小鼠脑损伤相关基因的克隆及表达与生物学功能初步分析

目的 克隆1个与小鼠脑损伤早期反应相关的新基因(GBI),并对其功能进行初步分析.方法 SMART-RACE技术克隆该新基因全长cDNA;采用生物信息学软件分析其可能的功能结构域和进行序列相似性分析;Northern Blotting分析该基因在小鼠主要组织器官的生理水平的表达.结果 该新基因全长cDNA序列为1798bp,含1个编码249个氨基酸残基蛋白质的开放性阅读框.推导蛋白质分子与1个即刻早期蛋白IE175和1个应激相关蛋白RAB21具有部分序列相似性.Northern杂交显示其仅仅在小鼠脑组织有基础水平的表达.结论 该基因可能与创伤早期反应的应激信号转导相关,并命名为脑损伤相关基因GBI(gene related to brain injury,gi|19338981|gb|AF481964.1).     

人骨形成蛋白2的基因的克隆和序列分析

目的 克隆人骨形成蛋白2基因全长。方法 以成骨肉瘤细胞总RNA为模板，应用转录酶-多聚酶链反应法克隆人骨形成蛋白2的cDNA全长；将获得的基因插入pGEM—T—Easy载体质粒，并转化至大肠杆菌后挑选阳性克隆，利用限制性内切酶酶切分析鉴定重组质粒。结果 通过质粒酶切分析和序列测定，我们获得的基因为人骨形成蛋白2全长DNA序列。结论 克隆获得人骨形成蛋白2的基因，为其进一步开发利用提供了前提条件。     

人分化相关基因Ndr3的克隆、组织表达谱及亚细胞定位研究

目的 :研究人源分化相关新基因Ndr3的克隆、组织表达谱及亚细胞定位。方法 :采用电子拼接和PCR扩增技术 ,从人 2 2周孕龄胎肝cDNA文库中获得与人Ndr1基因同源的一段表达性序列标签 ,继而从成人脑cDNA文库分离出Ndr3的全长cDNA ;采用点杂交分析和多组织Northern杂交分析方法 ,确定其组织表达谱 ;将其亚克隆入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP_N1,用脂质体介导法转染COS_7细胞 ,确定其亚细胞定位。结果与结论 :Ndr3的全长cDNA为 2 879bp ,其开放阅读框 (ORF)编码 375个氨基酸 ,染色体定位为 2 0q12_11.2 3。Northern杂交和点杂交分析显示 ,NDR3在脑组织和睾丸中高表达 ,在肾、心肌和前列腺中有一定量的表达 ,在胚胎组织的表达较低 ,在 8种人肿瘤细胞中的表达极低。与绿色荧光蛋白融合表达的实验结果显示 ,该蛋白定位于核外胞浆内     

小鼠新基因 msid2的克隆、亚细胞定位及表达特征

目的：研究小鼠系统性RNAi相关基因msid2的克隆、亚细胞定位及表达特征。方法：通过生物信息学方法寻找小鼠中与线虫的sid-1基因同源的基因，用RT-PCR方法从小鼠大脑中分离到其全长cDNA；将其亚克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1，用脂质体介导转入CHO细胞，确定其亚细胞定位。结果与结论：基因msid2的cDNA全长1353bp，编码450个氨基酸，定位于小鼠16号染色体，其基因组全长16kb，包括14个外显子和13个内含子。亚细胞定位试验结果初步表明，该蛋白定位于内质网及质膜。RT-PCR结果显示msid2在小鼠大脑、小脑中高表达，而在其他组织表达水平较低。     

人类新基因flj20174的克隆、亚细胞定位、表达谱及功能初探

目的：研究人类系统性RNAi相关基因flj20174的克隆表达、亚细胞定位和表达谱，以及功能的初步探索。方法：利用生物信息学方法分析、预测flj20174基因的表达谱和功能；采用RT-PCR技术，从健康人外周血单个核细胞cDNA中，扩增获得flj20174可能的全长编码区，并将其亚克隆于pEGFP-N1载体；利用Northern杂交鉴定其转录本；利用半定量PCR确定flj20174在免疫组织和免疫细胞中的表达谱；通过脂质体转染入HeLa细胞，观察融合蛋白的亚细胞定位和过表达对细胞状态的影响。结果与结论：获得了2484bp的全长编码区。测序后发现与NCBI公布的Ak00018的序列完全一致；Northern杂交证实其转录本约为4669bp；证实该基因属于低丰度基因，在免疫细胞中有相对较高的表达，并在B细胞和T细胞激活后表达量下降；与EGFP融合表达后可见该蛋白主要分布于内膜系统，而且过表达该融合蛋白可以引起细胞的死亡，推测此过程可能与机体的免疫防御相关。     

