细胞角蛋白13在全反式维甲酸和三氧化二砷诱导分化人口腔鳞癌细胞系KB中的表达

目的研究细胞角蛋白（cytokertin,CK）13及其基因在全反式维甲酸（all—transretinoicacid,ATRA）和三氧化二砷（arsenic trioxide,As2O3）诱导分化人口腔未分化鳞癌细胞系KB中的表达和意义。方法采用MTT法观察ATRA和As2O3对KB细胞的敏感程度,Western blot法和RT—PCR法观察KB细胞经ATRA和As2O3诱导分化后的CK13和CK13-mRNA的表达。结果MTT法显示ATRA和As2O3的ICS0分别为35．9×10^-6mol／L和1．55×10^-6mol／L,As2O3对KB细胞药物化学敏感性比ATRA高;Western blot法显示ATRA和As2O3对KB细胞诱导分化后24hCK13无表达,48hCK13出现弱表达,72hCK13出现明显的表达;RT-PCR法显示ATRA和As2O3对KB细胞诱导分化后24hCK13-mRNA表达明显升高,48h达到高峰,72h出现下降的趋势,并且CK13-mRNA的表达变化提前于CK13的表达。结论CK13可作为口腔鳞癌诱导分化标记物和判断临床口腔鳞癌诱导分化疗效的指标。     

全反式维甲酸和三氧化二砷对人口腔鳞癌细胞系KB细胞周期的影响

目的研究全反式维甲酸（all-trans retinoi cacid,ATRA）和三氧化二砷（arsenic trioxide,As2O3）诱导分化对人口腔未分化鳞癌细胞系KB细胞周期的影响及意义。方法采用流式细胞技术观察人口腔未分化鳞癌细胞系KB细胞经不同浓度ATRA和As2O3诱导分化后96h时的细胞周期的变化。结果ATRA作用于KB细胞后,加药组与对照组相比,被阻断在G1期的细胞比率轻度升高,S期比率下降,抑制率随浓度增高无明显升高的趋势。As2O3三个不同浓度作用KB细胞96h时,没有明显改变各细胞周期所占的比例。抑制率随作用浓度的增加而升高。结论ATRA和低浓度As2O3对人口腔未分化鳞癌细胞系KB细胞具有诱导分化作用,ATRA诱导KB细胞分化可能与G1、G0期阻滞有关。     

As2O3诱导KB和Tca8113细胞分化与包壳蛋白表达的关系

目的探讨As2O3对人口腔鳞癌KB和Tca8113细胞诱导分化的作用与包壳蛋白（involucfin）表达的关系。方法用免疫荧光技术观察As2O3诱导KB和Tca8113细胞分化前后包壳蛋白的表达和变化。结果包壳蛋白在As2O3对人口腔鳞癌KB和Tea8113细胞诱导分化后比其诱导分化前包壳蛋白表达增高。结论As2O3诱导口腔鳞癌分化可导致包壳蛋白表达增高，其作用机理尚不清楚。     

无翅型MMTV整合位点家族成员3在大鼠牙囊及牙囊细胞成骨分化中的表达

目的 研究无翅型MMTV整合位点家族成员3(wingless-type MMTV integration site family,member 3,Wnt3)在大鼠体内外牙囊中的表达,检测成骨诱导后Wnt3在大鼠牙囊细胞中的表达变化,探讨Wnt3在牙囊成骨分化中的作用.方法 取出生后1、3、5、7、9、11、13 d的SD仔鼠各1只,引颈处死,切取下颌骨,取出生后各时间点的组织切片各3张作为实验组,阴性对照组以磷酸盐缓冲液代替一抗,滴加在出生后11d的组织切片上,其余处理同实验组.免疫组化检测Wnt3在大鼠体内牙囊中的表达.间接免疫荧光检测Wnt3在牙囊细胞内的表达和分布.茜素红染色检测成骨诱导后矿化结节的形成.蛋白质印迹法检测成骨诱导1、2、3周后牙囊细胞中Wnt3和β-联蛋白(β-catenin)表达的变化.结果 Wnt3在出生后第1、3天的大鼠牙囊组织内无明显表达,第5天开始出现阳性表达,并持续表达至第13天.免疫荧光检测显示Wnt3在牙囊细胞胞质中表达.成骨诱导后牙囊细胞分化为成骨细胞,形成矿化结节,茜素红染色阳性.成骨诱导第1周Wnt3蛋白表达(2.60±0.04)较阴性对照组(1.00±0.00)显著增加(P＜0.05),并随着诱导时间的延长Wnt3表达逐渐减少,至第3周Wnt3在成骨诱导组表达水平(1.00±0.05)与阴性对照组基本相等,差异无统计学意义(P＞0.05).β-联蛋白在成骨诱导1、2、3周后表达增加(分别为1.95±0.05、9.77 ±0.65、1.75±0.21),与阴性对照组(1.00 ±0.00)相比差异均有统计学意义(P＜0.05),并在第2周达峰值(9.77±0.65),后逐渐降低.结论 Wnt3在体内外大鼠牙囊中表达,成骨诱导早期牙囊细胞中Wnt3表达明显增加,提示Wnt3可能参与牙囊细胞的早期成骨向分化;Wnt3和β-联蛋白在成骨诱导过程中表达水平的差异提示Wnt3可能与其他因子或信号通路成分相互作用,调控β-联蛋白的表达,参与牙囊细胞的成骨向分化.     

