皮肤成纤维细胞构建组织工程化猪角膜基质样组织

目的 探讨以皮肤成纤维细胞为种子细胞,在猪角膜微环境中构建组织工程化角膜基质组织的可行性.方法 分离获取胎猪皮肤成纤维细胞经体外培养、扩增.通过转染绿色荧光蛋白(GFP)基因标记细胞,示踪细胞的转归.选取第3代的细胞接种于可吸收生物材料聚羟基乙酸(PGA),形成细胞-生物材料复合物,体外培养1周后,移植于猪的角膜基质层内,于第8周取材进行大体、组织学检查及超微结构观察.以角膜基质细胞为种子细胞构建的组织工程化角膜基质组织作为对照.结果 术后8周,实验组角膜逐渐恢复透明,与对照组角膜无明显差别.组织学检查显示形成新生的角膜基质样组织,呈板层状,排列较规则,与对照组角膜组织相似.超微结构观察及胶原纤维直径检测显示,实验组与对照组角膜组织差异无统计学意义.荧光显微镜观察到GFP阳性细胞存在.结论 皮肤成纤维细胞可能替代角膜基质细胞,在猪角膜内构建角膜基质样组织.     

脂肪干细胞构建组织工程化角膜基质组织

 目的 探讨以可降解高分子材料聚羟基乙醇（polylactic-co-glycolic acid,PLGA）为支架,复合自体脂肪干细胞构建组织工程角膜基质修复角膜基质层缺损的可行性。方法 兔脂肪干细胞（rabbit adipose derived stem cells,rASCs）培养至第4代接种在PLGA载体支架上,扫描电镜观察细胞在支架上生长黏附情况。体外培养7天后将rASCs-PLGA复合物回植到角膜基质缺损模型的兔角膜基质层间,术后第12周和24周取材行组织学和透射电镜超微结构观察。未接种细胞的PLGA材料移植基质层间作为对照组。结果 细胞在PLGA支架上生长增殖良好,实验组移植术后12周材料降解,角膜基本恢复透明。组织学检查显示移植后24周新生角膜基质样组织与正常角膜基质组织相似,电镜下胶原纤维直径与正常角膜基质组织比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论 脂肪干细胞可作为种子细胞来源用于构建组织工程角膜基质。     

皮肤成纤维细胞构建组织工程化肌腱的初步研究

目的　探讨以皮肤成纤维细胞为种子细胞的组织工程化肌腱体内形成。方法　取猪自体皮肤成纤维细胞经体外培养、扩增 ,与可吸收生物材料聚羟基乙酸形成细胞—生物材料复合物 ,将该复合物植入手术缺损的右侧趾浅屈肌腱处 ,6周取材 ,对标本进行大体、组织学、电镜检查及生物力学评价。结果　新生组织在大体形态、细胞与胶原排列方式上与正常肌腱相似。新生组织的最大张力和最大应力分别为 1 73 0± 1 8 2与 1 8 9± 1 9N/mm2 ,分别达到左侧同一部位正常肌腱的 57 4%与51 9%。结论　应用组织工程技术以成纤维细胞作为种子细胞可在动物体内形成肌腱样新生组织并能修复肌腱缺损     

应用人皮肤成纤维细胞体外构建组织工程化肌腱

目的 探讨应用国产可吸收生物材料聚羟基乙酸(PGA)和人皮肤成纤维细胞在体外构建组织工程化肌腱的可行性.方法 酶消化法获得人皮肤成纤维细胞经体外培养、扩增至第2代,接种于PGA材料(将材料固定于U形弹簧)并给予持续张力作为实验组(n=15);接种成纤维细胞但不给予任何张力作为对照组1(n=15),即无张力组;给予张力但未接种细胞的单纯PGA为对照组2(n=3),即无细胞组;给予张力并接种肌腱细胞的作为对照组3(n=5,仅限第9周时间点),即肌腱细胞组.体外培养后分别于第2、5、9、14和18周取材进行组织学、生物力学和电镜检测.结果 第2周时,实验组与无张力组大体观察未见明显差异,组织学上主要是未降解的PGA纤维,电镜观察显示细胞在材料上黏附伸展良好.第5周时,除无细胞组外均有新生肌腱样组织形成,组织学检查提示胶原纤维形成.第9周时,无细胞组PGA发生断裂;实验组形成的肌腱组织直径为(1.18±0.25)mm,明显细于无张力组[(2.43±0.49)mm,P=0.017];实验组和肌腱细胞组除后者细胞数量略少外,在大体和组织学上较为相似.实验组形成的胶原包括Ⅰ型和Ⅲ型,细胞和胶原纤维沿受力方向排列,类似正常肌腱;无张力组则杂乱排列,且残留PGA较多.实验组的抗张强度为(2.75±0.59)MPa,接近肌腱细胞组[(3.08±0.30)MPa,P=0.439],明显强于无张力组[(0.82±0.21)MPa,P=0.006].第14周时,无细胞组的PGA基本降解;实验组胶原纤维直径增粗,死亡细胞增多,出现中空现象,但抗张强度比同组第9周时增加.第18周时,实验组中空现象更为明显,抗张强度下降,余与同组第14周时相似.结论 应用人皮肤成纤维细胞在体外可以构建出与肌腱细胞所构建的相类似的人肌腱样组织,施加一定张力可能更有利于组织形成,但体外培养时间不宜过长.     

