雄激素受体反义RNA对前列腺癌细胞雄激素受体表达的抑制作用研究

目的 观测雄激素受体（AR）反义RNA逆转录病毒表达载体在前列腺癌细胞中的表达及其对AR表达的影响。方法 将AR反义RNA逆转录病毒表达载体导入前列腺癌细胞株LNCaP，PCR检测AR目的片段在重组LNCaP细胞基因组中的存在，RT－PCR检测AR反义RNA表达和AR mRNA水平，Western blot检测AR蛋白表达水平。结果 PCR在LNCaP^as-AR基因组DNA中扩增出了AR目的片段，表明AR目的片段整合到了细胞基因组。RT－PCR证实LNCaP^as-AR有AR反义RNA表达，且其AR mRNA水平较LNCaP和空载体转染的LNCaP^Neo显著下调（P＜0.05)，Western blot证实LNCaP^as-AR细胞AR蛋白含量显著下降（P＜0.05)。结论 AR反义RNA可抑制前列腺癌细胞AR表达。     

反义AFP增强子/TK基因重组逆转录病毒载体的构建及在肝癌细胞中的专一性表达

目的构建在肝癌细胞中特异性高表达的重组逆转录病毒载体,观察其对体外培养肝癌细胞生物学行为的影响。方法应用DNA重组技术将α-甲胎蛋白増强子(AFE)核心区DNA与单纯性疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因融合,反向插入逆转录病毒载体pLXSN,重组体命名为pL/TK/AFE/SN;经PA317细胞包装、G418筛选、病毒滴度测定,挑选滴度高的抗性克隆细胞株扩增培养,收获病毒上清,感染体外培养的Hap3B肝癌细胞和Hela宫颈癌细胞。用Southernblot、Northernblot检测转染细胞的DNA、mRNA,以羟甲基无环鸟苷(GCV)对细胞的杀伤毒性检测外源基因在转染细胞中的表达。结果酶切及Southernblot证实插入pL/TK/AFE/SN的反义AFE/TK基因大小、方向及克隆位点正确。达到一定的产病毒滴度。Northernblot分析显示Hep3B肝癌细胞有TK基因mRNA水平表达;应用GCV后,导入反义AFE/TK基因的Hep3B肝癌细胞生长明显受抑制(P<0.01)。结论成功构建了含反义AFE/TK基因的重组逆转录病毒载体并包装出具有感染能力的假型逆转录病毒;重组载体所含的反义AFP増强子能调控外源性TK基因特异地在Hep3B肝癌细胞中高表达。     

转FasL基因卵巢癌HO-8910细胞系的建立

目的建立表达转FasL基因卵巢癌细胞系,为以FasL为靶点治疗卵巢癌提供理想细胞模型。方法应用分子克隆技术,将人FasL cDNA片段正向插入逆转录病毒载体pLXSN构建重组质粒pL(hFasL)SN,转染包装细胞PA317收获假病毒上清,磷酸钙法转染卵巢癌HO-8910细胞筛选建系,酶切PCR鉴定、流式细胞仪(FCM)法检测。结果酶切鉴定证实重组质粒pL(hFasL)SN中存在FasL,PCR方法从转染细胞HO-8910-FasL基因组中扩增出0．86kb片段,FCM检测显示FasL表达增加40．32％,HL-60细胞与HO-8910-FasL细胞共培养HL-60细胞凋亡增加25．65％。结论应用逆转录病毒法建立了稳定高表达FasL并具功能的HO-8910-FasL细胞系。     

携EGFP基因的逆转录病毒包装细胞的分选和滴度测定

目的探讨利用荧光激活细胞分选技术获得有效重组逆转录病毒包装细胞系的方法。方法用脂质体介导pLEGFP转染PA317细胞，用荧光显微镜观察转染结果；依据EGFP荧光利用流式细胞仪的分选技术获得多克隆和单克隆源性的包装细胞，并利用PCR、RT-PCR对其鉴定；以NIH3T3为靶细胞，对其滴度进行测定。结果荧光显微镜显示用脂质体介导的方法成功的转染PA317细胞，在4次连续流式细胞仪分选后得到了稳定表达的多克隆和单克隆源性的包装细胞。PCR和RT-PCR分别从多克隆和单克隆源性的包装细胞细胞基因组DNA以及多克隆和部分(6／8)单克隆源性的包装细胞培养上清中的重组逆转录病毒RNA中扩增出了插入的EGFP片段。滴度测定显示得到的包装细胞能够产生有效的病毒滴度。结论荧光激活细胞分选技术是获得有效病毒滴度的包装细胞的有效方法。     