小鼠脑损伤相关基因的克隆及表达与生物学功能初步分析

目的克隆1个与小鼠脑损伤早期反应相关的新基因（GBI），并对其功能进行初步分析。方法SMART—RACE技术克隆该新基因全长eDNA；采用生物信息学软件分析其可能的功能结构域和进行序列相似性分析；Northern Blotting分析该基因在小鼠主要组织器官的生理水平的表达。结果该新基因全长eDNA序列为1798bp，含1个编码249个氨基酸残基蛋白质的开放性阅读框。推导蛋白质分子与1个即刻早期蛋白IE175和1个应激相关蛋白RAB21具有部分序列相似性。Northern杂交显示其仅仅在小鼠脑组织有基础水平的表达。结论该基因可能与创伤早期反应的应激信号转导相关，并命名为脑损伤相关基因GBI（gene related to brain injury，gi1193389811 gb IAF481964．1）。     

快速克隆SET家族新成员SET07

目的:本实验基于生物信息学资源,快速克隆获得SET基因家族新成员SET07,并预测其相关生物学性质,为进一步探讨该基因的功能奠定基础。方法:以含有SET结构域的EST片段为基础,电子延伸获得含有SET结构域的新的编码基因,通过RT-PCR技术从胎脾组织中克隆得到该基因的cDNA序列,利用Northern印迹技术证实SET07基因的全长,并利用生物信息学工具预测其相关生物学性质。结果:获得新的SET家族成员,命名为SET07基因,证实该基因全长为3388bp。分析发现其开放阅读框架为1114bp,编码347个氨基酸,相对分子质量38×103,等电点9.57,在羧基端含有SET结构域,与H4-K20甲基转移酶同源。结论:上述结果提示SET07基因可能具有甲基转移酶的功能,在调节细胞生长周期、控制肿瘤的发生发展中发挥重要作用。     

人源新基因hGlyrichin的克隆及其功能的初步研究

目的：克隆获得与mL52新基因（GenBank：AY028425）同源人类新基因hGlyrichin，并研究其功能。方法：采用PCR法从人胎肝cDNA文库中扩增出该新基因，因富含甘氨酸而命名为hGlyrichin，以RT—PCR和Northem杂交分析在多种细胞株中的表达及转录本大小，并对该基因进行生物信息学分析，利用pE他2b表达载体构建重组质粒pET22b-hGlyrichin，转化大肠杆菌BL-21（DE3）中进行IPTG诱导表达。结果与结论：电子PCR证实该基因定位于人染色体20q11．22，包含3个外显子和2个内含子。Northern杂交结果显示为单一转录本，大小约600bp，与mL52全长cDNA长度相符。所编码的蛋白为含有疏水区的小分子阳离子蛋白，相对分子质量和等电点分别为8182．83和9．58，二级结构（Garnier-Robson模型）预测是以B折叠型为主，这些特点与目前已知的大多数阳离子抗菌肽的结构及部分理化特性极为类似，该基因转化后的大肠杆菌在IPTG诱导表达时的生长受到明显抑制，初步证实了hGlyrichin具有明显的抗菌活性。     

噬菌体表面展示技术筛选乙型肝炎病毒前S1蛋白结合蛋白基因

目的 以乙型肝炎病毒(HBV)前s1蛋白为靶蛋白,寻找其相应的结合蛋白。方法 应用T7 cDNA文库噬菌体展示技术克隆与前s1蛋白具有结合作用的蛋白序列,命名为前s1结合蛋白(PreS1BP)。将推断的氨基酸序列在蛋白质库中进行搜索,自GenBank中获得结合蛋白的cDNA和基因组的全长序列。结果 初步确定PreS1BP即为神经胶质瘤抑制基因区候选基因2(GLTSCR2),cDNA长为1436核苷酸,基因位于第19号染色体长臂13.3区(19q13.3),长度11445碱基对(bp),位于19号染色体10403483～10414989,PreS1BP基因含有13个外显子,具有12个内含子。结论 应用T7 cDNA文库噬菌体展示技术和生物信息学方法获得了HBV PreS1BP基因。     

