Fas基因siRNA表达质粒的构建及鉴定

目的构建肿瘤凋亡基因Fas小干扰RNA(siRNA)表达质粒,研究其对人肺腺癌A549细胞Fas基因表达的阻抑作用,探索Fas/FasL途径在肺癌转移中的作用机制。方法设计有小发夹结构的3条Fas siRNA对应模板DNA序列,退火处理后克隆至pGCsi-U6质粒,构建重组质粒pSi-Fas。将pSi-Fas转染人肺癌A549细胞,采用Western blot检测Fas表达。结果酶切及测序证实质粒pSi-Fas构建成功,可显著抑制A549细胞Fas蛋白表达。结论成功构建的Fas siRNA表达质粒pSi-Fas能抑制人肺癌A549细胞Fas蛋白表达。     

携带STAT3基因的siRNA表达质粒的构建与鉴定

目的:构建含入STAT3基因不同位点的一系列siRNA真核表达质粒pSUPER,并进行测序,为以STAT3为靶点的肿瘤基因治疗研究奠定基础.方法:将人工合成的针对STAT3基因2个不同位点经基因重组定向克隆插入到真核表达质粒pSUPER中,通过PCR检测及质粒测序确定重组结果.结果:各对mRNA序列均按正确方向插入pSUPER质粒.结论:成功构建了含人STAT3基因2个不同位点的siRNA真核表达质粒.     

C-erbB2基因 siRNA 质粒的构建、鉴定及转染

目的 构建人C-erbB2干扰载体pGenesil-erbB2,并稳定转染入CerbB-2高表达的人结肠癌细胞株HT-29细胞,观察其对人结肠癌HT-29细胞从转录后水平对Her-2蛋白表达的影响.方法 利用免疫组化方法筛选出CerbB-2高表达细胞株HT-29,以人C-erbB2cDNA基因为靶标设计RNA干扰片段和阴性对照片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-erbB,进行鉴定及测序.并稳定转染至HT-29细胞.结果 测序证明人C-erbB2 siRNA表达载体质粒pGenesil-erbB构建成功,pGenesil-erbB稳定转染入人结肠癌HT-29细胞,采用Western blot实验证明pGenesil-erbB可显著抑制Her-2蛋白的表达.结论 成功构建了人CerhB2干扰载体质粒pGenesil-erbB.稳定转染至结肠癌HT-29细胞株,并能抑制HT-29细胞的Her-2蛋向的表达,为靶向CerbB2的siRNA对结肠癌的放射增敏研究奠定了基础.     

人Smurf1 shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建三条人Smurf1 shRNA真核表达载体,以逆转TGF-β1诱导人HK-2细胞转分化。方法：针对人Smurf1基因设计,采用体外转录生物合成的特异性短发夹RNA（shRNA）双链分子,对重组质粒（命名为pSilencer-S1 shRNA、pSilencer-S2 shRNA、pSilencer-S3 shRNA）进行1%琼脂糖凝胶电泳,初步鉴定及测序鉴定。结果：1%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定证实Smurf1 siRNA表达载体克隆构建成功,插入序列测序结果与合成序列结果一致。结论：Smurf1 pSilencer-S1 shRNA、pSilencer-S2 shRNA、pSilencer-S3 shRNA真核表达载体构建成功。     

p27Kip1基因shRNA表达质粒的构建鉴定及功能研究

目的 构建细胞周期性激酶抑制剂p27Kip1的小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,并观察其对牛角膜内皮细胞增殖能力的影响.方法 设计有发夹状结构的3条p27Kip1-shRNA对应模板DNA序列,并构建无关序列HK-shRNA作为阴性对照.转入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和启动子U6的pGenSil-1质粒,构建重组质粒pGenSil-1/p27Kip1-1、pGenSil-1/p27Kip1-2、pGenSil-1/p27Kip1-3、pGenSil-1/HK.转化DH5α菌株,提取质粒行酶切及测序鉴定.以脂质体法将4个重组质粒分别导入牛角膜内皮细胞.转染后48 h以Western blot法检测p27Kip1蛋白水平及MTT法检测各实验组和对照组细胞增殖情况.结果 酶切及测序证实4个重组质粒均构建成功.3个实验组p27Kip1蛋白水平分别下降了66.41%、61.51%、71.32%,shRNA可显著促进牛角膜内皮细胞增殖.结论 成功构建了针对p27Kip1的RNA干扰表达载体.     

