Cdc42 小干扰RNA对结肠癌细胞恶性表型的影响

 目的 研究细胞周期分裂蛋白Cell division cycle 42(Cdc42)小干扰RNA(siRNA)对人结肠癌细胞恶性表型的影响. 方法 Western blot 检测五种结肠癌细胞系中Cdc42的表达。设计并合成靶向Cdc42编码区的三对siRNA及阴性对照RNA,应用Lipofectamine^TM2000分别转染结肠癌细胞系中高表达Cdc42的Lovo和SW620细胞,RT-PCR和Western blot分别检测48h后Cdc42 mRNA及蛋白的表达。Cell Counting Kit-8检测细胞的增殖能力,损伤刮擦实验和Transwell小室法分别检测细胞迁移与侵袭能力的变化。 结果 RT-PCR和 Western blot检测显示,Cdc42-siRNA能显著下调Cdc42 mRNA和蛋白水平,尤其Cdc42-siRNA1;siRNA处理后的肿瘤细胞增殖受到抑制,细胞迁移、侵袭能力也显著降低。 结论 Cdc42-siRNA可有效抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。提示Cdc42可能成为抑制结肠癌细胞增殖和转移新的分子靶点。     

MEX3A对结肠癌细胞恶性表型的影响及其机制研究

目的:探讨MEX3A在结肠癌组织中的表达及其对结肠癌细胞恶性表型的影响并探索其机制。方法:TCGA数据库分析MEX3A在结肠癌组织及正常组织中的差异表达及其与患者临床病理分期和预后的相关性,并通过免疫组化进一步验证。采用慢病毒对结肠癌细胞中MEX3A的表达进行敲低,检测细胞的增殖、凋亡、迁移及侵袭能力。裸鼠皮下荷瘤后对肿瘤生长进行测量记录。Flag融合表达质粒过表达MEX3A后进行COIP实验。采用质谱进行蛋白质定性检测(Shotgun)与MEX3A互作的蛋白质。生物信息学分析后进行COIP验证,对互作蛋白表达进行挽救实验验证。结果:MEX3A在结肠癌组织中表达显著上调且与患者临床病理特征及预后相关。采用慢病毒敲减MEX3A表达后,结肠癌细胞增殖能力显著被抑制,凋亡则显著增加。细胞转移能力检测结果显示,结肠癌细胞的迁移及侵袭能力显著被抑制。小鼠体内实验结果表明,敲减MEX3A表达后,肿瘤在体内的生长明显被抑制。蛋白质定性检测及COIP验证结果显示,EIF2AK2、LAMB3及MSI2与MEX3A蛋白存在相互作用。在敲减MEX3A表达后分别过表达EIF2AK2、LAMB3及MSI2后细胞...     

DcR3-RNAi对人SW-480结肠癌细胞系恶性表型的影响

目的:观察研究抑制DcR3基因表达的人SW480结肠癌细胞其恶性表型的改变.方法:应用RNA干扰(RNAi)技术,构建小双链DNA,克隆入表达载体,转染进入SW480结肠癌细胞系(DcR3高表达细胞),在细胞内形成小干扰双链RNA;识别并降解DcR3 mRNA.筛选DcR3低表达转染癌细胞,3H观测其体外DcR3-SW480-RNAi转染细胞的增长率及凋亡表达.结果:转染的DcR3-SW480-RNAi-F1R1细胞可降低DcR3 mRNA的转录,凝胶电泳反应产物显示与对照组相比,DcR3-SW480-RN-Ai-F1R1细胞组条带明显减弱;3H掺入细胞的定量分析显示DcR3-RNAi-SW480结肠癌细胞的数量明显减少,P<0.001;Western 印记检测显示凋亡抗体Caspase-3及PARP表达增加.结论:经转染的DcR3-RNAi-SW480结肠癌细胞其DcR3 mRNA表达降低.肿瘤细胞的生长数量减少,凋亡表达增加, 有一定可探索性抗癌前景.     

