兔抗人CXCR3-B分子N端多肽多克隆抗体的制备与初步应用

目的:获得兔抗人CXCR3-B分子N端第1~19、第17~35及第33~51个氨基酸多肽的多克隆抗体,并对多克隆抗体进行初步鉴定和应用。方法:应用Fmoc法化学合成CXCR3-B分子N端第1~19、第17~35及第33~51个氨基酸多肽,经C18的RP-HPLC纯化后,通过高碘酸钠法将纯化的CXCR3-B分子的多肽与KLH交联;皮下注射抗原免疫日本大耳白兔,加强免疫得到抗血清,应用蛋白G纯化获得多克隆抗体。对纯化的抗体进行ELISA、免疫印迹、免疫组化等初步鉴定和应用。结果:分别化学合成CXCR3-B分子N端第1~19、第17~35及第33~51个氨基酸多肽,纯化后多肽纯度分别为98%、88.54%及80%,达到免疫用抗原标准。多肽与KLH交联,用于免疫动物。经纯化后的抗体效价分别为1∶32000(0.1mg/L),1∶4000(3mg/L)和1∶1000(10mg/L)。3种多肽的抗体可特异识别胎心组织中相对分子质量(Mr)约为50的CXCR3-B分子,相应抗原定位于3种多肽的抗体可特异识别胎心组织中的血管内皮细胞。结论:所制备的多克隆抗体可应用于ELISA、免疫印迹和免疫组化等实验,为确定CXCR3-B分子的组织及细胞分布和定位、寻找CXCR3-B相互作用的分子提供了有力的工具。目的:获得兔抗人CXCR3-B分子N端第1~19、第17~35及第33~51个氨基酸多肽的多克隆抗体,并对多克隆抗体进行初步鉴定和应用。方法:应用Fmoc法化学合成CXCR3-B分子N端第1~19、第17~35及第33~51个氨基酸多肽,经C18的RP-HPLC纯化后,通过高碘酸钠法将纯化的CXCR3-B分子的多肽与KLH交联;皮下注射抗原免疫日本大耳白兔,加强免疫得到抗血清,应用蛋白G纯化获得多克隆抗体。对纯化的抗体进行ELISA、免疫印迹、免疫组化等初步鉴定和应用。结果:分别化学合成CXCR3-B分子N端第1~19、第17~35及第33~51个氨基酸多肽,纯化后多肽纯度分别为98%、88.54%及80%,达到免疫用抗原标准。多肽与KLH交联,用于免疫动物。经纯化后的抗体效价分别为1∶32000(0.1mg/L),1∶4000(3mg/L)和1∶1000(10mg/L)。3种多肽的抗体可特异识别胎心组织中相对分子质量(Mr)约为50的CXCR3-B分子,相应抗原定位于3种多肽的抗体可特异识别胎心组织中的血管内皮细胞。结论:所制备的多克隆抗体可应用于ELISA、免疫印迹和免疫组化等实验,为确定CXCR3-B分子的组织及细胞分布和定位、寻找CXCR3-B相互作用的分子提供了有力的工具。     

兔抗人羧酸酯酶1多克隆抗体的制备与鉴定

目的: 制备兔抗人羧酸酯酶1(CES1)多克隆抗体(pAb), 并对抗体进行特性鉴定.方法: 以人正常肝cDNA文库为模板, 构建重组表达质粒pGEX-4T-1-CES1(即CES1-GST)和pET-32a-CES1(即CES1-His).CES1-GST融合蛋白作为免疫原制备兔pAb, 辛酸-硫酸铵法纯化抗体, 采用Western blot和免疫组化鉴定抗体的特异性.结果: CES1-GST和CES1-His融合蛋白均在大肠杆菌中以包涵体形式大量表达.兔抗人CES1 pAb效价为1∶ 64 000.Western blot鉴定表明, 该抗体可识别重组人CES1蛋白, 也可特异地识别人肝微粒体中的CES1亚基.免疫组织化学鉴定显示该抗体可特异性识别正常肝组织中的CES1蛋白.结论: 成功地制备了兔抗人CES1 pAb, 该抗体可应用于ELISA、 Western blot、免疫组化等实验, 为进一步研究CES1的功能提供了特异性检测工具.     