STAT3基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的利用RNA干扰技术,以信号转导和转录激活因子3(STAT3)为靶基因,设计构建重组体,并进行序列分析鉴定。方法设计一条有小发夹结构的DNA序列,聚合酶链反应(PCR)扩增合成siRNA表达框架(SECs)表达框架,克隆至载体psi Lent GeneTM中构建重组体,转化E.coli DH5α菌株,提取质粒进行酶切鉴定后测序分析。结果重组质粒经EcoRⅤ酶切、电泳、测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功。结论成功构建了STAT3靶向RNA干扰重组体,为肿瘤的基因治疗在分子水平、细胞水平和整体水平的研究提供一些新方法。     

Sox9、siRNA表达载体的构建与鉴定

目的构建Sox9 siRNA表达载体，分析Sox9在软骨肉瘤中的作用机制。方法根据Kou Ⅰ，IkegawaS提椟的Sox9 mRNA序列，设计并合成两端含有酶切位点的64个碱基的寡核苷酸链。寡核苷酸链退火后用T4DNA连接酶连接到线性化的pSilencer质粒中，并对重组质粒（命名为pSilencer／Sox9 siRNA）进行酶切及测序鉴定。结果双酶切证实Sox9 siRNA表达载体克隆构建成功，插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致。结论成功构建Sox9 siRNA表达载体。     

靶向survivin基因的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向survivin基因的siRNA的表达载体,研究survivin在喉癌中的作用机制。方法根据基因库上sur-vivin cDNA序列,设计合成靶基因序列,将其寡核苷酸退火后插入到Pgenesil-1表达载体中,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA测序。结果酶切鉴定、DNA测序证实表达质粒构建成功,无碱基突变。结论成功构建了靶向survivin基因表达的siR-NA干扰质粒载体Pgenesil/survivin,为进一步运用RNA干扰技术进行survivin基因功能研究奠定了基础。     

AFP基因SiRNA表达质粒的构建及鉴定

目的：构建针对人甲胎蛋白(AFP)基因siRNA表达质粒，为进一步研究AFP基因功能奠定基础。方法：选择RNA干涉靶序列，体外合成两段互补的寡核苷酸，通过与线性化的pSilencer3．0-H1连接、转化大肠杆菌，扩增、纯化得到所需质粒，通过琼脂糖凝胶电泳及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列。结果：纯化的质粒的分子量为2．8Kb，插入的寡核苷酸序列与设计的序列完全相符。结论：成功构建了针对AFP基因的siRNAs表达质粒。     

小鼠IL-5真核表达质粒的构建和体外表达

目的 构建小鼠白细胞介素-5（IL-5）基因真核表达质粒,了解该质粒在真核细胞COS细胞中有效表达情况.方法 以含有小鼠IL-5基因的克隆质粒pORF9-mIL-5为模板,通过PCR扩增小鼠IL-5全段基因,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入peDNA3.1（＋）真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-m IL-5,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染COS细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果 成功扩增了小鼠IL-5全长基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-m IL-5,Westem blot方法证实该质粒能在COS真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白.结论 成功构建了小鼠IL-5基因的真核表达质粒载体,为进一步研究IL-5的新功能和免疫基因治疗奠定了基础.     

大鼠血管内皮生长因子shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)真核表达质粒,为利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)从转录后水平抑制角膜新生血管的研究做准备.方法:用DNA重组技术根据大鼠VEGF mRNA序列设计并合成3条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pSihncer2.0 U6中,进行酶切鉴定和测序.结果:酶切证明构建的shRNA序列已插入载体,经测序证明与设计的相同,获得大鼠VEGF shRNA表达质粒.结论:成功构建了3条大鼠VEGF shRNA真核表达质粒,为靶向VEGF的RNAi抑制角膜新生血管奠定了基础.     