三氧化二砷对舌鳞癌细胞凋亡及端粒酶逆转录酶基因的作用

目的　研究三氧化二砷(As2O3)对舌鳞癌细胞株(Tca8113)增殖的影响及对端粒酶逆转录酶基因(hTERT mRNA)的作用,并初步探讨三氧化二砷的作用机制。方法　以舌鳞癌细胞株(Tca8113)为研究对象,采用噻唑蓝 (MTT)、Annexin V/碘化丙锭(PI)染色法检测细胞生长抑制率和细胞凋亡率;采用Western blot检测细胞hTERT蛋白 的表达;采用RT-PCR法检测细胞hTERTmRNA的表达情况。结果　As2O3能够明显抑制Tca8113细胞增殖,诱导 细胞凋亡,并有浓度、时间依赖性。5μmol/L As2O3组72 h细胞生长抑制率为83·40%±7·31%,细胞凋亡率为 26·40%±3·42%。As2O3能抑制hTERTmRNA的表达和翻译,随As2O3作用时间、浓度增加,细胞hTERTmRNA和蛋 白表达减弱,各实验组与对照组比较差异有统计学意义(P<0·05)。结论　As2O3可以明显抑制Tca8113细胞增殖, 诱导舌癌细胞凋亡,并抑制端粒酶催化亚基基因的表达,诱导细胞凋亡和抑制hTERT转录和翻译可能是其作用机 制之一。     

全反式维甲酸诱导大鼠骨髓间充质细胞脂肪化

目的 探讨全反式维甲酸(ATRA)对大鼠骨髓间充质细胞(BMSCs)脂肪化的诱导作用.方法 分离大鼠BMSCs,将原代细胞分别应用普通培养基(CM)、成骨诱导培养基(OM)、ATRA、OM+ATRA诱导培养.检测BMSCs的增殖情况;应用脂滴油红O染色法检测BMSCs的分化程度;RT-PCR检测骨形成蛋白受体(BMP-R)的表达情况.结果 BMSCs在4种培养基中均生长良好.脂滴油红O染色显示ATRA组阳性,CM组和OM组阴性.培养9 d后,ATRA组比CM组BMP-RⅠA表达水平显著升高(P<0.05);OM或ATRA组Smad5 mRNA表达明显高于CM组(P<0.01).结论 ATRA可诱导BMSC脂肪化及抑制骨形成.其机理可能与BMP信号通路相关,即诱导BMP-RⅠA的表达.     

人牙髓细胞与牙周韧带细胞多向分化能力的比较

目的 比较人牙髓细胞(dental pulp cells,DPC)和牙周韧带细胞(periodontal ligamentcells,PDLC)的多向分化能力,揭示其干细胞成分特征,为开展干细胞介导的生物牙根再生奠定实验基础.方法 酶消化法分离培养人DPC和PDLC,流式细胞术检测STRO-1的表达.诱导细胞成牙本质及成骨分化、成脂分化和成软骨分化,von Kossa染色、抗骨钙素(osteocalcin,OCN)和牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)免疫组化染色、油红O染色、阿新蓝染色、抗Ⅱ型胶原免疫组化染色以及实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)等检测DPC和PDLC的多向分化.结果 DPC和PDLC体外呈克隆样生长,STRO-1阳性率分别是(16.5%±4.2%)和(11.6%±1.1%).100%的DPC和83.3%的PDLC样本可多向分化.细胞诱导分化后,OCN、牙本质涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein,DSPP)、过氧化物酶体激活物增生受体2(peroxisomal proliferator activated receptorgamma 2,PPARγ2)、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)和Ⅱ型胶原mRNA表达上调,与诱导前相比差异均有统计学意义(P<0.001),DPC和PDLC间OCN和PPARγ2基因上调倍数的差异有统计学意义(P<0.001).结论 人DPC和PDLC的间充质干细胞比例和多向分化能力相似.     