应用GFP标记技术示踪裸鼠体内组织工程化骨的形成

目的 应用绿色荧光蛋白(GFP)标记技术，观察组织工程化骨体内形成过程中种子细胞的变化与转归。方法 用GFP重组逆转录病毒载体(GFP-RV)转染犬骨髓基质于细胞(BMSCs)，将其接种于β-磷酸三钙(β-TCP)，形成细胞—材料复合物，移植于裸鼠皮下。术后8周，HE染色观察组织结构，碱性磷酸酶(AKP)染色和骨钙素(OCN)免疫组化检测功能蛋白，激光共聚焦显微镜下对GFP进行示踪观察。结果 8周后，大体可见组织工程化新骨形成，组织学示新生骨小梁围绕材料孔隙生成，AKP染色和OCN免疫组化结果阳性，并可见新生组织内有呈绿色的GFP标记细胞，β-TCP部分降解。结论 组织工程化骨组织学结构与松质骨小梁类似。新生组织表达GFP，证实组织工程化骨组织的形成来源于供体细胞。     

组织工程化皮肤移植后真皮演变的观察

目的　探索应用组织工程技术修复全层皮肤缺损后真皮的演变过程。方法　选用长枫杂交仔猪为实验动物 ,取腹部 2cm× 2cm全厚皮肤 ,酶消化法获取皮肤表皮细胞与成纤维细胞 ,体外经原代培养 ,将处于对数生长期的表皮细胞、成纤维细胞分别与PluronicF 12 7混匀成细胞悬液后 ,种植聚羟基乙酸 (polyglycolicacid ,PGA)形成细胞 生物材料复合物 ,用于修复自体动物背部直径 4cm全层皮肤缺损 ,以单纯生物材料 (PGA +Pluron ic)充填的创面作为阴性对照。分别于修复术后 1,2 ,4 ,8周取材 ,通过组织学和电镜等方法对新生组织进行评价。结果　第 1周实验组分表皮与真皮两部分 ,真皮内有少量胶原合成 ,成纤维细胞量多 ,内质网扩张 ;第 2周真皮较前增厚 ,胶原合成量增加。第四周真皮内的成纤维细胞数量减少 ,胶原量较前增多。第八周真皮内成纤维细胞的数量明显较前减少 ,部分成纤维细胞呈凋亡样改变 ,组织工程化皮肤的真皮结构与正常皮肤接近。结论　成纤维细胞 PGA Pluronic复合物移植后逐渐演变为正常真皮     

应用GFP标记技术示踪裸鼠体内组织工程化骨的形成

目的应用绿色荧光蛋白(GFP)标记技术,观察组织工程化骨体内形成过程中种子细胞的变化与转归.方法用GFP重组逆转录病毒载体(GFP-RV)转染犬骨髓基质干细胞(BMSCs),将其接种于β-磷酸三钙(β-TCP),形成细胞-材料复合物,移植于裸鼠皮下.术后8周,HE染色观察组织结构,碱性磷酸酶(AKP)染色和骨钙素(OCN)免疫组化检测功能蛋白,激光共聚焦显微镜下对GFP进行示踪观察.结果 8周后,大体可见组织工程化新骨形成,组织学示新生骨小梁围绕材料孔隙生成,AKP染色和OCN免疫组化结果阳性,并可见新生组织内有呈绿色的GFP标记细胞,β-TCP部分降解.结论组织工程化骨组织学结构与松质骨小梁类似.新生组织表达GFP,证实组织工程化骨组织的形成来源于供体细胞.     