针对HBVS区的siRNA的抗病毒活性

目的: 体外观察siRNA对HepG2 2.2.15细胞中乙型肝炎病毒(HBV)S-mRNA及HBsAg,HBeAg产生的影响. 方法: 设计并合成针对HBV S区的三条siRNA,构建含上述siRNA的表达载体pSilencer ZY1,pSilencer ZY2和pSilencer ZY3,pSilencer HK2测序及酶切鉴定后用脂质体介导重组质粒转染HepG2 2.2.15细胞,用酶免分析法对HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg进行检测,用逆转录聚合酶链反应检测HBV S-mRNA.结果: 成功构建了针对HBV S区的siRNA的表达载体,三条siRNA均可程度不同地抑制HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg的分泌,72 h抑制率达高峰,对HBsAg的抑制率分别为81%,29%及78%,对HBeAg的抑制率分别为35%,3%及49%,并有抑制HBV S-mRNA的作用.结论: 针对HBV S区的siRNA能明显抑制HBV的复制.     

SOCS－3基因真核载体的构建及瞬时表达鉴定

目的构建含小鼠细胞因子信号抑制蛋白-3（SOCS-3）基因的重组pcDNA3.1质粒,同时瞬时转染后,鉴定其在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达。方法自小鼠肝脏标本中提取RNA进行RT—PCR,经克隆后获得pUC19-SOCS-3质粒,从中切出目的基因片段克隆至质粒pcDNA3．1中,以构建重组质粒pcDNA3.1-SOCS-3。后将构建完成的质粒瞬时转染COS-7细胞株,并随机分为未转染质粒组（对照组）、转染空质粒组和转染重组SOCS-3基因质粒组,同时采用免疫印迹法测定SOCS-3的表达。结果经测序鉴定证实,SOCS-3与美国国立生物技术信息中心核苷酸序列数据库提供的原始序列完全一致;同时经瞬时转染COS-7细胞后,转染重组质粒组的SOCS-3蛋白表达水平（光密度比值）显著高于对照组和转空质粒组（P〈0．01）。结论成功构建含小鼠SOCS-3基因的真核表达质粒,为进一步研究该基因在脂肪代谢中的抑制调节作用提供了技术平台。     

S100A16基因shRNA真核表达质粒的构建及其干扰效果的初步鉴定

目的:构建S100A16基因RNA干扰(RNAi)的真核表达质粒,转染3T3-L1小鼠前体脂肪细胞,初步鉴定其干扰效果.方法:以小鼠S100A16基因为靶基因,以PLKO.1-sP6-GFP质粒为载体,根据GenBank数据库提供的S100A16基因核苷酸序列,选择设计2条siRNA干扰序列,构建针对S100A16基因...     

磷脂酰肌醇激酶-3小干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建和鉴定靶向磷脂酰肌醇激酶-3（PI3K） 亚单位编码基因PI3Kcb （catalytic,beta polypeptide）基因的小干扰RNA真核表达载体.方法：根据siRNA设计原则,在PI3Kcb mRNA序列中选择1个特异性靶序列,体外合成对应发卡样DNA片段,经退火后,将其定向克隆入siRNA载体pDC316-EGFP-U6,重组后获得siRNA载体质粒pDC316-PI3Kcb siRNA-EGFP,采用PCR检测和DNA测序以保证siRNA的方向和序列正确.结果：得到阳性重组克隆pDC316-PI3Kcb siRNA,经过PCR鉴定和测序,结果正确.结论：成功构建靶向PI3Kcb基因的siRNA载体pDC316-PI3Kcb siRNA-EGFP,为PI3Kcb的基因沉默研究奠定了可靠的基础.     

