猪型(H1N1)流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因来源的研究

目的 研究2002年我国内地从猪群中分离的猪型(H1N1)毒株HA和NA基因来源。及其使猪致病的原因。方法 用PCR扩增目的基因，用P^GEM-T Easy Vector，4℃过夜连接，重组质粒转入DH-10B细菌，筛选阳性菌落，酶切鉴定，送六合通公司自动测序，并作进化树分析。结果 3株猪型(H1N1)病毒的HA和NA基因属猪型(H1N1)流感病毒，而不同于其他禽或人的H1N1亚型流感病毒。2002年猪型毒株由1991年猪型毒株演变而来。近来我国内地猪群中猪型毒株活动增强，其对猪能致病是由于病毒粒HA和NA蛋白抗原性发生变异所造成。结论 3株猪型病毒的HA和NA基因来源于猪型(H1N1)毒株。近来猪型毒株对猪具有致病性和活动增强是由于其HA和NA蛋白分子上氨基酸序列发生替换所造成。     

江苏省2011年乙型流感病毒血凝素和神经氨酸酶分子流行特征

目的 分析2011年江苏省乙型流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的分子流行特征.方法 选择13株2011年江苏省不同地区、不同流行时间的乙型流感毒株进行全基因组测序,通过生物信息学方法对HA、NA分子流行特征进行分析.结果 13株乙型流感毒株中,10株属于Victoria系,3株属于Yamagata系.10株Victoria系毒株的NA基因来源于Yamagata系病毒,是基因重配流行株.与疫苗株相比,10株Victoria系毒株和3株Yamagata系毒株的HA蛋白分别在197和196位增加一个糖基化位点.结论 2011年江苏省乙型流感Victoria系和Yamagata系病毒同时流行,其中重配的Victoria系病毒占优势.     

H1N2新亚型流感病毒神经氨酸酶基因来源的进一步研究

对流感病毒Ｈ１Ｎ２亚型重组株Ａ／哈防／１／８８、Ａ／哈防／１２／９２以及Ｈ３Ｎ２亚型病毒株Ａ／雅防／２／８７、Ａ／京防／５７／８９８和Ａ／粤防／１／９２神经氨酸酶（ＮＡ）基因核苷酸全序列的测定，进一步弄清了Ａ／哈防／１／８８病毒株的ＮＡ基因确来自当时人群中流行的Ｈ３Ｎ２亚型病毒株，很可能是来自Ａ／雅防／２／８７类病毒株；而Ａ／哈防／１２／９２病毒株的ＮＡ基因可能是与Ａ／哈防／１／８８病毒株的ＮＡ基     

对流感病毒神经氨酸酶N1亚型抗体筛选体系的评价

目的 比较真核表达、活病毒感染、酵母展示系统用于流感病毒神经氨酸酶(NA) N1亚型抗体筛选的差别,寻找合适的抗体筛选系统.方法 将pVRC-VN NA-HAtag质粒转染入293T,通过酵母展示获得重组NA.通过反向遗传学获得重组病毒A/Sichuan/1/2009.用荧光发光法检测NA性能,用流式细胞仪检测NA与5种候选抗体结合情况.结果 真核表达、酵母展示系统均可以使NA在表面展示,且具有与活病毒NA相似的特性.在候选的5种抗体中,真核表达以及病毒的NA可与抗体1、5结合,病毒的NA还能与抗体4结合;而酵母展示系统的NA与5种抗体均不能结合.结论 真核表达、真病毒感染系统适合NA抗体的筛选,酵母展示系统表达的NA其表面抗体识别的表位有差异.     

2009H1N1流感病毒神经氨酸酶基因克隆与表达

目的制备2009H1N1流感病毒神经氨酸酶（NA）重组蛋白,为建立H1N1快速检测方法和神经氨酸酶抑制剂筛选模型奠定基础。方法采用MDCK细胞方法分离2009H1N1流感病毒,提取病毒RNA,RT-PCR生成NA基因,构建原核表达载体PET-102/D-TOPO-NA,IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳、WersternBlotting鉴定重组蛋白。结果成功分离2009H1N1流感病毒,NA蛋白119、152、275、292位氨基酸分别为Glu、Arg、His和Cys。SDS-PAGE凝胶电泳蛋白分子相对分子质量约为64000,与预期一致。WesternBlotting证实该蛋白具有神经氨酸酶抗原活性。结论 IPTG诱导原核表达神经氨酸蛋白的最适浓度为0.1mmol/L。实验得到的蛋白尚需进一步纯化。     