肝素对大鼠下切牙釉原蛋白水平及细胞凋亡的影响

目的建立肝素诱导骨质疏松大鼠模型,观察肝素的应用对大鼠下切牙釉原蛋白水平及其细胞凋亡的影响。方法取24只4周龄清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为两组,实验组每日于腹部皮下注射肝素1U/g,对照组于相同部位注射等体积0.9%氯化钠溶液。4周后取大鼠右侧股骨测骨密度值。同时取下颌骨,沿正中联合分为两份,一侧颌骨及下切牙脱钙后制作石蜡切片,行釉原蛋白免疫荧光染色;另一侧脱钙后制作石蜡切片,行原位末端标记(TUNEL)染色,观察下切牙细胞的凋亡情况。实验数据采用SPSS17.0统计软件包进行统计学分析。结果实验组大鼠股骨的骨密度值为(0.185±0.006)g/cm2,低于对照组的(0.196±0.011)g/cm2;实验组下切牙釉原蛋白免疫荧光染色强度为(0.0432±0.0043),低于对照组的(0.0570±0.0096);两组骨密度及荧光强度差异均具有统计学意义(P<0.05)。实验组未见细胞凋亡发生,对照组可见个别成牙本质细胞及中间层细胞凋亡阳性着色。结论肝素可诱导大鼠骨质疏松,降低下切牙釉原蛋白表达及抑制细胞凋亡的发生。     

苦参碱对KB细胞及其多药耐药细胞KBv200的凋亡诱导作用

目的　观察中药苦参的提取物苦参碱对口腔上皮癌KB细胞及其多药耐药细胞KBv200的凋亡诱导作用。 方法　MTT法观察苦参碱对体外培养的KB及KBv200细胞存活率的影响。吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)双荧光染色检 测二者细胞凋亡率。流式细胞术分析苦参碱对细胞周期的影响;扫描电镜观察苦参碱作用后的细胞形态学变化。 结果　苦参碱质量浓度在0·50、1·00、1·50、2·00 mg/ml时,均有抑制KB及KBv200增殖的作用,双荧光染色及流式细 胞术提示苦参碱可诱导KB及KBv200细胞凋亡,使细胞生长停滞在S期;扫描电镜观察发现不同质量浓度的苦参 碱作用24 h后,细胞出现体积缩小、细胞质空泡化、细胞核碎裂等凋亡现象。结论　苦参碱对KB及KBv200细胞有 增殖抑制作用,可诱导KB及KBv200细胞凋亡,其机制可能与其导致细胞S期阻滞有关。     

脂多糖对诱导分化的牙髓细胞形成矿化基质的影响

目的 研究脂多糖对诱导分化的牙髓细胞牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、骨钙素基因表达及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的影响. 方法 以脂多糖作用于诱导分化的牙髓细胞,用荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测DSPP、骨钙素mRNA的表达,ALP试剂盒检测ALP活性改变. 结果 诱导分化的牙髓细胞在脂多糖刺激后ALP活性由(1156.10±100.60)pmol·h-1·ng-1下降为(884.80±26.72)pmol·h-1·ng1,荧光定量RT-PCR显示脂多糖能显著抑制DSPP和骨钙素mRNA表达,其中DSPP拷贝数由(176 301.62±13 269.77)下降为(39 396.32±12 018.08),骨钙素拷贝数由(4971.46±483.91)下降为(1104.67±63.37)(t=7.922,P<0.001). 结论 脂多糖能显著降低诱导分化的牙髓细胞合成有机基质.     