一低剂量辐射诱导新基因的转录调控和初步功能分析

目的：克隆低剂量辐射诱导基因，研究辐射对其转录调控作用和生物学功能。方法：用mRNA差异显示技术分离辐射诱导表达基因，用RACE技术获取cDNA旁侧序列，Northern杂交分析基因的转录调节，生物信息学分析基因的结构和功能。结果：获得包括3'端在内的辐射诱导新基因LRIGx的cDNA片段，序列同源性比较显示与人染色体20ql 1.2-12一段DNA高度同源（＞99％），Northern杂交结果揭示该基因转录子全长约8．5kb，在0．2Gy照射后2h出现诱导表达，4h后转录子水平为对照细胞的5倍多，也受0．02Gy更低剂量照射诱导表达，2Gy大剂量照射后1h出现短暂诱导表达，但不如低量照射明显，2h后恢复正常水平，生物信息学分析结果显示该基因编码产物含有解旋酶活性保守区，结论：分离鉴定出一低剂量辐射反应基因，其编码蛋白可能参与DNA代谢（如修复）等细胞辐射反应过程。     

大鼠糖皮质激素受体变异体cDNA序列克隆和表达及功能研究

目的：构建大鼠糖皮质激素受体变异体表达载体，研究其表达和功能。方法：运用RT—nested PCR扩增糖皮质激素受体不含有编码LBD结构域的cDNA序列，将PCR产物定向克隆至pEGFP—N2质粒载体，测序筛选重组质粒；荧光显微镜观察重组质粒转染后的表达情况；相对荧光素酶法检测转录激活活性。结果：扩增出长1612bp的cDNA序列，测序证实：克隆片段与Genebank该基因序列同源性为100％；重组质粒表达产物定位于细胞核；转染组细胞转录激活活性增强。结论：成功构建糖皮质激素受体变异体的表达载体，该变异体具有不依赖激素的转录激活活性。     

人ID4基因启动子及上游顺式表达调控元件的克隆及特征分析

目的克隆人ID4基因启动子及上游顺式调控元件,并对其结构及调控元件的特征进行生物信息学分析。方法从NCBI人类基因组数据库中截取ID4基因转录起始位点上游5′侧翼区约2242bp及下游5′非翻译区212bp的基因组序列。利用TESS和Genomax等在线分析软件进行启动子及上游调控元件的特征分析。设计PCR引物,采用分段扩增法,获得长度分别为1811bp和650bp的两条产物片段,分别插入pGEM-T载体,转化至Top10感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆。先后应用KpnⅠ/NheⅠ、KpnⅠ/EcoRⅠ对获得的两个pGEM-T重组载体及pGL3Basic荧光素酶报告载体进行双酶切,T4DNA连接酶连接,转化至Top10感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆,最后测序鉴定。结果获得长度为2461bp的ID4基因启动子DNA序列,经测序证实与人类基因组序列一致。ID4基因具有Ⅱ型启动子特征,有2个非常显著的上游元件(TATA盒和GC盒),GC含量占总碱基含量的65.9%。在转录起始位点上游-1000bp与下游212bp之间分别存在多个可能具有正向和负向调控作用的顺式元件。结论成功克隆了人ID4基因启动子及其顺式调控元件,并...     

慢性髓系白血病bcr—abl融合基因在真核细胞中的表达

克隆慢性髓系白血病（CML）融合基因bcr-abl融合位点周围的cDNA序列,构建重组真核表达载体并表达于p815细胞,探索bcr-abl基因免疫治疗CML的可行性,设计两条引物扩增bcr-abl融合位点周围468bp的cDNA,测序正确后,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1通过电穿法转染至p815细胞中,应用G418筛选阳性细胞克隆,在含10％FCS的RPMI1640中常规培养,收集细胞进行RT－PCR鉴定。结果PCR扩增出了可用于基因免疫的位于bcr-abl融合基因位点周围的468bp的cDNA,序列测定除第448位碱基C突变为T外其余序列均正确,构建了重组真核表达载体,并用电穿孔法将其转染p815细胞,RT－PCR法检测到该细胞系有bcr-ablmRNA水平的表达。     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白5基因的克隆化研究