一株鹅H5N1亚型流感病毒基因特性的分析

目的 弄清了Ａ／鹅／广东／２／９６（Ｈ５Ｎ１）毒株对鹅致病的分子生物学基础 ，研究香港区人群中发生的禽（Ｈ５Ｎ１）流感的病因，方法 病毒ＲＮＡ经逆转录合成ｃＤＮＡ经聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增，产物纯化，采用双脱链末端终止法测定核苷酸序列，结果 Ａ／鹅／广东／２／９６（Ｈ５Ｎ１）与Ａ／ＨＫ／１５６／９７（Ｈ５Ｎ１）毒株ＲＮＡ４核苷酸序列有２２个位点不同（同源性为９８．８％）无任何掉失或插入。它与人和     

深圳市2008-2009年A型H1N1季节性流感病毒神经氨酸酶抑制剂耐药性监测

目的 对深圳市2008-2009年分离到的H1N1季节性流感病毒神经氨酸酶(NA)抑制剂的耐药性进行监测.方法 根据原始临床样本的采集时间,按周抽取了55株2008-2009年分离到的H1N1季节性流感病毒,对其NA片段进行全长测序,选取WHO推荐的疫苗株和部分国内外分离到的H1N1季节性流感病毒作为参考株,运用Mega3.1软件进行种系发生树的构建、耐药相关位点及糖基化位点的分析.结果 对NA片段的序列分析发现2008年有2株(7.1%)出现了H275Y突变,但是2009年则有25株(92.6%)出现了该突变.提示H275Y达菲耐药突变株成为了2009年深圳市社区传播的优势株.同时还发现了一株Q136K变异株,显示对乐感清出现耐药.分子进化分析结果显示,H275Y变异成为了毒株在系统进化树上分布的主要依据.所有的深圳株NA片段上潜在的糖基化位点序列保守.结论 大量H275Y达菲耐药株的出现提示在今后的工作中应当密切关注流感病毒的耐药进展,进一步加强其耐药机制的研究.

Abstract：

Objective To analyze neuraminidase(NA) inhibitor resistance of seasonal H1N1 influenza A viruses isolated in Shenzhen during 2008 to 2009. Methods The NA gene of these viruses were sequenced. Phylogenetic analysis of the sequences was performed with Mega3. 1 software. Results In 2008, most isolates of the seasonal H1 N1 virus were susceptible to neuraminidase inhibitors, but the H275Y mutation in the neuraminidase gene region associated with high-level oseltamivir resistance had been detected in 92.6% of the strains isolated in 2009. Furthermore, a strain with Q136K was found, which showed the resistance to Zanamivir. Conclusion In the light of emerging resistance, close monitoring and understanding of the nature and dynamics of resistance mutations in influenza virus should be a priority.     

流感病毒A/广州/333/99(H9N2)毒株基因组特性的研究

目的 了解一株再次从流感患儿中分离出禽H9N2流感毒株的基因组特性，并弄清它的来源。方法 病毒在鸡胚中传代，从收获的尿囊液中提取RNA，通过逆转录合成cDNA，cDNA用PCR扩增。PCR产物用纯化试剂盒纯化，接着做核苷酸序列测定，然后用Meg Align(Version 1.03)和Editseg(Version 3.69)软件进行基因进化树分析。结果 A／广州／333／99（H9N2）毒株的基因组属于禽流感病毒，但它明显不同于A／Duck/Hong Kong/Y439/97毒株。同时不含有任何人流感病毒基因节段，其基因组中有4个基因节段（分别编码HA、NA、NP和NS蛋白）来自G9毒株基因系，而其余4个基因节段（分别编码PB2、PB1、PA和M蛋白）来自G1毒株基因系。结论 A／广州／333／99（H9N2）病毒是G9和G1毒株通过基因重配而来的重配株，它最大可能性直接来自禽。进一步证实了禽H9N2毒株能感染人，同时首次证实了H9N2不同基因系毒株间，在自然界中也能发生基因重配。     

我国猪群中H9N2亚型毒株HA和NA基因特性的研究

目的 了解我国内地从猪中分离到H9N2亚型毒株HA和NA基因来源及它们使猪致病的原因。方法 用PCR扩增目的基因，与P^GEM-T Easy Vector4℃过夜连接，重组质粒转化DH-10β细菌，筛选阳性菌落，酶切鉴定，测序。然后，进行进化树分析。结果 两株猪H9N2毒株HA蛋白分子上第226位上氨基酸为L，这与从人和猪所分离出的H9N2毒株相同，其连接肽属对禽致病的毒株，但它们的序列为R-L-S-R，而不是R-S-S-R；其NA蛋白茎区第62～64位存在掉失，这与A／Shaoguarn/408／98，A／Swine／Hong Kong／9／98及A／Duck／Hong Kong／y280／97(H9N2)毒株相同；HA与NA基因进化树分析表明，两株猪H9N2毒株的HA基因接近于A／Chicken／Hong Kong／G23／97和A／Chicken／Hong Kong／G9／97．而NA基因接近于A／Shaoguan／408／98毒株。结论 两株猪H9N2亚型毒株的HA和NA基因可能性最大来自禽H9N2毒株。由于其HA蛋白分子上连接肽氨基酸序列发生替换，可能造成了它们对猪具有致病性。禽H9N2毒株NA蛋白茎区氨基酸掉失，造成了它们能直接感染猪。     

