环介导等温扩增技术检测间日疟原虫方法的建立及应用分析

目的建立一种快速、简便的检测间日疟原虫的环介导等温扩增方法（LAMP）并与常规PCR方法作比较。方法根据间日疟原虫环子孢子蛋白（CSP）基因序列合成2对特异性LAMP引物,优化Mg2＋浓度、dNTPs浓度、BstDNA聚合酶添加量、反应温度、时间以及设计引物缺省试验。评估优化后的LAMP反应的特异性和灵敏性。检测133份患者血样,以显微镜检方法为金标准,比较LAMP和多重PCR法检测间日疟原虫的敏感性和特异性。结果 LAMP法检测重组质粒DNA（Pv-rDNA）的灵敏度达到10-10,为传统PCR方法的100倍。镜检确诊的68例间日疟、43例恶性疟和22例非疟疾患者中,LAMP法和多重PCR检测间日疟原虫的敏感性为98.53%和97.06%,两法基本相当（χ2=0.34,P〉0.05）;特异性为86.15%和100%,LAMP法低于多重PCR法,差异有统计学意义（χ2=9.67,P〈0.05）。LAMP法的阳性预测值和阴性预测值分别为88.16%和98.25%,多重PCR的阳性预测值和阴性预测值分别为100%和97.01%。结论 LAMP法检测间日疟原虫具有快速简便、敏感性高、设备要求低的特点,具有较好的应用前景。     

Differentiation of Cryptococcus neoformans varieties and Cryptococcus gattii using CAP59-based loop-mediated isothermal DNA amplification

Members of the Cryptococcus species complex (C. neoformans and C. gattii) are opportunistic pathogens responsible for frequently fatal cases of meningoencephalitis. These yeasts have been classified into five serotypes. Serotypes A andDare assigned to C. neoformans var. grubii and C. neoformans var. neoformans, respectively, Serotype AD strains are hybrids and serotype B and C strains are considered to belong to the related but distinct species C. gattii. Previous studies have identified ‘serotype-associated' alleles of several genes in the Cryptococcus species complex. We developed a loop-mediated isothermal DNA amplification method using CAP59 allele-specific primers to identify the serotypes A, D and B/C of the Cryptococcus species complex.     

环介导等温扩增技术检测卡氏肺孢子虫的研究

目的 环介导等温扩增(LAMP)技术检测卡氏肺孢子虫(Pc).方法 醋酸可的松经皮下注射Wistar大鼠诱导Pc,收集支气管肺泡灌洗液(BALF)提取Pc基因组DNA.设计4条扩增Pc线粒体核糖体大亚基(mtrRNA)基因的LAMP引物,以结核杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、弓形虫、大鼠白细胞为对照,进行LAMP反应.LAMP产物经显色、电泳及酶切鉴定.将Pc DNA 10倍稀释后同时进行LAMP和PCR,比较其敏感性.结果 Pc检测管经显色后呈绿色(阳性),对照组均呈棕色(阴性).Pc LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,扩增产物经Tail限制性内切酶酶切鉴定正确,对照组均无扩增产物.LAMP可检测到虫体DNA的最低浓度是lP9/pJ,为PCR的10倍.结论 检测Pc的LAMP方法敏感、特异及简便.     

环媒恒温扩增技术(LAMP)检测原型泡沫病毒

目的 利用环媒恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立检测原型泡沫病毒(prototype foamy virus,PFV)的方法.方法 根据PFV的整合酶核心区基因序列设计了3对LAMP引物,利用有链取代活性的Bst DNA聚合酶在63℃对靶序列进行扩增.优化检测条件,建立PFV的检测方法.结果 以含目的片段的质粒为模板建立了PFV的检测方法,运用此方法可特异地检测出PFV,而人免疫缺陷病毒、牛免疫缺陷病毒、牛泡沫病毒检测均为阴性,检测灵敏度为50拷贝,较聚合酶链反应高一个数量级.系统可以在15 min内完成扩增,同时可以在细胞基因组干扰下检出病毒,对混有病毒基因的人外周血单个核细胞(PBMC)总DNA的检测呈现特异阳性反应.结论 建立基于PFV整合酶基因的LAMP检测方法,在PFV感染检测方面有应用前景.     

