密度梯度离心与贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞及其生物学特性观察

背景：获取更大量、更高纯度、有活性的骨髓间充质干细胞是干细胞移植及组织工程研究发展的基础。目的：拟建立一套体外分离培养及大量扩增兔骨髓间充质干细胞的方法，并对细胞生物学特性进行观察。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2006—12／2007—07在山东省烟台市莱阳中心医院骨科试验室完成。材料：清洁级1月龄雌性新西兰大白兔1只。方法：采用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合的方式，分离兔骨髓间充质干细胞，应用细胞刮收集呈长梭形的细胞，形成克隆后用胰蛋白酶＋EDTA消化，按1：3传代进行体外扩增培养。主要观察指标：倒置相差显微镜下观察细胞形态特征，免疫细胞化学SABC法鉴定CD34、CD44抗原的表达，观察细胞生长特性，测定细胞活力。结果：原代分离培养的贴壁细胞呈长梭形，漩涡状排列，约14d达90％以上融合；传代后增殖迅速，细胞为单一的梭形，排列更加有序。所培养的细胞CD44呈阳性表达，而CD34呈阴性。第1～5代细胞培养3—5d为对数生长期，第7代以后对数增长期延长。第1～5代细胞成活率均〉94％，其中第3，4代成活率高达97％；至第7代细胞活力呈明显下降趋势，细胞成活率仅为78％。结论：应用密度梯度离心结合贴壁法，可成功分离并扩增兔骨髓间充质干细胞，且细胞生长稳定，增殖力强．可作为细胞移植的种子细胞。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

背景：目前对骨髓间充质干细胞常用的分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选分离法。目的：联合应用密度梯度离心法和贴壁筛选分离法体外分离培养、扩增兔骨髓间充质干细胞，并对其进行鉴定。设计、时间及地点：对比观察的细胞学实验，于2007-10／2008-03在上海市第六人民医院中心实验室完成。材料：2月龄新西兰纯种大耳白兔6只用于骨髓间充质干细胞取材与原代培养，1．073kg／L的Percoll分离液。方法：实验采用Percol分离液利用密度梯度离心法及结合贴壁分离筛选法来分离、纯化骨髓间充质干细胞，在采用密度梯度离心法得到骨髓间充质干细胞后，经贴壁培养及反复换液纯化骨髓间充质干细胞。分别取第3，5，7，9代骨髓间充质干细胞，行细胞计数，绘制细胞生长曲线。主要观察指标：倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况。采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。CD44染色呈阳性，CD34染色呈阴性，说明所提取、纯化的细胞是骨髓间充质干细胞。结果：增殖传代的骨髓间充质干细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养的细胞更均匀，细胞生长旺盛、增殖迅速，胞核明显，核仁清晰，核浆比例大，细胞形态均匀，平行排列呈螺旋状或漩涡状，传代至第5代时无明显变化。随传代次数的增加，细胞增殖能力逐渐下降，第3～5代细胞增殖能力强。所分离培养的细胞均表达CD44，不表达CD34。结论：在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞。     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养条件的优化组合

背景：骨髓间充质干细胞分离培养方法的不同可导致其活性与纯度各异，直接影响组织工程的修复效果。目的：对骨髓间充质干细胞体外分离培养条件进行优化组合，并验证其获取骨髓间充质干细胞的效果。设计、时间及地点：细胞学体外实验，于2007-10／12在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。材料：清洁级3月龄新西兰白兔2只，由山西畜牧研究所提供。方法：向含有新鲜骨髓的DMEM培养液中加入等量淋巴细胞分离液，采用密度梯度离心和差速贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞，每间隔8h将未贴壁细胞转移入新的培养瓶，接种5d后首次换液，细胞融合率达90％时胰酶消化传代，第1、3、5代细胞用于实验。主要观察指标：镜下观察细胞形态及生长状态，绘制细胞生长曲线，测定倍增时间，流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44标记率。结果：原代培养的骨髓间充质干细胞呈圆形、梭形、多角形等，48h可见贴壁细胞有伸展现象，呈梭形，多角形，成纤维细胞样展开，细胞核清晰，首次换液后可见细胞透亮并充分展开，14d左右可达90％融合。第1、3、5代骨髓间充质干细胞整体呈S型，1～3d为潜伏期，3d后进入对数生长期，7～8d为平台期，平均倍增时间为24．22h。第2代骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达，标记率为93．0％。结论：采用密度梯度离心联合差速贴擘、离心介质选择淋巴细胞分离液、接种5d首次换液的体外分离培养纯化方法，获得的骨髓间充质干细胞生长状态良好，且纯度较高。     