兔抗人ERA多克隆抗体的纯化

目的纯化兔抗人ERA的多克隆抗体。方法在大肠杆菌中,表达重组MBP-hEra融合蛋白。表达产物先继以直链淀粉树脂亲和柱和Superose12凝胶柱过滤纯化。将纯化的MBP-hEra偶联于NHS-activatedSepharoseTM上,制备亲和层析柱,纯化兔抗人ERA多克隆抗体。结果①表达、纯化的MBP-hEra,相对分子质量(Mr)为78×103,其纯度为95％。②从抗血清中纯化获得可与MBP-hEra特异性结合的兔抗hEra多克隆抗体。结论获得了特异性较好的纯化兔抗hEra多克隆抗体。     

兔抗凋亡蛋白酶活化因子－1多克隆抗体的制备、纯化与鉴定

1997年,Zou等[1]首次从HeLa细胞胞质内纯化和克隆出凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotie protease activating factor-1,Apaf-1)的cDNA,该蛋白质的相对分子质量(Mr)为130.近来研究发现在细胞色素C和dATP存在的情况下,Apaf-1可聚集成凋亡体(apoptosome)[2],凋亡体负责将半胱天冬酶-9酶原蛋白(pmcaspase-9)裂解成半胱天冬酶-9(easpase-9),以及维持caspase-9的酶活性,进一步激活caspase-3而诱导细胞凋亡[2],因此Apaf-1可被认为是凋亡体的真正核心.     

人CPNE5多克隆抗体的制备

制备人CPNE5的多克隆抗体.将CPNE5基因中423bp(626-1048bp)的片段构建到原核表达载体pGEX-5X-1,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达蛋白,经SDS-PAGE分离纯化得到抗原肽段,质谱法鉴定后常规免疫家兔.用CL-4B柱纯化抗体.结果显示,成功表达并纯化了人CPNE5抗原肽段...     

小鼠抗人BART多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备小鼠抗人源性BART的抗体。方法采用原核系统表达人全长BART,经纯化后免疫小鼠制备抗BART的抗体,以Western blot、免疫组化染色法检测抗体的效价和特异性。结果获得高效价的小鼠抗BART的抗体,该抗体能够识别大鼠脊髓组织中的BART分子。海马神经元和星形胶质细胞的免疫组化染色结果显示,BART分子在海马神经元、星形胶质细胞中广泛表达;在海马神经元中,BART与钙离子通道存在共定位现象。结论制备出能特异性识别天然BART分子的抗体,为检测BART分子并进一步研究其功能奠定了基础。     

兔抗人PIWIL4蛋白多克隆抗体的制备和鉴定

目的 制备兔抗人PIWIL4的多克隆抗体,并鉴定其特异性,应用组织芯片初步探讨其在人类正常及肿瘤组织中的分布.方法 合成特异性PIWIL 4多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体构建多肽免疫原,通过致敏大白兔, 制备兔抗人PIWIL4多克隆抗体,然后用亲和层析法纯化抗体.用ELISA和western方法进行抗体验证,并应用人组织芯片进行PIWIL4的免疫组化研究.结果 通过构建P IWIL4多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,我们制备了兔抗人PIWIL4蛋白多克隆抗体,经ELIS A 及Western blot证实兔抗人PIWIL4抗体可特异性识别PIWIL4多肽,在人组织芯片中通过免疫组化染色显示该抗体在BU部分正常组织和肿瘤组织中呈阳性染色.结论 本项研究成功制备兔抗人PIWIL4多克隆抗体,为进一步研究PIWIL4在人类疾病中的意义提供了有利工具.     

抗人DR5单链抗体诱导HepG2细胞凋亡的实验研究

目的探究抗人DR5单链抗体(scFv)ZF1对肝癌细胞株HepG-2的凋亡作用及机制。方法 MTT法检测ZF1对HepG-2的细胞毒效应;流式细胞术检测ZF1诱导HepG2的凋亡率;荧光显微镜观察经ANNEXIN-V/PI双染的HepG-2细胞;DNA Ladder检测HepG-2细胞的DNA特点;Western blotting检测Bcl-2、PARP蛋白的表达。结果 MTT结果显示ZF1抑制HepG-2细胞生长呈剂量依赖性,ZF1终浓度分别为0.225、0.45、0.9mg/ml、1.2mg/ml200μl时,HepG-2细胞的生长抑制率分别为28.8%、52.3%、65.3%、89.8%;流式细胞仪检测结果显示,终浓度分别为0.225、0.45、1.2mg/ml2ml作用HepG-2细胞4h,凋亡率分别为32.9%、56%、83.2%;荧光显微镜下可见早期凋亡细胞,细胞膜呈绿色荧光,细胞内有凋亡小体的形成,伴有核结构的变化;DNALadder出现明显的彗星尾状条带;Western blotting检测到ZF1诱导凋亡的细胞内Bcl-2、PARP蛋白表达上调。结论 ZF1可诱导HepG2细胞株凋亡,这种作...     

