野生型斑马鱼胚胎中hoxd3基因mRNA的表达谱

目的:为探讨hoxd3基因在斑马鱼发育过程中与血管形成可能的作用机制,用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观测hoxd3基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况。方法:提取斑马鱼胚胎总RNA,经RT-PCR扩增斑马鱼hoxd3基因片段,将得到的hoxd3基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后插入pCS2+质粒中,挑选阳性克隆,通过双酶切、菌落PCR以及测序鉴定;将pCS2+-hoxd3重组子经EcoRⅠ酶切线性化,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记的hoxd3基因的反义mRNA探针。用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交。结果:构建和鉴定了pCS2+-hoxd3重组质粒,经斑马鱼全胚胎原位杂交检测hoxd3基因的表达,发现在Tuebingen野生型斑马鱼受精后24 h～72 h胚胎的中脑后脑交界处以及后脑中可以观察到hoxd3基因的表达。结论:hoxd3基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育早期的神经系统高表达,未发现在血管生成区域的表达。     

Pax5基因在野生型斑马鱼全胚胎发育早期的表达

[摘要]：目的 构建斑马鱼pCS2+-pax5重组质粒,经体外转录合成斑马鱼pax5基因的反义mRNA探针。方法 提取斑马鱼胚胎总RNA后经RT-PCR克隆斑马鱼pax5基因片段,将得到的pax5基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后插入pCS2+质粒中,通过对重组质粒进行双酶切、菌落PCR以及插入片段序列测定鉴定后,经T3 RNA体外转录体系合成地高辛标记的pax5基因的反义mRNA探针。结果 采用RT-PCR和pCS2+载体等相关技术获得了斑马鱼pax5基因克隆,经酶切、菌落PCR以及测序鉴定证明得到了pCS2+-pax5重组质粒以及pax5基因的反义mRNA探针,经过斑马鱼全胚胎原位杂交技术检测了斑马鱼pax5基因在野生型斑马鱼发育过程中的表达情况。结论 成功构建了pCS2+-pax5重组质粒、制备了pax5基因的反义mRNA探针以及完成了野生型斑马鱼不同时相的全胚胎原位杂交。     

HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的 探讨HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的作用机制,从而为进一步研究其在造血发育中的功能奠定基础.方法 提取斑马鱼总RNA,利用RT-PCR克隆得到HOXC4基因片段,将克隆得到的基因片段和载体pCS2+用限制性内切酶BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切后,把基因片段插入pCS2+中,重组质粒经双酶切及测序鉴定后,采用T3 RNA聚合酶体外转录体系制备地高辛标记的HOXC4基因反义mRNA探针,然后行全胚胎原位杂交.结果 构建HOXC4-pCS2+重组质粒,获得地高辛标记的反义mRNA探针并且完成其在野生型斑马鱼中的全胚胎原位杂交,显示HOXC4基因在Tuebingen野生型斑马鱼神经系统高表达.结论 得到HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的基本表达情况,为进一步研究该基因在造血发育过程中的功能奠定了基础.     

rpl15在斑马鱼胚胎中的表达形式探究

目的 探究rpl15基因在野生型斑马鱼胚胎中的表达形式.方法 利用NCBI和Ensemble数据库进行rpl15基因的共线性分析和Rpl15蛋白质序列相似性分析,使用MEGA X软件绘制进化树;构建pCS2+-rpl15重组质粒,再利用T3聚合酶制备地高辛标记的rpl15反义RNA探针,用全胚胎原位杂交检测rpl15基...     

Rap1基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中的时空表达谱研究

目的：选择斑马鱼作为实验动物模型,研究Rap1基因在胚胎早期发育过程中的时空表达规律。方法从斑马鱼胚胎cDNA中克隆Rap1基因片段,将Rap1基因片段和pCS2＋质粒进行体外连接重组,重组质粒经双酶切、菌落聚合酶链反应（PCR）及测序鉴定正确后,经T3RNA体外转录体系合成DIG标记的Rap1基因反义mRNA探针,采用整胚原位杂交方法检测Rap1在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达情况。结果在斑马鱼胚胎0．75 hpf的细胞分裂连接处、3．70 hpf和6．00 hpf的动物极、12．00～72．00 hpf的脊索神经部位均可见Rap1基因的阳性杂交信号。结论 Rap1基因在斑马鱼脊索神经系统的早期发育过程中可能起到重要的调控作用。     