兔骨髓间充质干细胞分离培养后的活力检测

背景：目前分离纯化骨髓间充质干细胞多采用单一的方法,对扩增培养过程中细胞活力的变化没有较为系统而全面的评估。目的：探索体外分离培养和纯化兔骨髓间充质干细胞的方法,并对细胞的活力进行检测。方法：采用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,从形态学、细胞表型和成骨成脂能力方面进行鉴定;并从细胞生长曲线、贴壁率和克隆形成率3个方面评估细胞活力。结果与结论：原代细胞多呈梭形和圆形,48h后大部分细胞贴壁,8-10d细胞融合达80%-90%,传代周期为3-5d;流式检测显示CD14、CD34和CD45表达阴性,CD29、CD44和CD90表达阳性;成骨诱导茜素红染色可见明显的钙结节,成脂诱导油红O染色可见大量脂肪细胞;细胞生长曲线、贴壁率及克隆形成率的结果表明第1代和第3代细胞的活力优于第5代细胞。结果说明密度梯度离心联合贴壁筛选的方法能够有效的分离纯化骨髓间充质干细胞,并能较好的保持其生物功能,在扩增传代过程中,细胞活力会有不同程度的下降。     

骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景：以骨髓间充质干细胞构建组织工程气管尚缺乏理想的特异性表面标志物,对其鉴定主要依赖细胞形态学、细胞表型及诱导分化的功能进行分析。目的：体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察在特定条件下向气管软骨细胞分化的潜能。方法：无菌环境取兔骨髓,经全骨髓贴壁筛选法分离培养细胞至第2代,流式细胞术鉴定第1、第2代细胞表面抗原CD44、CD45的表达。无菌环境取气管,经酶消化法分离培养气管软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞蛋白聚糖的合成。在使用转化生长因子B1的基础上,将骨髓间充质干细胞与气管软骨细胞通过Transwell小室非接触式共培养,倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色鉴定蛋白聚糖的合成,荧光实时定量PCR鉴定Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA的表达。结果与结论：分离、培养的细胞呈长梭形、不规则形聚集生长,传代后细胞生长速度明显增快,呈鱼群状聚集生长。第1代有96．97％的细胞表达CD44、13.72％的细胞表达CD45,第2代有99．11％的细胞表达CD44、8．54％的细胞表达CD45。气管软骨细胞甲苯胺蓝染色阳性。在诱导后,骨髓间充质干细胞形态逐渐由长梭形变为三角形或不规则形,表达软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA基因,甲苯胺蓝染色示阳性。结果表明全骨髓贴壁筛选法可成功分离培养骨髓间充质干细胞,第2代纯度较高,且在特定诱导条件下具有分化为气管软骨细胞的潜能。     