H5N1亚型流感病毒M2与NA基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建表达H5N1亚型流感病毒M2和NA基因的多种真核表达载体.方法 以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒（A/Anhui/1/2005）作为研究对象,PCR扩增全长M2与NA基因.将M2基因克隆入真核表达载体pStar的IRES上游或下游的MCS,构建重组pStar-M2/和pStar-/M2.将NA基因克隆人pStar载体IRES上游或下游的MCS,构建重组pStar-NA/和pStar-/NA.将M2和NA基因先后克隆到pStar载体IRES序列的上游和下游MCS,分别构建双基因共表达重组pStar-M2/NA和pStar-NA/M2.将重组质粒转染293细胞,使用IFA方法 检测各重组质粒相应外源基因的表达.结果 通过酶切鉴定,各重组质粒构建正确.将其转染293细胞后,使用IFA方法 检测到了各重组质粒中相应外源基因的表达.结论 构建了多种表达H5NI亚型流感病毒M2和（或）NA基因的真核表达载体,为研究开发流感DNA疫苗奠定了基础.     

两株京科猪H1N1亚型流感病毒内部基因来源的研究

目的通过内部基因研究了解两株猪(H1N1)亚型流感病毒内部基因是否含有禽流感病毒基因节段及是否与猪群中H9N2亚型毒株发生了基因重配。方法病毒在鸡胚中传代,从收获的尿囊液中提取RNA,通过逆转录合成cDNA,cDNA用PCR扩增。PCR产物用纯化试剂盒纯化,接着进行核苷酸序列测定,然后用MegAlign(Version1.03)和Editseq(Version3.69)软件进行基因进化树分析。结果两株京科猪H1N1病毒内部基因除PB2基因节段有所不同外,其余5个基因节段均相同,但与猪H1N1流感病毒内部基因相近,然而,与古典型猪H1N1毒株有差异。结论两株京科猪H1N1病毒不是基因重配株,它们的内部基因均属猪H1N1流感病毒基因系。     

从人分离出两株甲型流感H9N2亚型毒株内部基因特性的研究

目的 了解2株从人分离出的H9N2亚型毒株内部基因特性，并弄清其来源。方法 用RT-PCR扩增目的基因，用P^CEM-T Vector(美国Promega公司)，4℃过夜连接，重组质粒转入dH5a细菌，筛选阳性菌落，酶切鉴定，送六合通公司自动测序。然后进行进化树分析。结果 2株测定毒株内部基因均为G9基因系，它们相互间除PA基因有差异外，其余5个基因均相同。结论 2株测定毒株的基因组均为G9基因系，它们是由携带不同基因特性H9N2毒株的禽群分别直接感染人，而不是来自同一禽的H9N2亚型流感病毒。     

含有H5N1 NA基因重组腺病毒疫苗在小鼠体内的免疫效果研究

目的 考察含有禽流感病毒A/Anhui/1/2005(H5N1)优化型NA基因的重组腺病毒在BALB/c小鼠体内的免疫效果,并筛选合适的免疫剂量.方法 重组病毒以肌内注射方式在第0周和第4周免疫BALB/c小鼠两次,低、中、高组的免疫剂量分别是10~5、10~7和10~9 TCID_(50)/次,第5周时分别使用神经氨酸酶活性抑制试验和EHSpot实验来检测和比较疫苗的体液和细胞免疫效果.结果 重组病毒免疫后的小鼠均可检测出针对NA抗原的特异性体液和细胞免疫反应,并且免疫效果与免疫剂量呈正相关,10~7 TCID_(50)/只/次是合适的免疫剂量.另外,从包含NA全长氨基酸残基的合成肽库中筛选到两个能够刺激BALB/c小鼠T淋巴细胞分泌IFN-γ的表位,即NA_(109-124):CRTFFLTQGALLNDKH和NA_(182-199):AVAVLKYNGIITIKSW.结论 含有优化型NA基因的重组腺病毒疫苗能够诱导BALB/c小鼠同时产生NA抗原特异性的体液和细胞免疫反应,是较好的H5N1流感病毒候选疫苗株,值得进一步深入研究.     