Rapid and sensitive detection of Penaeus monodon nucleopolyhedrovirus by loop-mediated isothermal amplification

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a novel, sensitive and rapid method for amplification of nucleic acids under isothermal conditions. In this report, a LAMP method was developed for detection of Penaeus monodon nucleopolyhedrovirus (PemoNPV), known previously as monodon baculovirus (MBV), using a set of six primers designed to specifically recognize the PemoNPV polyhedrin gene. The optimized time and temperature conditions for the LAMP assay were 60 min at 63 °C. The sensitivity of LAMP for PemoNPV detection was approximately 50 viral copies ng⁻¹ genomic DNA (equivalent to 150 viral copies per reaction). Using a DNA template extracted from PemoNPV-infected shrimp by a viral nucleic acid kit, the detection limit of LAMP was 0.7 fg while that of nested PCR was 70 fg; therefore, the LAMP assay was 100 times more sensitive than nested PCR. The LAMP method did not amplify a product using nucleic acid extracted from shrimp infected with other viruses including yellow head virus (YHV), Taura syndrome virus (TSV), white spot syndrome virus (WSSV), Penaeus stylirostris densovirus (PstDNV) known previously as infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV), and Penaeus monodon densovirus (PmDNV) known previously as hepatopancreatic parvovirus (HPV).     

环介导等温核酸扩增法在基因检测中的应用

环介导等温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种操作简单、快速、灵敏度高,而且特异性强的DNA扩增技术,已广泛应用于临床诊断,胚胎性别鉴定,以及细菌和病毒等病原微生物的检测.本文简述了环介导等温核酸扩增技术的原理、特点和在基因检测中的应用,分析了该技术存在的问题,并对该技术未来的发展进行了展望.     

应用环介导等温扩增法快速检测O139群霍乱弧菌

目的 建立一种适合基层检验部门及小型实验室使用的快速检测O139群霍乱弧菌的方法.方法 应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对O139霍乱弧菌wbfR基因设计4条引物(2条内引物、2条外引物);优化LAMP反应条件和反应体系,对反应体系中的引物、dNTP、Mg2+/Mn2+离子及Calcium等浓度进行优化;并对13株种系背景明确的霍乱弧菌不同实验对照株、30株O139群霍乱弧菌地方分离株、10株O1群霍乱弧菌地方分离株、32株其他肠道菌进行检测,验证该方法的特异性;通过肉眼目测或电泳检测比较结果.结果 所有O139群霍乱弧菌经LAMP榆测均呈绿色并电泳有阶梯状条带为阳性,O1群霍乱弧菌及其他肠道菌均检测呈橙色并电泳无相应条带为阴性;该体系最低检测限为63 CFU/反应;检测结果在白光下通过肉眼即可判断;从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右.结论 本研究建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测O139群霍乱弧菌,无需昂贵的仪器,简单方便,非常适合基层检验部门或小型实验室以及流行病学人员于应急车上或现场监测等使用,值得推广.     

应用环介导等温扩增法快速检测O139群霍乱弧菌

目的 建立一种适合基层检验部门及小型实验室使用的快速检测O139群霍乱弧菌的方法.方法 应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对O139霍乱弧菌wbfR基因设计4条引物(2条内引物、2条外引物);优化LAMP反应条件和反应体系,对反应体系中的引物、dNTP、Mg2+/Mn2+离子及Calcium等浓度进行优化;并对13株种系背景明确的霍乱弧菌不同实验对照株、30株O139群霍乱弧菌地方分离株、10株O1群霍乱弧菌地方分离株、32株其他肠道菌进行检测,验证该方法的特异性;通过肉眼目测或电泳检测比较结果.结果 所有O139群霍乱弧菌经LAMP榆测均呈绿色并电泳有阶梯状条带为阳性,O1群霍乱弧菌及其他肠道菌均检测呈橙色并电泳无相应条带为阴性;该体系最低检测限为63 CFU/反应;检测结果在白光下通过肉眼即可判断;从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右.结论 本研究建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测O139群霍乱弧菌,无需昂贵的仪器,简单方便,非常适合基层检验部门或小型实验室以及流行病学人员于应急车上或现场监测等使用,值得推广.     