iNOS基因重组逆转录病毒的包装及高滴度病毒液的制备

目的利用逆转录病毒载体PLXSN介导iNOS基因转染,为逆转录病毒介导的iNOS转基因防治血管移植术后再狭窄的研究奠定实验基础。方法采用QIAGEN plasmid Maxi Kit纯化PLXSN-iNOS;通过脂质体介导的DNA转染法将PLXSN-iNOS导入包装细胞PA317中;经G418筛选获得抗性克隆,命名为PA317/iNOS;提取抗性克隆细胞基因组DNA,用PCR进行鉴定;用NIH3T3细胞测定病毒上清滴度。结果PA317/iNOS细胞能稳定合成和分泌重组逆转录病毒颗粒,并在约142 bp处扩增出特异的片段;PLXSN-iNOS病毒上清的最高滴度为1.6×106CFU/mL。结论逆转录病毒载体PLXSN能有效介导iNOS基因的转染。     

携EGFP基因的逆转录病毒包装细胞的分选和滴度测定

目的 探讨利用荧光激活细胞分选技术获得有效重组逆转录病毒包装细胞系的方法。方法 用脂质体介导pLEGFP转染PA317细胞,用荧光显微镜观察转染结果;依据EGFP荧光利用流式细胞仪的分选技术获得多克隆和单克隆源性的包装细胞,并利用PCR、RT-PCR对其鉴定;以NIH3T3为靶细胞,对其滴度进行测定。结果 荧光显微镜显示用脂质体介导的方法成功的转染PA317细胞,在4次连续流式细胞仪分选后得到了稳定表达的多克隆和单克隆源性的包装细胞。PCR和RT-PCR分别从多克隆和单克隆源性的包装细胞细胞基因组DNA以及多克隆和部分(6/8)单克隆源性的包装细胞培养上清中的重组逆转录病毒RNA中扩增出了插入的EGFP片段。滴度测定显示得到的包装细胞能够产生有效的病毒滴度。结论 荧光激活细胞分选技术是获得有效病毒滴度的包装细胞的有效方法。     

小鼠微小RNA294逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的:构建小鼠微小RNA294(miR-294)逆转录病毒载体.方法:从小鼠基因组DNA扩增pri-miR-294,克隆连接至pMX-IRES-GFP逆转录病毒载体上,得pMX-miR-294-IRES-GFP,测序鉴定后以转染PLAT-E细胞进行病毒包装,测定病毒滴度.结果:pMX-miR-294-IRES-GFP经...     

CCR5,CXCR4双靶区反义RNA重组腺病毒载体的构建

目的:构建趋化因子受体CCR5,CXCR4双靶区反义RNA重组载体并获取重组腺病毒以用于抗HIV-1基因治疗的研究.方法:用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞中分别扩增出趋化因子受体CCR5,CXCR45′端翻译起始区653bp和636bp的cDNA片段,将其反向插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack-CMV中,再与包装质粒pAdEasy-1共转染BJ5183细菌同源重组,卡那抗性培养基筛选阳性克隆;同源重组的载体用脂质体转染剂转染293细胞包装、扩增,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)以及PCR法鉴定、氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒.结果:成功构建了CCR5,CXCR4双靶区反义RNA重组腺病毒载体,并于293细胞中包装、扩增得到高滴度的重组腺病毒,其滴度为:7.2×1012PFU/mL.结论:CCR5,CXCR4双靶区反义RNA重组腺病毒的构建为研究双靶位辅助受体反义RNA抗HIV-1的作用打下基础.     