斑马鱼胚胎发育过程中Mef2c的表达

目的探讨Mef2c在斑马鱼胚胎骨骼肌和心肌中表达的时相变化.方法收集不同发育时期的AB野生型斑马鱼胚胎,采用整体原位杂交技术检测Mef2c在骨骼肌和心肌的转录情况.结果Mef2c在体节中的表达约在13 hpf,而在心脏中的表达出现在13 hpf以后,与体节中的表达时间基本平行.另外,Mef2c在体节和心脏中的表达一直维持到48 hpf.结论明确了Mef2c在斑马鱼胚胎骨骼肌和心肌发育的表达时相变化,为研究斑马鱼早期骨骼肌和心肌发育的调控机制提供了一定的理论基础.     

ptges3a基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的克隆斑马鱼前列腺素E合酶3a(prostaglandin E synthase 3a,ptges3a)基因,研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的表达情况。方法提取斑马鱼胚胎的总RNA,制备DIG标记的ptges3a RNA反义探针,整胚原位杂交研究ptges3a在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达。结果 ptges3a在shield期前普遍性表达,10体节期在后脑神经龙骨处有特异性表达,18体节期在后脑有特异性表达,在26 hpf时期头部表达较多,并且在肾小管有特异性表达,36 hpf ptges3a在头部较高表达。结论 ptges3a可能参与了脑部发育和肾小管形成。     

COX基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达

目的克隆斑马鱼COX-1、COX-2a基因,研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的表达情况。方法提取24 h斑马鱼胚胎的总RNA,制备DIG标记的COX-1、COX-2a RNA反义探针,整胚原位杂交研究COX-1、COX-2a在斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达。结果 COX-1在囊胚期和原肠胚期为弥散性表达,18 h集中表达在后部躯干,到24 h,COX-1在输尿管和远端脊索处有表达,24～36 h,头部表达量高,48 hCOX-1的表达弱。COX-2a在原肠胚期前不表达,在10.8 h开始表达,位于前端神经外胚层,在26 h,COX-2a在前脑、小脑和后脑有特异性表达。结论明确了COX-1、COX-2a基因在斑马鱼胚胎发育过程中的表达模式,为研究该基因功能提供了一定的理论基础。     

大鼠胚胎心脏的发育过程及基因HCY-2在大鼠胚胎心脏内的表达

目的 研究大鼠胚胎心脏的发育过程和同型半胱氨酸诱导基因(HCY-2)在大鼠胚胎心脏上的表达，为进一步探讨该基因与心血管疾病之间的关系奠定形态学基础。方法 分别于大鼠妊娠11～19d取胚胎，用组织学和免疫组织化学方法，观察大鼠胚胎心脏的发育过程和Hcy-2基因的表达并进行图像分析。结果 大鼠胚胎心脏11d出现第一房间隔，13d出现第二房间隔，14d心房不完全分隔完成；12d出现室间隔肌部，16d心室巳分隔完成。Hcy-2在大鼠胚胎心脏不同发育时期表达不同，11、12d表达强，13d表达减弱，14、15、16d表达又逐渐增强，17、18、19d表达强。结论 大鼠胚胎心脏内部分隔晚于小鼠；基因Hcy-2与心脏发育密切相关。     

斑马鱼胚胎胚盾特异表达基因的鉴定

目的 由于原肠期细胞的剧烈运动,在斑马鱼胚胎的背侧汇聚形成了称为胚盾（Shield Organizer）的结构,是胚胎发育的信号组织中心,在背腹轴建立和胚层诱导过程中具有关键作用。系统鉴定在胚盾特异表达的基因,可为进一步探讨胚盾形成的机制及其指导胚胎早期发育的分子机理提供参考。方法 Tg(gsc:GFP)转基因鱼在胚盾表达特异的绿色荧光。通过流式细胞分选技术分离富集GFP阳性细胞并提取总RNA进行RNA深度测序,检测可能在胚盾高水平表达的基因。然后利用荧光实时定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和原位杂交技术鉴定若干在胚盾特异表达的基因。结果 从Tg(gsc:GFP)转基因鱼胚胎中分离富集到了纯度超过96%的GFP阳性细胞,RNA深度测序的结果显示有657个基因的表达水平比整胚细胞或GFP阴性细胞高2倍以上。最后,确认了KIAA1324,ripply1,twist2,isthmin1,nme4,zgc174153,rrbp1b等7个基因在胚盾特异表达。结论 系统鉴定到了斑马鱼胚胎胚盾特异表达基因,为下一步研究这些基因的发育生物学功能奠定了基础。     