ES细胞源表皮样干细胞与胶原海绵体外构建组织工程化皮肤

【目的】 探讨以ES细胞源表皮样干细胞构建组织工程皮肤的方法，为构建新的组织工程皮肤奠定基础。【方法】 先把成纤维细胞放置于胶原海绵真皮支架内，体外培养2d，再放置ES细胞源表皮样干细胞，体外培养3d，观察其形态和进行免疫组化检测。【结果】 成纤维细胞与ES细胞源表皮样干细胞均在真皮支架内黏附，免疫组化表明ES细胞源表皮样干细胞仍呈Bl整合素强阳性和CK15、CK19阳性。【结论】 结果提示ES细胞源表皮样干细胞在体外构建的组织工程化皮肤内仍维持未分化状态。     

ES细胞源表皮样干细胞与胶原海绵体外构建组织工程化皮肤

 【目的】 探讨以ES细胞源表皮样干细胞构建组织工程皮肤的方法，为构建新的组织工程皮肤奠定基础。【方法】 先把成纤维细胞放置于胶原海绵真皮支架内，体外培养2d，再放置ES细胞源表皮样干细胞，体外培养3d，观察其形态和进行免疫组化检测。【结果】 成纤维细胞与ES细胞源表皮样干细胞均在真皮支架内黏附，免疫组化表明ES细胞源表皮样干细胞仍呈Bl整合素强阳性和CK15、CK19阳性。【结论】 结果提示ES细胞源表皮样干细胞在体外构建的组织工程化皮肤内仍维持未分化状态。     

PGA支架上人与猪皮肤成纤维细胞增殖和基质分泌的比较

目的对人与猪皮肤成纤维细胞作为肌腱组织工程种子细胞,进行可行性比较。方法酶消化法获取人与猪皮肤成纤维细胞,培养扩增,取第2代细胞,以1×106/mL的细胞密度接种至聚羟基乙酸(PGA)圆柱形支架上体外培养。通过大体、组织学及增殖曲线观察,羟脯氨酸定量测定以及免疫组化检测,比较两种细胞在PGA支架的黏附、增殖及基质分泌能力。结果组织学及三维增殖曲线观察结果显示,与猪皮肤成纤维细胞比较,人皮肤成纤维细胞与支架的黏附能力及细胞增殖能力良好;接种后第6天和第12天,HE染色可见人皮肤成纤维细胞-PGA复合物有连续的基质形成,两者羟脯氨酸含量分别为(2.23±0.25)μg/mgprotvs(1.07±0.18)μg/mgprot和(3.72±0.39)μg/mgprotvs(0.27±0.04)μg/mgprot,差异具有统计学意义(P<0.05);免疫组化结果显示,接种后第12天,两种复合物的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达均呈阳性。结论与猪皮肤成纤维细胞相比,人皮肤成纤维细胞更有希望作为肌腱组织工程的种子细胞。     

以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜的构建及移植

目的进行体外分离和培养兔角膜缘干细胞,使之成为一种上皮组织,以便进行角膜移植。方法组织块法体外培养兔角膜缘干细胞：角膜缘组织块作为外植体,在脱细胞猪角膜基质上培养;获得的复合角膜上皮组织移植于兔眼,观察并记录兔角膜组织生长情况,待角膜组织生长良好后做免疫组织化学鉴定。结果兔角膜缘组织应用组织块法在脱细胞角膜基质上生长9~10 d后达到80%汇合状态,显微镜下动态观察细胞生长良好,增殖能力较高,将组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植于兔眼后,4~5 d角膜上皮光滑,20~21 d角膜变为透明,荧光素染色只见缝线处少许着色,期间未见角膜移植排斥反应。术后30 d HE染色显示角膜组织与宿主角膜组织结合良好,上皮细胞可见4~5层结构,可见角膜缘干细胞多呈卵圆形;免疫荧光染色可见培养的细胞P63、CK3单克隆抗体呈阳性表达。结论以组织块法生长的以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜可在角膜缘干细胞缺乏的兔眼上生长良好。     

Treatment of rabbit corneal with skin epidermal stem cells

OBJECTIVE: To construct artificial rabbit corneas with autologous skin epidermal stem cells and allogenic stromal cells in vitro and promote healing of corneal wounds. METHODS: Skin epidermal stem cells were isolated from autologous skin samples. Keratocytes were isolated from newborn cornea biopsies. The cells were combined with acellular porcine corneal stroma scaffold to construct artificial corneas. Then the constructed artificial corneas were used to repair severe vision loss caused by complete loss of corneal epithelial stem cells. RESULTS: Cultured skin epidermal stem cells and keratocytes were in good growth conditions. Cultured artificial corneas consisted of multiplayer epithelial cells growing on stroma equivalent consisting of stromal matrix with incorporated keratocytes. The in vitro constructed artificial corneas were histologically similar to normal rabbit corneas. Three months after transplantation, the cornea wounds were healed and the rabbit cornea became transparent. CONCLUSION: The artificial corneas were constructed successfully in vitro and can be used to repair severe vision loss caused by complete loss of corneal epithelial stem cells.     