抗人胃癌相关蛋白GCRG224多克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的: 制备胃癌相关蛋白GCRG224的多克隆抗体.方法: 在大肠杆菌中表达Thioredoxin/GCRG224融合蛋白,并以所获蛋白免疫新西兰白兔,制备抗GCRG224的多克隆抗体.ELISA、 Western blot法鉴定抗体的效价及特异性.免疫组化染色观察GCRG224在胃癌和正常组织中的表达.结果: 在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约为16 800的Thioredoxin/GCRG224融合蛋白,经凝胶回收法得到纯度近100%的蛋白产品.制备了抗GCRG224多克隆抗体.ELISA法检测抗体的效价达到1∶256 000,Western blot证实该抗体可与原核表达的GCRG224蛋白特异性结合.免疫组化染色显示GCRG224在胃癌组织中的表达明显强于正常胃黏膜组织.结论: GCRG224多克隆抗体的成功制备,为进一步深入研究GCRG224的生物学功能及其在胃癌发生发展中的作用奠定了基础.     

交联抗人DR5单抗诱导的Jurkat细胞凋亡的信号转导

目的探讨抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的死亡受体5（DR5）单抗——YM366EC对Jurkat细胞增殖的影响，阐明抗DR5抗体的抗肿瘤效应机制。方法MTF方法检测抗体对Jurkat细胞存活率，FrlE—AnnexinV／PI标记流式细胞仪检测交联YM366EC对Jurkat细胞凋亡率影响。交联YM366EC作用于Jurkat细胞2、4、6、8、10、12h收集细胞，提取蛋白Westernblot检测Bcl-2、Cyt—C、Caspase-8、Caspase-3、Bax、Caspase-9的变化。结果抗DR5抗体单独应用不能抑制高表达DR5分子的Jurkat细胞增殖，但应用抗小鼠IgG交联DR5抗体后可直接诱导TRAIL敏感的Jurkat细胞凋亡改变。并且Westernblot检测到随着抗体诱导时间的延长Jurkat细胞Bel-2蛋白表达减少；Cyt—C、Bax，有活性的Caspase-8、Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达增加。结论交联抗DR5抗体YM366EC对Jur—kat细胞增殖有明显的抑制作用，诱导的Jurkat细胞凋亡的分子机制涉及到Cyt-C、Bax、Caspase．8、Caspase-3、Caspase-9。     

抗死亡受体-5单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:研制抗DR5单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法:以纯化的DR5免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗DR5mAb。用Ig亚类ELISA试剂盒鉴定抗DR5mAb的亚类。用ELISA法测定sDR5对抗DR5mAb与DR5结合的阻断作用及流式细胞术检测与Jurkat细胞膜上DR5结合的阻断作用,以鉴定mAb的特异性。用间接ELISA法检测腹水mAb的效价、亲和常数并进行表位分析。结果:获得4株可分泌抗DR5mAb的的杂交瘤细胞系YM366EC、YM366ED、YM369F5和YM369E6。4株mAb的Ig亚类均为IgG1;腹水mAb效价为1×10-4~5×10-6;亲和常数为1×109水平,4株mAb可识别2种不同的抗原表位。结论:获得4株抗DR5的mAb,为进一步用于临床诊断和实验研究创造了条件。     