目的克隆乙型肝炎病毒（HBV）前-S1蛋白反式激活新基因PS1TP5的cDNA,并应用生物信息学技术初步探讨其结构及功能。方法应用聚合酶链反应（PCR）技术以HepG2细胞的cDNA为模板扩增PSlTP5,以pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到真核表达载体pcDNA^TM 3．1／myc-His A,通过PCR、限制性酶切分析进行鉴定,并应用生物信息学技术初步分析其物理化学性质、蛋白质结构和功能。结果PCR成功扩增出PS1TP5基因,并将其分别克隆进pGEM-T和pcDNA^TM3．1／myc-HisA载体,经PCR、限制性酶切鉴定后测序证实。因其可以被前-S1蛋白反式激活,故命名为前-S1反式激活蛋白5（PS1TP5）,已在GenBank中注册,注册号：AY427953。生物信息学分析确定其ORF为438个核苷酸（nt）,编码产物为145个氨基酸残基（aa）。结论发现了HBV前-S1蛋白反式激活新基因PS1TP5,构建了pcDNA^TM 3．1／myc-His A真核表达载体,为进一步研究其生物学功能及慢性乙型肝炎发病机制创造了条件。     

基于CMV启动子构建CVB3感染性克隆载体的初步研究

目的利用CMV启动子构建CVB3感染性克隆载体。方法将质粒pcDNA3.1（＋）的CMV启动子下游区域通过PCR技术替换成设计好的多克隆位点区,分别插入PCR合成的HdvRz核心序列和polyA尾片段,形成框架载体pc-H-A,通过瞬时转染HeLa细胞初步鉴定pc-H-A的可用性;用本室保存的CVB3（nancy株）感染HeLa细胞,取感染液上清提取病毒RNA,利用长链RT-PCR和长链PCR技术反复优化条件扩增病毒基因组全长片段,将此全长片段克隆至设计好的框架载体pc-H-A中,筛选阳性克隆,并对其进行测序鉴定。结果与结论构建了带有CMV启动子的框架载体pc-H-A并初步鉴定了该载体可用,利用此框架载体构建了与基因库中序列相似性为99%的CVB3全长cDNA克隆pc-CVB3-H-A。该研究为进一步鉴定所构建的CVB3全长克隆的感染性提供了基础,并为后续在病毒学研究和基因治疗方面的研究提供了手段。     

小鼠AMCase基因突变体的cDNA克隆及序列分析

目的 克隆小鼠酸性哺乳动物几丁质酶（AMCase）,并进行序列分析。方法 从BALB/c小鼠胃组织中提取总RNA,逆转录成cDNA,运用PCR技术体外扩增获得AMCase基因,构建pMD18T／AMCase重组载体,测序后应用DNAMAN4.0软件与标准序列进行比较,并通过SignalP 3.0和TMHMM Serverv．2.0等服务器对等电点、氨基酸组成、信号肽和跨膜结构等特征进行分析。结果 所克隆基因共编码473个氨基酸,分子量为51．93kD。等电点为4．73。与AMCase同源性达99．57％,同属18家族的几丁质酶成员,由信号肽（氨基酸1～21）、催化区（氨基酸22～391）、铰链区（氨基酸392～425）和结合区（氨基酸426～473）组成。编码的蛋白质在催化区和铰链区分别发生了突变。292位氨基酸由Ala（丙氨酸）突变为Pro（脯氨酸）,404位氨基酸由Thr（苏氨酸）突变为Ser（丝氨酸）。结论 所克隆的基因为AMCase的一个突变体。其相关生物学信息的明确,为今后运用分子生物学技术进一步深入研究其作用奠定了基础。     

高迁移率族蛋白B1cDNA的克隆与表达

目的克隆人高迁移率族蛋白B1（HMGB1）cDNA,构建重组原核表达载体,对其诱导表达并鉴定,为设计HMGB1 cDNA突变体及诱导表达可竞争性抑制HMGB1炎症效应的突变体蛋白奠定基础。方法提取人新鲜扁桃体组织总RNA,经RT-PCR扩增出人HMGB1 cDNA序列,并克隆至载体pUC18进行序列测定,随后构建于原核表达载体pQE-80L中,经IPTG诱导4小时后,可表达Mr约30 000的蛋白。Western Blotting鉴定所表达的目的蛋白。结果经RT—PCR扩增得到了648bp的cDNA,经序列分析与GenBank中报道的已知序列完全一致,构建了HMGB1蛋白的重组表达质粒,诱导表达了目的蛋白,经Western Blotting证实,在Mr约为30000处有一条清楚的蛋白带。结论获得了HMGB1 cDNA的克隆与原核表达载体。