RNA干扰下调RhoA表达对卵巢癌细胞SKOV-3恶性表型的影响

目的:探讨RNA干扰(RNAi)下调RhoA表达对卵巢癌细胞SKOV-3恶性表型的影响.方法:构建RhoA基因特异性短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体,以脂质体介导转染卵巢癌细胞SKOV-3,RT-PCR和蛋白质印迹法检测RNAi后SKOV-3中RhoA的mRNA及蛋白表达水平变化;Boyden小室体外侵袭和划痕实验观察细胞侵袭和迁移能力,MTT比色法测定转染前后细胞增殖及粘附能力的变化.结果:转染RhoA shRNA的实验组细胞与转染空载体的对照组细胞比较,RhoA mRNA的表达分别为(5.46±2.02)%和(56.37±17.42)%,蛋白质的表达分别为(6.03±2.04)%和(59.03±19.94)%,细胞平均侵袭百分比为(15.84±4.17)%和(33.64±4.64)%,愈合百分比为(44.79±6.21)%和(68.36±4.46)%,增殖能力(A值)分别为0.726±0.166和1.703±0.340,P<0.05(n=3);而粘附能力(A值)分别为0.833±0.137和0.894±0.189,P>0.05(n=3).结论:通过RNAi降低RhoA的表达能降低卵巢癌细胞SKOV-3体外侵袭、迁移和增殖能力.     

shRNA干扰BAMBI 基因对人结肠癌SW480 细胞恶性生物学行为的影响

[摘要] 目的: 探讨shRNA 干扰骨形成蛋白和激活素的穿膜抑制剂(bone orphogenetic protein and activin membrane bound inhibitor, BAMBI)基因对人结肠癌SW480 细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响及其作用机制。方法: 转染SW480 细胞sh-BAMBI成功后,实时定量PCR（qRT-PCR)和Western blotting 检测BAMBI mRNA和蛋白表达水平,MTT法检测SW480 细胞增殖能力,Hoechst33258 染色检测细胞凋亡情况,Transwell 实验检测细胞侵袭能力,划痕实验检测SW480 细胞迁移能力,Western blotting检测TGF-β/Smad2 通路相关蛋白的表达水平。结果: 转染成功后sh-BAMBI组中BAMBI的mRNA和蛋白水平均低于对照组(P<0.05);与对照组相比,sh-BAMBI 组细胞增殖率明显降低(P<0.05)、细胞凋亡率显著升高(P<0.01),同时其侵袭和迁移能力明显减弱(均P<0.05)。sh-BAMBI组TGF-β 蛋白水平和p-Smad2/Smad2 比值明显高于对照组(P<0.05)。结论: shRNA干扰BAMBI可诱导人结肠癌SW480 细胞凋亡并抑制细胞增殖、侵袭和迁移,其机制可能与激活TGFβ/Smad2 通路有关。     

RNA干扰抑制人结肠癌SW480细胞EGFR的表达及其对体外生长情况影响的研究

目的研究利用RNA干扰技术抑制人结肠癌SW480细胞表皮生长因子受体(EGFR)基因的表达,并观察受抑制后SW480细胞体外生长情况的改变。方法利用脂质体将siRNA转染进入SW480细胞(野生型K-ras基因表达阳性),在细胞内形成双链siRNA,识别并降解EGFR mRNA。通过荧光定量RT-PCR检测EGFR mRNA的表达水平,Western blot检测EGFR蛋白的表达,MTT法检测SW480细胞的增殖抑制情况,流式细胞学检测细胞凋亡情况。结果转染EGFR395-siRNA和EGFR1499-siRNA的SW480细胞其EGFRmRNA及蛋白表达均较对照组明显降低(P<0.05);转染EGFR395-siRNA和EGFR1499-siRNA的SW480细胞增殖率较对照组降低(P<0.05),凋亡率增高(P<0.05)。结论 siRNA能有效抑制SW480细胞EGFR基因的表达,具有抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用。     

端粒酶逆转录酶小干扰RNA对结肠癌SW480细胞体外抑制作用的观察

目的:探讨RNA干扰(RNAi)对结肠癌SW480细胞人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的抑制效应。方法:化学合成靶向于hTERT基因的4个小分子干扰RNA(siRNA)序列,用阳离子脂质体为载体转染SW480细胞,分为siRNA1～4、siRNA阴性对照和空白对照6组。通过RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测结肠癌细胞转染后细胞hTERT mRNA和蛋白水平,并用MTS法检测细胞生长增殖。结果:siRNA1～4组hTERT mRNA相对表达量分别为0.54±0.18、0.56±0.19、0.46±0.10和0.84±0.18,端粒酶相对活性分别为0.57±0.18、0.56±0.19、0.09±0.08和0.70±0.19,siRNA1～4组hTERT蛋白相对表达量分别为0.41±0.18、0.45±0.17、0.08±0.07和0.82±0.16,其中siR-NA1～3组的hTERT mRNA表达量、端粒酶活性和蛋白表达量与空白对照组的差异有统计学意义,P<0.05。SW480细胞在转染后48h时的细胞增长平均抑制率分别为42.14%、39.12%、48.05%和35.85%。提示不同siRNA序列对SW4...     

