凋亡活性的影响,探寻肺腺癌放化疗联合治疗的新途径。方法利用前期研究成功构建的可调控自杀基因TK高效表达的pfos-iNOS/TK治疗载体转染A549细胞筛选阳性克隆。将阳性转染细胞(转染治疗载体组)和未转染的对照细胞(未转染组)分别给予2 Gy的X射线照射和10μmol/L、1000μmol/L的GCV。荧光显微镜观察细胞凋亡情况,检测各组细胞的凋亡率。结果给予10μmol/L、1000μmol/L的GCV作用后,治疗载体组凋亡率高于未转染(P<0.05);X射线照射联合GCV作用后,转染治疗载体组大量细胞发生凋亡,而未转染组仅有少量细胞发生凋亡(P<0.01)。结论放疗联合高效表达的TK/GCV自杀基因系统显著提高了对肺腺癌细胞的杀伤作用,为肺癌治疗带来了新的希望。     

腺病毒介导的双自杀基因系统对乳腺癌细胞的杀伤作用

目的 探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对乳腺癌治疗作用.方法 用重组VEGFP-CD/TK-GFP基因的腺病毒体外感染表达VEGF的乳腺癌MCF-7细胞和对照组不表达VEGF的乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察其感染效率,以RT-PCR检测受感染细胞CD/TK的表达,然后给子前药环氧鸟苷(GCV)和/或5-氟胞嘧啶(5-FC),用MTT法观察该体系对细胞生长增殖的影响;用流式细胞术观察细胞周期变化.建立MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型,采用瘤内注射腺病毒载体联合腹腔内注射前药GCV和/或5-FC治疗后,观察肿瘤生长情况.结果 腺病毒对两种细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增.RT-PCR检测发现转染Ad-VEGFP-CD/TK的MCF-7细胞有目的 基凶的表达,而乳腺上皮细胞无表达.MTT法检测显示表达VEGF的MCF-7细胞对前药具有较高的敏感性,而不表达VEGF的乳腺上皮细胞对前药不敏感,CD/TK融合基因对MCF-7的疗效优丁任一单自杀基因(P＜0.01).在感染复数为100时,用流式细胞仪分析细胞周期显示治疗组细胞G0-G1期比率增多,S期细胞减少.在MCF-7裸鼠移植瘤模型中.该双自杀基因系统能够显著抑制肿瘤的牛长.其疗效优于任一单自杀基因(P<0.01).结论 腺病毒介导VEGF启动子驱动的CD/TK融合双自杀基因联合GCV和5-FC能有效治疗乳腺癌,其效果优于单自杀基因系统.     

Ad-VEGFP-CD/TK系统诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的 探讨腺病毒介导的VEGF启动子驱动的CD/TK双自杀基因体系(Ad-VEGFP-CD/TK)对胃癌细胞SGC-7901的体外杀伤作用.方法 用重组腺病毒Ad-VEGFP-CD/TK体外感染表达VEGF的SGC-7901细胞,荧光显微镜观察其感染效率,然后给予前药GCV和5-FC,用光镜、透射电镜观察及流式细胞术等方法观察细胞凋亡、细胞周期、细胞内DNA含量及钙离子浓度的变化.结果 腺病毒的感染率随病毒滴度的增高而递增,在感染复数为100时,前药GCV和5-FC在一定浓度搭配范围内呈剂量和时间依赖性地诱导SGC-7901细胞凋亡,电镜下可见细胞凋亡的典型改变.用流式细胞仪测定用药组出现典型的凋亡峰;细胞周期分析显示治疗后细胞G0-G1期比率增多,G2-M及S期细胞减少;此外,前药还可以引起细胞内Ca2 浓度持续增加.结论 VEGF启动子可调控双自杀基因系统选择性诱导表达VEGF的SGC-7901细胞凋亡,其机制与细胞内钙离子浓度升高有关.