g6pd基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达

目的: 观察g6pd基因在野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达情况。方法: 利用基因数据库和BLAST软件分别进行g6pd基因的共线性分析和G6pd蛋白质序列相似性分析。原位杂交技术观察不同时相斑马鱼胚胎中g6pd基因的表达;构建g6pd-EGFP-pCS²⁺重组质粒,并将其显微注射入斑马鱼胚胎内,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达;蛋白质印迹法检测24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd蛋白的表达量;改良G6pd定量比值法检测24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd酶活性。结果: g6pd基因在进化过程中相对保守,斑马鱼与人类的G6pd蛋白质相似度为88%,斑马鱼与小鼠的G6pd蛋白质相似度为87%。原位杂交试验结果显示,g6pd基因主要表达于斑马鱼的造血组织,显微注射g6pd-EGFP-pCS²⁺重组质粒后观察的结果与原位杂交试验结果一致。24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd蛋白相对表达量分别为1.44±0.03、1.47±0.05、1.54±0.02,差异无统计学意义（P > 0.05）;G6pd酶活性分别为1.74±0.17、1.75±0.12、1.71±0.22,差异无统计学意义（P > 0.05）。结论: 成功观察到斑马鱼体内g6pd基因表达部位及其变化规律,并测定了不同发育时相斑马鱼胚胎中G6pd蛋白表达和酶活性,为建立斑马鱼G6PD缺乏症模型奠定了基础。     

斑马鱼sh3d19基因的结构和表达分析

目的 探索斑马鱼sh3d19基因生物信息学分析和基因表达模式。方法 利用生物信息学方法对斑马鱼sh3d19的基因结构和物种间进化等进行分析,并运用逆转录PCR技术和胚胎原位杂交技术分析斑马鱼sh3d19在胚胎早期发育中的表达。结果 斑马鱼sh3d19位于1号染色体（ZDB-GENE-050522-481）上,全长85994bp,能编码958个氨基酸,斑马鱼Sh3d19蛋白与其他物种的Sh3d19同源物具有较高保守性。逆转录PCR结果显示,斑马鱼sh3d19在胚胎发育的各个时期表达,但在bud时期表达量较低。原位杂交结果显示,sh3d19在4细胞到3.5h在胚胎所有细胞中广泛表达,在bud时期虽然表达但是表达量较低,在18体节时期该基因在体节中丰富表达,在24h时与非成熟的肌节表达。结论 sh3d19在胚胎发育早期各个时期均表达,但在体节发生时期在体节中丰富表达,该研究结果为今后探究sh3d19基因在组织器官发育中的功能及机制奠定基础。     

干扰素调节因子2结合蛋白2在斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达谱分析

目的·探究干扰素调节因子2结合蛋白2(interferon regulatory factor 2 binding protein 2,irf2bp2)基因的2个横向同源物(irf2bp2a和irf2bp2b)在斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达异同.方法·选取发育不同时间点(胚胎期和幼虫期)的斑马鱼胚胎,通过mRNA全胚...     

下调rpl15基因的表达抑制斑马鱼早期造血的发育

目的 探究核糖体蛋白L15(ribosomal protein 115,rpl15)基因表达下调对斑马鱼早期造血发育的影响.方法 设计并合成rpl15吗啉代反义寡核苷酸(morphilino antisense oligo,MO),通过显微注射到单细胞期斑马鱼(0～0.75 hpf)的受精卵中来下调rpl15的表达,通...     

野生型和C279G突变型UCHL1基因真核表达质粒构建

目的构建人野生型和C279G突变型pEGFP-N1-UCHL1质粒。方法采用RT-PCR方法从人胚脑组织中扩增出人泛素羧基末端水解酶1(UCHLI)基因，插入至pMD18-T vector中；再采用SOE法定点突变，通过酶切和连接，构建野生型和C279G突变型pEGFP-N1-UCHL1。结果酶切和DNA测序证实，野生型和突变型UCHL1基因分别插入到pEGFP-N1中，野生型UCHL1基因序列与GenBank完全一致，C279G突变型UCHL1基因除第279位碱基C被G替代以外，其余序列与野生型完全一致。结论成功构建野生型和C279G突变型UCHL1基因真核表达质粒。     

猪胚胎中差异表达基因检测方法的研究（英文）

[目的]探讨不同检测方法检测猪胚胎中差异表达基因的效果.[方法]采用现行的ACPs differential display技术和改良的ACP方法检测人工授精和核移植猪胚胎中的差异表达基因.改良的ACP方法中第2次cDNA合成过程和DNA扩增过程在分开的步骤中执行.[结果]采用现行的ACP方法无法获得真实扩增的DNA克隆,采用改良的ACP方法时获得了所愿的DNA克隆.[结论]在检测猪胚胎差异表达基因中改良的ACP方法较现行的ACP方法更为有效.