应用siRNA表达框架进行原代细胞RNA干扰的操作方法

介绍应用siRNA表达框架对原代培养的细胞进行RNA干扰。RNA干扰是由双链RNA介导的特异同源靶基因转录后沉默的过程,它已经广泛应用到基因功能研究、基因表达调控机制和抗病毒感染等热门领域,在哺乳动物的原代细胞中进行RNA干扰的研究为功能基因研究提供了重要意义。siRNA表达框架与脂质体的转染率直接影响RNA干扰的效果,本文介绍了如何设计和构建siRNA表达框架,筛选最佳的靶位点。     

食品和水源微小隐孢子虫18S rRNA鉴定方法研究

目的了解生蔬食品及相关水源微小隐孢子虫污染情况,并研究其卵囊分离及18S rRNA鉴定的方法. 方法采用分步离心富集法从78份生蔬食品和相关水源中分离出微小隐孢子虫卵囊并提取DNA模板,利用微小隐孢子虫18S rRNA 的基因序列设计特异性引物（446bp）进行多聚酶链反应扩增,扩增产物经回收克隆后进行PCR鉴定、酶切鉴定及序列同源性分析. 结果从78 份样品中检出4份特异性条带样品.限性样品的重组克隆经PCR鉴定可重现446bp的特异性条带,其酶切产物亦与目的基因PCR产物位置相同.重组菌液的测序结果与Geabank数据库中微小隐孢子虫18S rRNA基因序列的同源性为99%. 结论建立了一种监测生蔬食品及相关水源中微小隐孢子虫污染的基因检测方法.     

小鼠Mmp-9 shRNA重组慢病毒包装、筛选及干扰效果检测

目的:设计、筛选、构建并鉴定Mmp-9小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),并构建其慢病毒表达载体,为血管化疾病的防治提供理论依据及实验室数据。方法:针对基质金属蛋白酶9靶基因设计siRNA序列,并合成小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)结构的DNA,与经AgeΙ和EcoRΙ酶切的pSIL-RFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,构建成携带Mmp9-shRNA慢病毒质粒载体(pSIL-RFP/MMP9-shRNA),PCR及测序鉴定后,Western blot筛选出携带最佳siRNA的慢病毒质粒载体,并利用慢病毒包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)将其制备成MMP9-shRNA慢病毒,并测定病毒滴度为1×1010pfu/l。结果:PCR和DNA测序证实合成的含基质金属蛋白酶9短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pSIL-RFP载体,表明实验成功构建基质金属蛋白酶9RNA干扰慢病毒表达载体。结论:成功的构建并筛选出针对小鼠Mmp9基因沉默的特异性shRNA重组慢病毒,为血管化性疾病的防治研究提供基础。     

针对增强型绿色荧光蛋白RNA干扰表达载体的构建和鉴定

目的：构建针对增强型(EGFP)的pSUPER siRNA(small interferencing RNA)表达载体,并在哺乳动物细胞COS-7细胞中观察其干扰效果．方法：设计针对EGFP编码区的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经Bgl Ⅱ和HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSUPER中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定．通过脂质体介导,将重组干扰质粒与pIRESE2-EG-FP瞬时共转染COS-7细胞,48h后荧光显微镜下观察干扰效果．结果：经酶切鉴定及DNA序列测定证实,重组质粒中已插入了目的基因片段．瞬时共转染后荧光显微镜观察结果显示：只转染pIRES2-EGFP及共转染pIRES2-EGFP和空载体pSUPER的COS-7细胞中有大量的EGFP表达．而共转染pIRES2-EGFP和pSUPER-R237、pSUPER—R304、pSUPER-R447的COS-7细胞中发出荧光的细胞数量明显减少,荧光强度也明显降低．结论：成功构建了针对EGFP的RNA干扰表达载体pSUPER—R237,pSUPER—R304和pSUPER—R447,并与pIR—ESE2一EGFP瞬时共转染COS-7细胞,有效地抑制了EGFP在哺乳动物细胞中的表达。