利用表皮干细胞治疗兔角膜缘干细胞缺损

目的利用自体表皮干细胞与异体角膜基质细胞在体外构建双层组织工程角膜,并修复兔角膜缘干细胞的缺损.方法建立兔角膜缘干细胞缺损模型,以去细胞猪角膜基质片作为支架材料,以自体表皮干细胞与异体角膜基质细胞作为种子细胞,在体外构建组织工程角膜,并用来修复兔角膜缘干细胞缺损.结果利用自体表皮干细胞与异体角膜基质细胞复合异种去角膜基质片在体外成功构建组织工程角膜;构建的组织工程角膜与正常角膜相似,具有上皮层和基质层;用组织工程角膜修复兔角膜缘干细胞缺损3个月后,损伤角膜透明度恢复良好,组织学结构基本恢复正常.结论成功构建了兔的双层组织工程眼角膜,并修复了兔角膜缘干细胞缺损.     

偏光显微镜在组织工程血管构建中的应用

目的利用偏光显微镜对组织工程构建血管壁中的胶原成分进行定性分析。方法体外培养、扩增的人脐带动脉平滑肌细胞,将其与可降解生物材料聚乙醇酸(PGA)制成的管状结构结合(实验组),体外培养1周后植入裸鼠背部皮下。于植入后2、4、5、11周时分别取材,普通光镜(HE和Masson染色)及偏光显微镜下观察组织学形态,并比较结果。以无细胞单纯管状PGA-DMEM植入裸鼠背部皮下作为对照。结果偏光显微镜下,随着植入时间的延长,实验组的PGA-平滑肌细胞复合结构从以PGA为主向以胶原和平滑肌细胞为主要成分过渡;对照组则随着PGA的降解无胶原成分形成。偏光显微镜检测结果与光镜下的组织形态学检查结果相同。结论偏光显微镜可用于组织工程血管壁中胶原成分的检测,方法简便且结果可靠。     

细菌纤维素构建组织工程角膜基质的方法及其评价

目的：探讨以细菌纤维素(BC)为支架构建组织工程角膜基质的可行性。方法： 体外分离培养兔和人角膜基质细胞,种植到BC膜中,构建完成后进行兔和人角膜基质细胞-BC复合膜的生物检测,并将兔角膜细胞生物复合物进行同种异体移植。术后1、4和8周时分别活体行前节OCT、角膜共焦显微镜检查,离体后组织学及免疫组织化学检查。结果： 人和兔角膜基质细胞长入BC的网架结构,细胞生长状态良好。移植术后1周兔眼无炎症反应及新生血管,4周后植片边缘出现新生血管,表面无水肿及溃疡形成。术后8周角膜共焦显微镜显示：移植片周围基质细胞增生活跃,邻近的角膜内皮细胞数量和形态正常。前节OCT显示：移植后复合膜逐渐降解,4周时复合膜边界模糊,8周时密度接近正常角膜组织。离体组织学检查显示：BC复合膜与正常角膜基质相似,有炎细胞浸润和血管形成,角膜组织无坏死和溶解。结论： BC无细胞毒性,具有良好的组织相容性和可降解性,可作为构建组织工程角膜基质的生物支架。     