人Argonaute2蛋白多克隆抗体制备及初步应用

目的:制备人Argonaute2(Ago2)的多克隆抗体,鉴定其特异性,并应用该抗体检测Ago2在人各细胞系中的表达差异及细胞定位。方法:用DNAstar软件寻找抗原性高的Ago2序列区域(命名为k-Ago2),构建k-Ago2的表达质粒,转化大肠杆菌并诱导表达。融合蛋白经切胶回收纯化后免疫大白兔制备抗体。以ELISA检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性及检测Ago2在细胞系中的表达差异,免疫荧光染色观察Ago2的细胞定位。结果:成功构建表达质粒,继而k-Ago2得以表达与纯化,免疫大白兔后得到Ago2多克隆抗体。ELISA检测抗体效价为1∶19 000,Western blot确定抗体具有高度特异性,并成功地用该抗体检测到Ago2在人各细胞系中的表达差异及细胞定位。结论:Ago2多克隆抗体的成功制备,对RNAi机制的深入研究及其进一步的临床应用均具有重要价值。     

DR5胞外段基因的表达及功能初步鉴定

目的：获得具有生物活性的人DR5胞外段蛋白。方法：通过RT-PCR从Jurkat细胞中钓取DR5的胞外段基因（55—183位氨基酸），克隆到pGEM-T Easy载体中，经核酸序列测定正确后，将其再次克隆入原核表达载体pET30a中，在Ecoli B121（DE3）实现蛋白表达。通过SDS—PAGE和Western blot鉴定表达产物。ELISA法分析其与抗DR5单克隆抗体（mAb）结合能力。结果：克隆到人DR5基因的胞外段基因，测序结果和报道的一致；构建了人DR5胞外段基因的原核表达载体并实现在E．coli B121（DE3）中大量表达；SDS—PAGE表明所表达蛋白与预期蛋白的相对分子质量（Mr）一致；Western blot及ELISA的结果表明该蛋白能与抗DR5抗体反应，竞争阻断试验表明DR5胞外段可阻断TRAIL对Jurkat细胞生长的抑制。结论：成功地制备了具有生物活性的DR5胞外区，为后续研究打下了基础。     

抗人DR5单克隆抗体对人肝癌细胞系HepG2的凋亡作用

探讨抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)对人肝癌细胞系HepG2致凋亡的作用。常规培养人肝癌细胞系HepG2,流式细胞术定量分析检测HepG2细胞表面DR5的表达。MTT法检测mDRA-6的细胞毒性作用;Annexin V-FITC/PI双色标记HepG2细胞,流式细胞术定量分析检测细胞凋亡率;在荧光显微镜下观察mDRA-6对HepG2细胞形态变化的影响。结果显示,HepG2细胞表面有DR5表达,其平均表达百分率为40%。MTT法检测显示在40 mg/L mDRA-6浓度下可杀伤42%的细胞;Hoechst33258染色证实杀伤作用是通过细胞凋亡实现的经流式细胞术检测显示,3 mg/L的mDRA-6作用HepG2细胞6 h导致24.61%的细胞发生凋亡;在荧光显微镜下可观察到mDRA-6诱导导致HepG2细胞呈现典型细胞凋亡的形态特征。上述结果表明,mDRA-6能够诱导人肝癌细胞系HepG2凋亡。     

抗人DR5单克隆抗体对人肝细胞系HL7702的凋亡作用

目的:探讨抗人DR5单克隆抗体(mDRA6)对人肝细胞系HL7702致凋亡的作用。方法:流式细胞术检测HL7702细胞表面DR5的表达。在荧光显微镜下观察mDRA6对HL7702细胞形态变化的影响;MTT法检测mDRA6的细胞毒性作用;AnnexinVFITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:mDRA6导致HL7702细胞呈现典型细胞凋亡的形态特征;MTT法检测显示在40mg/L浓度下可杀伤39%的细胞;经流式细胞术检测显示,3mg/L的mDRA6作用HL7702细胞6h导致25.5%的细胞发生凋亡。结论:mDRA6能够诱导人肝细胞系HL7702凋亡,mDRA6具有诱导细胞凋亡的活性。     

食管癌细胞表面DR5的表达分布与细胞铺展状态的关系

目的：探讨食管癌鳞癌EC9706细胞系细胞表面DR5的表达分布与细胞铺展状态的关系。方法：免疫细胞化学技术分析食管癌EC9706细胞的DR5表达分布；流式细胞术检测食管癌细胞表面DR5的表达及细胞的凋亡率。结果：DR5分布在食管癌EC9706细胞的细胞质和细胞膜表面，主要在细胞质，但在细胞核没有DR5分布，而且在悬浮的食管癌细胞表面DR5表达高于铺展者。悬浮的食管癌细胞对抗DR5功能性抗体诱导的细胞凋亡敏感性高于铺展者。结论：食管癌细胞表面DR5的表达与细胞铺展状态具有密切的关系，细胞铺展状态的变化直接影响细胞表面DR5的表达分布以及对抗DR5功能性抗体诱导的细胞凋亡敏感性。该研究结果对进一步探讨DR5表达分布的机制以及TRAIL和DR5的功能性抗体的抗肿瘤临床应用有一定的指导意义。     