All-trans retinoic acid restores gap junctional intercellular communication between oral cancer cells with upregulation of Cx32 and Cx43 expressions in vitro

Objective: All-trans retinoic acid (ATRA) has been demonstrated to inhibit tumor growth by restoration of gap junctional intercellular communication (GJIC) via upregulation of connexin (Cx) expression in some solid tumors. However, the relationship between ATRA and GJIC remains unclear in oral squamous cell carcinoma (OSCC). The aim of this study was to investigate the effect of ATRA on the GJIC function of OSCC. Study design: We measured the effects of ATRA on the viability and cell cycle distribution of SCC9 and Tca8113 OSCC cells. The GJIC function was observed using the scrape-loading dye transfer technique, and the mRNA and protein levels of Cx32 and Cx43 were detected by qRT-PCR, Western blot, and immunofluorescence assays. Results: ATRA inhibited the growth of OSCC cells in a dose- and time-dependent manner (P <0.05) and caused cell cycle arrest. ATRA-treated cells showed a 2.69-fold and 2.06-fold enhancement of GJIC in SCC9 and Tca8113 cells, respectively (P <0.05). Moreover, ATRA induced upregulation of Cx32 and Cx43 at both the mRNA and protein levels in OSCC cells. Conclusion: Our results indicated that restoration of GJIC via enhanced Cx32 and Cx43 expression might serve as a novel mechanism for the anti-tumor effect of ATRA in OSCC. Key words:All-trans retinoic acid, oral squamous cell carcinoma, connexin, gap junctional intercellular communication.     

间隙连接蛋白43在口腔颌面部鳞癌组织及舌癌细胞株(Tca8113)中表达的研究

目的:探讨间隙连接蛋白43(Cx43)在口腔鳞癌组织(oscc)和舌鳞癌细胞株(Tca8113)中的表达及其生物学行为的关系;细胞分化诱导剂全反式维甲酸(ATRA)对人舌鳞癌细胞株(Tca8113)中Cx43表达的影响。方法:应用免疫组织、细胞化学、免疫荧光及结合免疫印迹技术,观察OSCC组织中以及ATRA对Tca8113细胞株进行培养及分化诱导后Cx43在蛋白水平的变化。结果:Cx43在正常口腔鳞状上皮主要表达于相邻细胞间相互接触的细胞膜上,而在OSCC组织中,Cx43细胞膜表达与组织的分化程度、转移之间有显著性差异(Cx43:х2=7.42、12.43,P<0.05、P<0.01)。免疫细胞化学检测可见舌癌细胞中Cx43异常定位于细胞浆中和/或细胞膜不与邻近细胞接触的游离缘上。Tca8113经ATRA诱导后,Cx43蛋白表达增加。结论:Cx43表达的改变与OSCC的发生和发展有关。ATRA可以通过上调Cx43表达,实现对肿瘤生长的抑制     

OPN和MMP-3在口腔鳞癌组织中的表达及意义

目的　研究骨桥蛋白（OPN）、基质金属蛋白酶-3（MMP-3）在口腔鳞癌组织中的表达、临床意义及相关性。方法　采用免疫组化法检测60例口腔鳞癌组织、30例正常口腔黏膜组织中OPN、MMP-3的表达情况,分析病理特征及相关性。结果　(1)口腔鳞癌组织中OPN及MMP-3阳性表达率分别为68.0%和75.0%,与正常口腔黏膜组相比较差异有统计学意义(P＜0.05);(2)OPN及MMP-3在口腔鳞癌中的表达与颈淋巴结转移程度、肿瘤分化程度、临床分期有关（P＜0.05）;（3）口腔鳞癌组织中OPN及MMP-3的表达呈正相关,且Spearman相关系数=0. 269(P＜0.05)。结论　OPN、MMP-3 在口腔鳞癌中均高表达,与口腔鳞癌的发生、发展密切相关,且在口腔鳞癌的发生、发展过程中它们的高表达具有协同作用,有可能为口腔鳞癌的早期诊断、判断预后以及靶向治疗提供依据。     

Nav1.6在口腔黏膜白斑及口腔鳞癌中的表达

目的:探讨钠离子通道Nav1.6在口腔黏膜白斑及口腔鳞癌中的表达及意义.方法:采用免疫组化SP法及Westernblot法检测Nav1.6在口腔正常组织(21例)、白斑(32例)及口腔鳞癌组织(63例)中的表达情况.结果:免疫组化检测,Nav1.6在正常组、口腔白斑组以及癌症组中的阳性表达率分别为6.25％、40％、76.74％;Nav1.6的表达与口腔鳞癌的病理分期有关.Western blot检测,正常组、口腔白斑组、癌症组中Nav1.6的蛋白表达量分别为:0.469±0.015、0.545±0.016、0.848 ±0.020(P ＜0.05).结论:Nav1.6在口腔黏膜癌前病变及口腔鳞状细胞癌的发生和发展中可能起到了一定的作用.     