RNA干扰RhoBTB1表达促进结肠癌HT29细胞增殖、抑制其凋亡的相关研究

目的:探究RNA干扰RhoBTB1基因表达对结肠癌HT29细胞增殖、凋亡的影响。方法:采用Lipofectamine 2000将siRNA RhoBTB1或siRNA NC转入HT29细胞中，实验分为Control组、转染对照组和siRNA Rho组，噻唑蓝（MTT）和流式细胞术分别检测细胞的的活力和凋亡率，蛋白质印迹法（Western Blot）检测细胞中RhoBTB1、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达量。结果:与对照组相比，HT29细胞转染siRNA RhoBTB1后，细胞中RhoBTB1蛋白的表达量显著低于对照组（P<0.05），细胞活力显著升高（P<0.05），凋亡率显著降低（P<0.05），Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平明显降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平显著增加（P<0.05）。结论:RNA干扰RhoBTB1表达促进结肠癌HT29细胞增殖，抑制其凋亡，可能通过调节线粒体凋亡通路相关蛋白的表达量发挥作用。     

p53反义RNA对肠癌细胞恶性表型的抑制作用

研究ｐ５３反义ＲＮＡ对大肠癌细胞中突变型ｐ５３致癌性的抑制效应,为肿瘤基因治疗提供新思路。方法２．１ｋｂ的人ｐ５３全长ｃＤＮＡ反向插入哺乳动物表达载体ｐＲＥＰ９,得到ｐ５３反义ＲＮＡ表达载体ｐＲＥＰ９－ｐ５３（ＡＳ）,并将其导入人肠癌细胞株ＳＷ１１１６（内源性突变型ｐ５３）,采用ＭＴＴ和ＦＣＭ方法测定ｐＲＥＰ９－ｐ５３（ＡＳ）表达的ｐ５３反义ＲＮＡ对ＳＷ１１１６细胞生长的影响。结果带有ｐＲＥＰ９－ｐ５３（ＡＳ）的ＳＷ１１１６细胞,与对照组ＳＷ１１１６细胞和带ｐＲＥＰ９空载体的ＳＷ１１１６细胞相比,由于ｐ５３反义ＲＮＡ的表达,其增殖速度显著下降,ＦＣＭ的结果也证明带ｐＲＥＰ９－ｐ５３（ＡＳ）的细胞部分受阻于Ｇ０／１期,而带ｐＲＥＰ９空载体的细胞则无明显变化。结论ｐ５３反义ＲＮＡ可以有效地抑制大肠癌细胞中突变型ｐ５３的致癌性,可用于实验性肿瘤基因治疗研究     

GIT1 promotes lung cancer cell metastasis through modulating Rac1/Cdc42 activity and is associated with poor prognosis

G-protein-coupled receptor kinase interacting protein 1 (GIT1) is participated in cell movement activation, which is a fundamental process during tissue development and cancer progression. GIT1/PIX forming a functional protein complex that contributes to Rac1/Cdc42 activation, resulting in increasing cell mobility. Although the importance of Rac1/Cdc42 activation is well documented in cancer aggressiveness, the clinical importance of GIT1 remains largely unknown. Here, we investigated the clinical significance of GIT1 expression in non-small-cell lung cancer (NSCLC) and also verified the importance of GIT1-Rac1/Cdc42 axis in stimulating NSCLC cell mobility. The result indicated higher GIT1 expression patients had significantly poorer prognoses in disease-free survival (DFS) and overall survival (OS) compared with lower GIT1 expression patients. Higher GIT1 expression was an independent prognostic factor by multivariate analysis and associated with migration/invasion of NSCLC cells in transwell assay. In vivo studies indicated that GIT1 promotes metastasis of NSCLC cells. Finally, GIT1 was found to stimulate migration/invasion by altering the activity of Rac1/Cdc42 in NSCLC cells. Together, the GIT1 expression is associated with poor prognosis in patients with NSCLC. GIT1 is critical for the invasiveness of NSCLC cells through stimulating the activity of Rac1/Cdc42.     