抗人木糖基转移酶蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备兔抗人木糖基转移酶（XT-I）蛋白的多克隆抗体，并对其特异性进行鉴定。方法：应用DNAssist软件分析XT-I蛋白的抗原表位，从中选择优势抗原表位，通过引物优化设计，PCR拼接并扩增相应区域DNA片段，将其插入原核表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌ER2566，获得融合表达产物。将纯化的可溶性蛋白GST-XT作为抗原，免疫新西兰大白兔，制备抗XT-I蛋白的多克隆抗体，ELISA间接法测定效价。GST柱亲和层析法纯化抗体，采用Westem blot法鉴定该抗体的特异性和生物学活性。结果：确定XT-I的N端氨基酸序列QKHQPELAKKPPSRQKELLKRKLEQQEKGKG（175-205）为抗原表位，成功构建了重组表达载体，表达融合蛋白GST-XT，并以其为抗原，免疫新西兰大白兔，制备了抗XT-I蛋白的多克隆抗体。ELISA证实其效价高达1：640000：Western blot结果显示：该抗体可与人涎腺腺样囊性癌肺转移细胞株ACC-M中表达的XT-I蛋白特异性结合。结论：获得具有高特异性的兔抗人XT-I蛋白多克隆抗体，为涎腺肿瘤性肌上皮细胞蛋白多糖生物合成的研究提供了特异性抗体。     

Generation of polyclonal antibodies against recombinant human activin A.

A goat antiserum to purified recombinant human activin A (rhAct-A), a dimer formed by two beta A-subunits of inhibin, has been produced. The immunoreactivity of the antiserum has been evaluated in an antigen coated enzyme-linked immunosorbent assay, in a radioimmunoassay using iodinated rhAct-A, and by Western blot analysis. The antiserum demonstrated some cross reactivity to inhibin A, a structurally related heterodimer which contains an identical beta A-subunit coupled to a distinct, though similar, alpha subunit. A simple radioimmunoassay for rhAct-A in tissue culture supernatant has been developed with rhAct-A affinity column purified polyclonal antiserum. The assay is precise and sensitive with a range of 0.31-40 ng/ml. The cross reactivity of inhibin A in the RIA is about 4.3%. Despite its cross-reactivity this antiserum will facilitate studies of the physiology of activin A and inhibin A which includes a Western blot analysis where a molecular size distinction is accomplished.     

HeLa及子宫颈癌组织中的DR5和bcl-2表达及其相关性

目的探讨死亡受体DR5、bcl-2蛋白在HeLa细胞株和宫颈癌组织中表达及其相关性。方法采用流式细胞术检测HeLa细胞株细胞表面DR5表达,免疫组化法检测DR5和bcl-2蛋白在HeLa细胞株的表达情况及在76例宫颈癌(包括鳞癌50份,腺癌26份),30例宫颈上皮肉瘤变(CIN)和20例正常宫颈组织中表达,并分析两者的相关性。结果 HeLa细胞株细胞表面DR5表达率30%;DR5和bcl-2蛋白主要在CIN和宫颈癌细胞质表达,DR5蛋白在宫颈鳞癌、腺癌、CIN和正常宫颈组织中阳性表达率分别是66%、62%、40%和35%。鳞癌组织DR5表达高于腺癌,但无统计学意义(P>0.05);宫颈癌组织中DR5的表达量显著强于CIN和正常宫颈组织,差异均有统计学意义(P<0.05),CIN与正常宫颈组织比较,差异无统计学意义(P>0.05)。bcl-2蛋白在宫颈鳞癌、腺癌、CIN和正常宫颈组织的阳性表达率分别为70%、65%、50%和20%。DR5和bcl-2蛋白在宫颈癌组织中的表达呈正相关(χ2=10.75,P=0.000)。结论 DR5和bcl-2蛋白在宫颈癌组织中的表达呈正相关,DR5蛋白表达可能与宫颈癌的发生、发展有一定的关系。