CD4~+CD25~+调节性T细胞在口腔鳞状细胞癌中的变化及临床意义

目的 观察CD4+CD25+调节性T细胞特异性转录因子FOXP3在口腔鳞状细胞癌(鳞癌)中的表达情况,以探讨其在口腔鳞癌发生发展中的临床意义。方法 通过免疫组化SP法检测10例正常口腔黏膜组织和36例口腔鳞状细胞癌中FOXP3的表达。结果 FOXP3阳性的CD4+CD25+调节性T细胞在高分化组中的阳性率为26.4%、中分化组为42.7%、低分化组为63.5%,与正常组2.81%相比,差异有统计学意义(P<0.05),且其阳性率与与肿瘤分化程度密切相关(P<0.05)。结论 FOXP3阳性的CD4+CD25+调节性T细胞的表达水平的增加与机体免疫功能低下密切相关,其在口腔鳞癌的发生发展中可能起着重要的作用。     

三氧化二砷结合低剂量照射对口腔癌细胞抑制作用的研究

目的探讨三氧化二砷（AS2O3）和低剂量照射（750cGY）结合对口腔鳞癌细胞和人血管内皮细胞的体外抑制作用。方法采用MTT法检测不同浓度AS2O3单独作用或与低剂量照射结合对口腔鳞癌细胞系Tca8113细胞和KB细胞以及人血管内皮细胞系（HUVEC）增殖的影响;通过克隆形成试验、流式细胞技术检测不同浓度AS2O3单独作用或与低剂量照射结合对Tca8113和KB细胞的克隆形成抑制和诱导凋亡作用;采用体外血管形成试验验证AS2O3单独作用或与低剂量照射结合对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）血管形成的作用。结果 AS2O3结合低剂量照射对Tca8113细胞、KB细胞和人血管内皮细胞都有明显的生长抑制作用,还可以诱导Tca8113细胞和KB细胞凋亡并显著抑制两种细胞的体外克隆形成率。AS2O3和低剂量照射结合使人血管内皮细胞体外血管的形成明显减少。结论 AS2O3结合低剂量照射对口腔鳞癌细胞具有显著的体外生长抑制及凋亡诱导作用,还可以明显抑制体外血管形成。     

细胞角蛋白18-mRNA的表达与口腔鳞状细胞癌侵袭转移的关系

目的 探讨单层细胞角蛋白(cytokeratin,cK)18-mRNA表达与口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)的局部侵袭与血道转移的关系.方法 选用23例OSCC组织及相应癌旁组织,通过半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法在不同时段检测CK-18-mRNA在OSCC外周血中的表达,探讨CK-18-mRNA与OSCC远处转移及复发的关系.结果 23例OSCC组织中有16例CK-18-mRNA呈阳性表达,但表达量存在明显差异(P＜0.01),与肿瘤部位无关.OSCC组织中CK-18-mRNA表达量[(29.30±22.37)%]显著高于痛旁组织[(15.50±11.07)%,P＜0.01];其表达量与临床分期、分化程度及淋巴结转移有关.23例OSCC术前外周血中有4例出现CK-18-mRNA表达,仪1例在随访过程中始终存在CK-18-mRNA的表达.结论 CK-18-mRNA可作为预测OSCC侵袭转移的辅助指标,中晚期患者外周血中CK-18的表达不能作为确诊OSCC远处转移的指标,但通过连续观察能够为监测OSCC转移与复发提供参考依据.     

RB1CC1在人和小鼠口腔癌发生发展中表达的比较研究

目的:比较视网膜母细胞瘤RB1-诱导卷曲蛋白1(RB1CC1)在人和小鼠正常口腔黏膜、上皮异常增生组织及口腔鳞状细胞癌中的表达,并探讨其在口腔癌发生发展过程中的作用。方法:采用免疫组化和RT-PCR检测人及小鼠在正常口腔黏膜、上皮异常增生、高分化鳞癌原发灶组织中RB1CC1蛋白及基因的表达情况。结果:RB1CC1蛋白在人上皮异常增生组、高分化鳞癌组的阳性表达高于正常组(P<0.05);RB1CC1蛋白在鼠正常组、异常增生组、高分化鳞癌组阳性表达逐渐增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。人RB1CC1 mRNA的表达量在异常增生组与高分化鳞癌组无明显差异,正常口腔黏膜组均高于异常增生组与高分化鳞癌组(P＜0.05);小鼠RB1CC1 mRNA的表达量在正常口腔黏膜组与异常增生组、高分化鳞癌组差别无统计学意义。结论:RB1CC1表达在人和小鼠相似, RB1CC1可能参与了口腔鳞癌的早期癌变过程。