应用环介导等温扩增法快速检测O139群霍乱弧菌

目的 建立一种适合基层检验部门及小型实验室使用的快速检测O139群霍乱弧菌的方法.方法 应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对O139霍乱弧菌wbfR基因设计4条引物(2条内引物、2条外引物);优化LAMP反应条件和反应体系,对反应体系中的引物、dNTP、Mg2+/Mn2+离子及Calcium等浓度进行优化;并对13株种系背景明确的霍乱弧菌不同实验对照株、30株O139群霍乱弧菌地方分离株、10株O1群霍乱弧菌地方分离株、32株其他肠道菌进行检测,验证该方法的特异性;通过肉眼目测或电泳检测比较结果.结果 所有O139群霍乱弧菌经LAMP榆测均呈绿色并电泳有阶梯状条带为阳性,O1群霍乱弧菌及其他肠道菌均检测呈橙色并电泳无相应条带为阴性;该体系最低检测限为63 CFU/反应;检测结果在白光下通过肉眼即可判断;从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右.结论 本研究建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测O139群霍乱弧菌,无需昂贵的仪器,简单方便,非常适合基层检验部门或小型实验室以及流行病学人员于应急车上或现场监测等使用,值得推广.     

应用环介导等温扩增法快速检测O139群霍乱弧菌

目的 建立一种适合基层检验部门及小型实验室使用的快速检测O139群霍乱弧菌的方法.方法 应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对O139霍乱弧菌wbfR基因设计4条引物(2条内引物、2条外引物);优化LAMP反应条件和反应体系,对反应体系中的引物、dNTP、Mg2+/Mn2+离子及Calcium等浓度进行优化;并对13株种系背景明确的霍乱弧菌不同实验对照株、30株O139群霍乱弧菌地方分离株、10株O1群霍乱弧菌地方分离株、32株其他肠道菌进行检测,验证该方法的特异性;通过肉眼目测或电泳检测比较结果.结果 所有O139群霍乱弧菌经LAMP榆测均呈绿色并电泳有阶梯状条带为阳性,O1群霍乱弧菌及其他肠道菌均检测呈橙色并电泳无相应条带为阴性;该体系最低检测限为63 CFU/反应;检测结果在白光下通过肉眼即可判断;从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右.结论 本研究建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测O139群霍乱弧菌,无需昂贵的仪器,简单方便,非常适合基层检验部门或小型实验室以及流行病学人员于应急车上或现场监测等使用,值得推广.     

应用环介导等温扩增法快速检测O139群霍乱弧菌

目的 建立一种适合基层检验部门及小型实验室使用的快速检测O139群霍乱弧菌的方法.方法 应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对O139霍乱弧菌wbfR基因设计4条引物(2条内引物、2条外引物);优化LAMP反应条件和反应体系,对反应体系中的引物、dNTP、Mg2+/Mn2+离子及Calcium等浓度进行优化;并对13株种系背景明确的霍乱弧菌不同实验对照株、30株O139群霍乱弧菌地方分离株、10株O1群霍乱弧菌地方分离株、32株其他肠道菌进行检测,验证该方法的特异性;通过肉眼目测或电泳检测比较结果.结果 所有O139群霍乱弧菌经LAMP榆测均呈绿色并电泳有阶梯状条带为阳性,O1群霍乱弧菌及其他肠道菌均检测呈橙色并电泳无相应条带为阴性;该体系最低检测限为63 CFU/反应;检测结果在白光下通过肉眼即可判断;从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右.结论 本研究建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测O139群霍乱弧菌,无需昂贵的仪器,简单方便,非常适合基层检验部门或小型实验室以及流行病学人员于应急车上或现场监测等使用,值得推广.     

应用环介导等温扩增法快速检测O139群霍乱弧菌

目的 建立一种适合基层检验部门及小型实验室使用的快速检测O139群霍乱弧菌的方法.方法 应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对O139霍乱弧菌wbfR基因设计4条引物(2条内引物、2条外引物);优化LAMP反应条件和反应体系,对反应体系中的引物、dNTP、Mg2+/Mn2+离子及Calcium等浓度进行优化;并对13株种系背景明确的霍乱弧菌不同实验对照株、30株O139群霍乱弧菌地方分离株、10株O1群霍乱弧菌地方分离株、32株其他肠道菌进行检测,验证该方法的特异性;通过肉眼目测或电泳检测比较结果.结果 所有O139群霍乱弧菌经LAMP榆测均呈绿色并电泳有阶梯状条带为阳性,O1群霍乱弧菌及其他肠道菌均检测呈橙色并电泳无相应条带为阴性;该体系最低检测限为63 CFU/反应;检测结果在白光下通过肉眼即可判断;从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右.结论 本研究建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测O139群霍乱弧菌,无需昂贵的仪器,简单方便,非常适合基层检验部门或小型实验室以及流行病学人员于应急车上或现场监测等使用,值得推广.