基底细胞样型乳腺癌中Cdc42 和IQGAP1的表达及临床意义

[目的]分析细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)和支架蛋白1(IQGAP1)与基底细胞样型乳腺癌(basal-like breast cancer,BLBC)临床病理特征之间的关系及二者之间的相关性,探讨Cdc42和IQGAP1在BLBC发生、发展及侵袭转移中的作用.[方法]采用免疫组化方法检测60例BLBC、45例非基底细胞样型乳腺癌(non-basal-like breast carcinoma,Non-BLBC)和35例癌旁正常乳腺组织中Cdc42和IQGAP1的表达.[结果]Cdc42在BLBC中的表达明显高于Non-BLBC和癌旁正常乳腺组织(P＜0.0 125),IQGAP1在BLBC和Non-BLBC中的表达明显高于癌旁正常乳腺组织(P＜0.0125);BLBC中Cdc42的表达与淋巴结转移和TNM分期密切相关(P＜0.05),IQGAP1的表达与肿瘤大小和淋巴结转移密切相关(P＜0.05),并且两者在BLBC中的表达呈正相关关系(r=0.638,P＜0.05).[结论]Cdc42和IQGAP1可能是促进肿瘤的局部侵袭和远处转移的重要因素,在BLBC的发生发展中起着重要的作用.     

XIAP siRNA对TRAIL诱导结肠癌细胞SW620凋亡能力的影响

 目的
研究XIAP siRNA对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(Tumor Necrosis Factor-related Apoptosis-Inducing Ligand,TRAIL)诱导结
肠癌细胞SW620凋亡的影响。方法SW620细胞分为转染XIAP siRNA组、空转染对照组或者siRNA阴性对照组,然后给予TRAIL处理。XIAP
表达水平的变化、细胞增殖抑制、Caspase-3活性分别由Western blot、MTT法和Caspase-3荧光测定来检测。切割PARP的表达水平由
Western blot来测定。结果XIAP siRNA转染以后显著下调XIAP蛋白表达水平。和空转染对照组、siRNA阴性对照组相比,XIAP siRNA
显著增强10、100、1 000 ng/ml等浓度的TRAIL作用以后SW620细胞的增殖抑制、Caspase-3活性和激活PARP。结论 XIAP siRNA能显
著增强TRAIL诱导结肠癌细胞SW620的凋亡。     

Role of Rac1 and Cdc42 in hypoxia induced p53 and von Hippel-Lindau suppression and HIF1alpha activation

Low oxygen tension can influence tumor progression by enhancing angiogenesis, a process that may involve Rho GTPases whose activities have been implicated in tumorigenesis and metastasis. In the present study, we show that hypoxia can increase the mRNA levels and intracellular activities of Rac1 and Cdc42 in a time-dependent manner. The hypoxia-stimulated activities of Rac1 and Cdc42 could be blocked by the phosphatidylinositol 3'-kinase (PI3K) inhibitor LY294002 and the protein tyrosine kinase (PTK) inhibitor genistein but were not affected by the p38MAPK inhibitor SB203580 or the MEK-1 inhibitor PD98059, suggesting that the hypoxia-mediated signals were through PI3K and PTK. Correlating with the increased activities of Rac1 and Cdc42, the expression of the pro-angiogenesis factors HIF-1alpha and vascular endothelial growth factor (VEGF) was upregulated by hypoxia, whereas the expression of the tumor suppressors von Hippel-Lindau and p53 was down-regulated. Dominant negative N17Rac1 and N17Cdc42 could upregulate the expression of p53 and pVHL but downregulate that of HIF-1alpha and VEGF under hypoxia. Furthermore, the preconditioned medium from N17Rac1 or N17Cdc42-expressing gastric cancer cells was able to inhibit the proliferation of HUVECs. Our results indicate that PI3K and PTK-mediated activations of Rac1 and Cdc42 are involved in the hypoxia-induced production of angiogenesis-promoting factors and tumor suppressors, and suggest that the Rho family GTPases Rac1 and Cdc42 may contribute to the hypoxia-mediated angiogenesis.     

The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42

Background:

Guanidine exchange factor (GEF)-catalysed activation of Rho proteins such as Cdc42 has been shown to have a crucial role in cellular transformation, malignant progression and invasion. We have previously shown that the HPV16 E6 oncoprotein binds to the PDZ domain protein Tax-interacting-protein 1 (Tip-1) and we now report identification and functional analysis of a novel Tip-1 binding GEF.

Methods:

Yeast two-hybrid, in vitro pull-down, site-directed mutagenesis, semiquantitative PCR, co-immunoprecipitation and western blotting were used to identify/confirm novel Tip-1 binding partners and analyse cellular expression levels. In vitro kinetic analyses of recombinant proteins, siRNA gene silencing and in cell assays were used to measure Rho protein activation.

Results:

Tax-interacting-protein 1 was shown to interact with ARHGEF16 by its carboxyl PDZ binding motif. Levels of ARHGEF16 were increased in transformed and immortalised cells expressing ectopic HPV16 E6 and Cdc42 was co-immunoprecipitated by ARHGEF16 in the presence of high-risk HPV E6. In vitro kinetic analysis confirmed that recombinant ARHGEF16 activates Cdc42 and this was increased by the addition of recombinant Tip-1 and E6. Cells expressing HPV16 E6 had higher levels of Cdc42 activation, which was decreased by siRNA silencing of either Tip-1 or ARHGEF16.