含H5N1-HA基因重组腺病毒疫苗的构建及其诱导免疫应答的初步探讨

目的 构建包含H5N1-HA基因的重组腺病毒疫苗并探讨其免疫效果.方法 用Admax系统构建包含H5N1-HA基因的重组腺病毒疫苗,并用PCR、Western-Blot等方法对重组病毒疫苗进行鉴定;疫苗免疫小鼠后,通过HI实验和ELISPOT实验检测其体液免疫和细胞免疫反应,评价其免疫效果.结果 成功得到了含有H5N1-HA基因的重组腺病毒疫苗;基因表达鉴定表明,HA基因能够在细胞中进行表达;血凝抑制实验结果显示小鼠产生的针对HA抗体滴度在1:320和1:640之间;ELISPOT结果显示实验组和对照组(PBS)相比斑点数量差异有统计学意义(P<0.05),以上免疫结果表明重组腺病毒载体疫苗可以诱导小鼠产生良好的特异性体液和细胞免疫反应.结论 含H5NA-HA的重组腺病毒疫苗可以诱导小鼠产生良好的免疫反应,为研制人禽流感疫苗打下基础.     

2004年中国甲3亚型流感病毒(H3N2)抗原性及基因特性研究

目的阐明2004年中国流行的甲3亚型流感病毒血凝素抗原性及其基因变异情况。方法对2004年分离的甲3亚型毒株先进行单向血凝抑制试验及交叉血凝抑制试验;在此基础上选取不同时间、地点的甲3亚型流感毒株进行血凝素基因HA1区核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,然后进行基因进化特性分析。结果单向血凝抑制实验结果表明,2004年共有52.3%毒株与A/Fujian/411/2002(H3N2)(20042005毒株)有4倍或以上的血凝抑制滴度差异,交叉血凝抑制实验结果表明,它们间的抗原比为4。HA1区核苷酸序列和氨基酸序列分析表明,我国从2004年2月分离的甲3亚型毒株开始出现了与A/Fujian/411/2002(H3N2)和A/Wellington/1/2004(H3N2)(2005年国际代表株)相比较,在其HA1蛋白分子上存在有4个氨基酸位点(159位Y>F,189位S>N,145位K>N,226位V>I)发生了替换。此类毒株首发于我国南方,然后到我国北方。结论我国2004年2月份以后所分离的甲3亚型流感毒株已经发生抗原性及基因特性的改变。     

T淋巴细胞在甲型H1N1流感病毒感染中的变化及意义

目的 研究甲型H1N1流行性感冒（流感）患者外周血T淋巴细胞及其激活亚群的变化.方法 用流式细胞仪检测144例甲型HlNl流感患者和41例健康体检者淋巴细胞亚群,对其中83例患者进一步分析治疗前后T淋巴细胞及其激活亚群（HLA-DR＋CD3＋、HLA-DR＋CD4＋和HLA-DR＋CD8＋细胞）.结果 ①与对照组相比,H1N1并发肺炎组和H1N1组淋巴细胞数明显低于对照组,H1N1并发肺炎组淋巴细胞数明显低于H1N1组;H1N1并发肺炎组T淋巴细胞百分比明显低于对照组（P〈0.05）.②治疗前后CD3、CD8细胞百分比和绝对数均差异有统计学意义,治疗前显著降低,CD4细胞数治疗前显著降低.③治疗前后T淋巴细胞激活亚群（HLA-DR＋CD3＋、HLA-DR＋CD4＋和HLA-DR＋CD8＋细胞）百分比差异有统计学意义,治疗前显著降低.结论 测定甲型H1N1流感患者外周血T淋巴细胞及其激活亚群的变化有助于评价甲型H1N1流感患者感染早期的细胞免疫状况,可以作为甲型H1N1流感早期诊断的辅助指标.     

Genetic analysis of two influenza A (H1) swine viruses isolated from humans in Thailand and the Philippines

Influenza viruses A/Philippines/341/2004 (H1N2) and A/Thailand/271/2005 (H1N1) were isolated from two males, with mild influenza providing evidence of sporadic human infection by contemporary swine influenza. Both viruses were antigenically and genetically distinct from influenza A (H1N1 and H1N2) viruses that have circulated in the human population. Genetic analysis of the haemagglutinin genes found these viruses to have the highest degree of similarity to the classical swine H1 viruses circulating in Asia and North America. The neuraminidase gene and the internal genes were found to be more closely related to viruses circulating in European swine, which appear to have undergone multiple reassorting events. Although transmission of swine influenza to humans appears to be a relatively rare event, swine have been proposed as the intermediate host in the generation of potential pandemic influenza virus that may have the capacity to cause human epidemics resulting in high morbidity and mortality.