EBV LMP2A逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

目的构建含EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白基因2A（LMP2A）的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）扩增获取目的基因LMP2A,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro,形成重组质粒pMSCVpuro-2A,脂质体法将pMSCVpuro-2A转染逆转录病毒包装细胞PT67。嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒进行滴度测定,RT-PCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达。结果限制性酶切、PCR及测序鉴定证实LMP2A正确插入逆转录病毒表达载体;筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆;收获病毒的滴度为3．2×10^7CFu／L,且重组腺病毒在PT67细胞能有效转录。结论携带LMP2A基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCVpuro-2A构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达LMP2A的产毒细胞系PT67-LMP2A。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

醋柳黄酮缓释片的药动学初步研究

目的:研究醋柳黄酮缓释片在家犬体内的药动学过程,测定其药动学参数,计算缓释片相对于普通片的生物利用度。方法:将实验动物分为两组,分别用醋柳黄酮缓释片和普通片进行口服给药,用高效液相色谱法测定血浆药物浓度,应用3P97软件求算药动学参数。结果:醋柳黄酮缓释片及普通片的tm ax分别为4.87 h和2.87 h,Cm ax分别为每小时0.46μg.L-1和每小时0.56μg.L-1,缓释片的相对生物利用度为111.7%。结论:醋柳黄酮缓释片与普通片均符合一室模型,缓释片与普通片具有生物等效性,且醋柳黄酮缓释片有明显的缓释效果。     

主动脉窦瘤破裂的外科治疗

报告２０例主动脉窦瘤破裂修复术的结果。１７例男性，３例女性。年龄７～５６岁。痊愈１９例，另一例因急性肾功能衰竭一周后死亡。作者就发病机理，诊断和合并畸形的处理进行了讨论。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

扩张兔皮肤超微结构的变化

目的：动态观察扩张兔皮肤超微结构的变化。方法：选用2--3kg新西兰大白兔64只，分为2大组，快速扩张组和常规扩张组，每组32只，每大组再分为4组，为扩张完成后即时、1周、12周、24周组。每组8只，其中4只为实验组，另4只植入扩张器不扩张作为对照组。透射电子显微镜观察各组皮肤超微结构的变化。结果：表皮扩张后经历--由扩张刺激引起的创伤至完全修复的过程。扩张后即时真皮中成纤维细胞大量增生，功能由静止转向活跃，胶原纤维碎裂成片，弹力纤维部分断裂，炎症细胞浸润；扩张后1周常规扩张组基底膜连续性基本恢复。显示成纤维细胞合成功能活跃。扩张后12周、24周，成纤维细胞趋于稳定、形态狭长，部分胶原排列紊乱，部分有似癜痕样改变。结论：扩张刺激可致兔皮肤创伤。扩张后真皮不可完全修复。     

芹黄素对大鼠缺血视网膜功能恢复的作用

目的观察芹黄素对大鼠缺血视网膜功能恢复的作用。方法30只Long-Evans大鼠用动脉结扎法造成视网膜缺血模型,其中治疗组20只腹腔注射芹黄素,对照组10只注射溶媒二甲基亚酚。用视觉电生理仪检查视网膜功能恢复情况。结果芹黄素治疗组视网膜功能恢复明显好于对照组(P<0.05)。结论芹黄素能促进大鼠缺血视网膜的功能恢复。      

上颌骨牙源性囊肿刮除手术的疗效观察

目的探讨对上颌骨牙源性囊肿患者进行囊肿彻底刮除手术的临床疗效。方法对我科在2010年1月～2017年9月收治的73例上颌骨牙源性囊肿患者行囊肿彻底刮除手术治疗,对患者术区肿胀消退、术后伤口感染、伤口愈合、牙龈再附着、术后复发、骨质改建、骨质修复等情况随访观察。结果 73例患者术后肿胀消退时间为1～4 d。73例患者术后均未发生伤口感染,伤口均一期愈合。所有患者牙龈再附着情况好,术后均未见复发。术后未见并发症。骨质改建效果好,骨质修复的效果因影像学资料过少,缺乏客观依据,暂不下有效结论。结论对上颌骨牙源性囊肿患者进行囊肿彻底刮除手术,术后患者的恢复情况良好,值得在临床治疗上进行推广。     

颅咽管瘤切除术后并发症的处理

目的　讨论颅咽管瘤切除术后并发症的处理原则。方法　分析 36例颅咽管瘤切除术后并发症的临床资料。结果　术后并发尿崩症者 14例、高热 11例、电解质紊乱 8例、消化道出血 3例、癫痫 5例 ,死亡2例。结论　颅咽管瘤术后并发症较多 ,加强早期监测和处理 ,可进一步提高该病的治愈率