Conclusion:

These data suggest that HPV16 E6, Tip-1 and ARHGEF16 may cooperate to activate Cdc42 and support a potential link between the expression of HPV16 E6 and Cdc42 activation.     

结肠癌细胞内吞活动中癌基因产物cortactin 的作用

 目的探讨癌基因EMS1表达产物皮层蛋白(cortactin)与结肠癌细胞内吞运动的关系。方法采用共聚焦显微镜检测人结肠癌细胞株HT29细胞内cortactin与内吞过程功能蛋白Rab5及Rab11的分布情况,以及cortactin和组成性内吞标记转铁蛋白(Tfn)的关系。采用病毒转染的方法,将外源性全长cortactin及其突变体转入结肠癌细胞内,观察过表达皮层蛋白及其变异体对细胞内吞活动的影响。进一步采用Western blot和免疫荧光分析方法检测cortactin磷酸化与Tfn内吞在时间和剂量上的关系。结果cortactin与Rab5/11及Tfn在HT29细胞内共定位。当HT29细胞过表达皮层蛋白氨基端或羧基端缺失的突变体时,细胞的内吞活动受到削弱,而表达全长皮层蛋白或载体的对照组未受明显影响。同时发现cortactin的磷酸化与Tfn内吞呈时间和剂量依赖关系。结论cortactin在结肠癌细胞HT29的内吞活动中发挥作用,其功能的发挥可能依赖其氨基端和羧基端结构区域。在内吞过程中,皮层蛋白发生磷酸化。     

非小细胞肺癌组织中P120ctn与RhoA和Cdc42表达的相关性及意义

背景与目的p120ctn可以通过改变RhoGTP酶的状态进而调节细胞的黏附和肿瘤的转移。本研究通过观察p120ctn与RhoGTP酶中RhoA、Cdc42在非小细胞肺癌中的表达及其对临床病理特征的影响,为探索p120ctn在肿瘤中的生物学功能提供依据。方法采用S-P免疫组化法检测124例非小细胞肺癌标本中p120ctn、RhoA和Cdc42的表达。结果正常支气管粘膜细胞p120ctn为细胞膜强阳性表达,在非小细胞肺癌出现胞膜表达减弱和胞浆表达等异常表达,其异常表达率为79.8%(99/124),异常表达与组织类型无明显关系,与肿瘤细胞的分化、TNM分期和淋巴结转移有明显关系(P<0.05)。RhoA和Cdc42在正常支气管粘膜中均正常表达,在癌组织中表达明显增强(62.9%,78/124;56.5%,70/124)。RhoA、Cdc42在非小细胞肺癌中的表达增强与临床病理特征无明显关系。非小细胞肺癌中p120ctn的异常表达与RhoA和Cdc42的表达增强有较好的一致性和相关性(Kappa=0.523,P<0.001;Kappa=0.493,P<0.001)。结论p120ctn的异常表达可能是导致RhoA和Cdc42表达增强的重要因素。     

MicroRNA-4465对结肠癌细胞凋亡和侵袭的影响

目的 探讨microRNA-4465（miR-4465）在结肠癌细胞中的生物学作用及其潜在的调控机制。方法 qPCR检测SW480、HT-29和HCT-116三种结肠癌细胞中的miR-4465水平，然后在HCT-116细胞中过表达miR-4465，MTT法和流式细胞仪分别检测细胞活性和细胞凋亡，试剂盒检测Caspase-3活性，Transwell实验检测细胞侵袭，荧光素酶报告基因检测分别测定miR-4465与HMGA1、HMGA2或EZH2的靶向关系。Western blot和qPCR分别检测HMGA1、HMGA2、EZH2的蛋白和mRNA表达水平。结果 在SW480、HT-29和HCT-116三种结肠癌细胞中，miR-4465表达均显著下调（P<0.05）。过表达miR-4465能够降低结肠癌HCT-116细胞活性，提高细胞凋亡率，增强Caspase-3活性，抑制细胞侵袭（均P<0.05）。miR-4465直接靶向HMGA1、HMGA2或EZH2的3'-非翻译区（3'-UTR），进而负向调控其表达。结论 miR-4465过表达能够降低结肠癌细胞活性，促进细胞凋亡并抑制细胞侵袭，这可能与负向调控HMGA1、HMGA2或EZH2基因有关。