骨髓基质细胞修复猪膝关节非负重区软骨与骨复合缺损的实验研究

目的 探讨猪骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSC)复合聚羟基乙酸／聚乳酸(PGA／PIA)支架修复关节软骨与骨复合缺损的可行性。方法 杂交猪18只,抽取股骨骨髓,体外培养、扩增BMSC并分别经地塞米松诱导(A组)或地塞米松与转化生长因子β1(TGFβ1)联合诱导(B组),以免疫组织化学、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测其软骨分化表型。其中有2只猪部分BMSC经绿色荧光蛋白(GFP)基因转染标记。诱导后的细胞分别接种到PGA／PLA支架,体外培养1周后植入猪自体股骨下端非负重面软骨及骨复合缺损处,单纯支架植入(C组)及空白不处理(D组)作为对照。上述动物分别于3(6只)、6(10只)个月时取材,进行大体观察、修复结果分级、组织学检查、葡糖氨基聚糖(GAG)含量测定及生物力学测定。含GFP标记细胞的2只猪7个月时取材,共聚焦显微镜观察植入细胞的分布。结果 诱导后BMSC均能表达软骨特征性的Ⅱ型胶原与聚集蛋白聚糖(aggrecan),两组细胞均与支架材料黏附良好。术后大体观察与组织学检查显示：A组缺损以不完全修复为主,多数缺损软骨修复不良,而骨缺损基本修复,组织学主要为纤维性软骨及松质骨;B组缺损以完全修复为主,组织学表现为透明软骨及松质骨,少部分标本修复组织中含有纤维性软骨;两对照组缺损主要由纤维性组织修复或无明显新生组织,软骨与骨缺损均明显存在。3个月时,A、B组软骨修复组织弹性模量分别达到正常关节软骨的30．37％及43．82％,6个月时达到正常的62．69％及80．27％。6个月时,A组软骨修复组织GAG含量达到正常的78．03％,B组与正常组间差异无显著意义。含GFP标记细胞的修复标本经共聚焦显微镜观察可见：新生的软骨陷窝及松质骨小梁内均含有荧光标记的细胞。结论BMSC在关节缺损内可分别向软骨细胞与成骨细胞分化,同时修复软骨与骨复合缺损,恢复关节正常结构;TGFβ1与地塞米松联合诱导可促进BMSC向软骨细胞分化,改善其修复关节缺损的效果。     

软骨细胞与骨髓基质细胞共培养构建软骨的体内评价

目的探讨软骨细胞与骨髓基质细胞（BMSC）共培养体外构建复合物体内植入形成成熟软骨组织的可行性。方法体外培养扩增猪BMSC,经绿色荧光蛋白（EGFP）基因转染标记后,与猪关节软骨细胞按1：1比例混合,以5．0×10^7／ml的细胞终浓度接种于聚羟基乙酸／聚乳酸（PGA／PLA）材料支架作为共培养组,以相同终浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSC分别接种PGA／PLA作为阳性对照组及阴性对照组。各组标本均于体外培养2周后植于裸鼠皮下,8周后取材,通过大体观察、激光共聚焦显微镜观察、糖胺聚糖含量测定、生物力学、组织学以及免疫组织化学等方法对新生软骨组织进行全面评价。结果各组细胞均与材料黏附良好。体内植入8周后,共培养组及阳性对照组标本基本保持植入前的大小和形状,外观类似软骨组织,组织学显示两组均有连续的软骨陷窝样结构形成,免疫组织化学显示有大量Ⅱ型胶原沉积。定量测定结果显示,共培养组的糖胺聚糖含量和弹性模量均达到软骨细胞构建软骨组织的80％以上。共聚焦显微镜观察可见EGFP标记细胞形成了软骨陷窝。阴性对照组标本的体积较植入前明显缩小,组织学及免疫组织化学均未见软骨样组织形成。结论软骨细胞与BMSC共培养构建的复合物植入体内后能继续形成成熟软骨组织,这表明植入体内后软骨细胞仍能保持对BMSC的诱导作用。     

兔骨髓基质干细胞复合珊瑚修复兔骨缺损的实验研究

目的：对天然珊瑚（natural coral，NC）的细胞相容性进行研究，观察其与兔骨髓基质干细胞（bone marrow stem cells．BMSCs）复合后修复兔桡骨缺损的能力。方法：从兔股骨转子窝抽取骨髓，体外培养扩增，将其接种于珊瑚上，一组分别于1、3、7、14天取材，扫描电镜（SEM）观察细胞在支架上的生长情况，另一组进行诱导，培养5天后接种于兔桡骨1cm缺损中．以珊瑚填充桡骨缺损组作为对照。结果：从第1天开始，珊瑚表面即有细胞贴壁，随时间延长，细胞数量增多，到14天时有大量胶原形成。种植于兔桡骨缺损者4周时珊瑚降解不明显，骨组织形成较少，8周时见珊瑚部分降解．骨组织形成较多，20周时珊瑚完全降解，骨折愈合。结论：BMSCs与NC复合可构建组织工程骨，能修复骨缺损，并具有成骨可靠、来源广泛、成本低廉等特点．