兔骨髓间充质干细胞培养及向成软骨细胞的诱导分化

背景：骨髓间充质干细胞没有理想的特异性表面标志物,对其鉴定尚无统一标准,大多数鉴定依赖于其形态水平、功能特征及培养过程中出现的分化表型来协助鉴定。目的：体外培养扩增、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察其诱导分化为成软骨细胞的可行性。方法：密度梯度离心法提取兔骨髓间充质干细胞,采用倒置显微镜进行形态学观察;用含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液培养细胞,每日定时进行细胞计数,观察细胞生长速度;采用流式细胞学方法分别检测原代及第3代细胞CD44、CD45、CD29的表达情况;取第3代生长良好的兔骨髓间充质干细胞,以特定培养液诱导（含体积分数为10%胎牛血清、转化生长因子110μg/L、胰岛素样生长因子Ⅰ110μg/L、转铁蛋白6.25mg/L、地塞米松10mmol/L、维生素C0.05mmol/L）,倒置显微镜下观察形态变化,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原的表达。结果与结论：培养的细胞长梭形,呈成纤维细胞样生长,传代细胞生长迅速。流式结果表明,原代细胞有62.4%的细胞表达CD29,有60.3%的细胞表达CD44,有2.79%的细胞表达CD45,第3代有99.9%的细胞表达CD29,有99.6%的细胞表达CD44,有2.62%的细胞表达CD45。骨髓间充质干细胞诱导后体外扩增能力明显降低,诱导21d后形态变化比较显著,Ⅱ型胶原阳性细胞较多。结果显示应用密度梯度离心法可成功分离并扩增骨髓间充质干细胞,第3代细胞纯度较高,在适当的条件下,具有分化为成软骨细胞的潜能。     

体外扩增传代对骨髓间充质干细胞归巢相关因子的影响

背景：间充质干细胞移植后在体内的归巢能力,会随着供体细胞在体外的培养传代而下降,从而严重影响了间充质干细胞对靶组织的修复作用。
　　目的：探讨体外扩增传代对人骨髓来源间充质干细胞归巢相关因子的影响。
　　方法：应用 Ficol 密度梯度离心法将间充质干细胞自骨髓中分离出来,利用其贴壁生长的特性加以纯化,在常规培养条件下培养至第7代,观察原代及第3,5,7代细胞的形态学特点。采用MTT法检测第3,5,7代间充质干细胞的生长增殖特性,并绘制生长曲线。Real-time PCR法检测第3,5,7代间充质干细胞中归巢相关因子CXCR4、CXCR6、CXCL12(SDF-1)、CD44的表达,以2-△△Ct计算各代细胞目的基因的相对表达量,比较不同代次间充质干细胞中各细胞归巢因子表达的差异。
　　结果与结论：采用密度梯度离心法自骨髓获得单个核细胞,将其贴壁培养传至第3代,可获得纯度较高的间充质干细胞。其在体外的增殖能力较强,但随着传代扩增次数增加,形态从细长梭形逐渐缩短变宽,增殖速率、总体扩增倍数以及CXCR4、CXCR6、CXCL12、CD44等细胞归巢因子的表达亦随传代培养而呈下降趋势。结果显示,间充质干细胞的归巢能力随扩增传代而逐渐下降,其机制可能与CXCR4、CXCR6、CXCL12、CD44等归巢相关因子在间充质干细胞中的表达水平下降有关。     

自体激活富血小板血浆干预兔骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的研究

背景：自体富血小板血浆激活后可释放多种生长因子,可以促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化。目的：观察自体激活富血小板血浆对体外培养的兔骨髓间充质干细胞向成软骨细胞分化的影响。方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞;取第3代骨髓间充质干细胞,分别应用体积分数10%自体激活富血小板血浆和体积分数10%胎牛血清培养液进行体外培养,观察其向成软骨细胞分化情况。结果与结论：分离培养的兔骨髓间充质干细胞呈长梭形,传代后细胞生长迅速。流式细胞仪检测发现第3代细胞高表达CD29、CD44,而低表达CD45。免疫荧光细胞化学染色显示经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞表达Ⅱ型胶原;实时荧光定量PCR检测发现经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因表达明显高于经胎牛血清诱导的骨髓间充质干细胞（P〈0.01）。可见自体激活富血小板血浆具有促进兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化的潜能。     

兔骨髓间充质干细胞分离培养后的活力检测

背景:目前分离纯化骨髓间充质干细胞多采用单一的方法,对扩增培养过程中细胞活力的变化没有较为系统而全面的评估。目的:探索体外分离培养和纯化兔骨髓间充质干细胞的方法,并对细胞的活力进行检测。方法:采用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,从形态学、细胞表型和成骨成脂能力方面进行鉴定;并从细胞生长曲线、贴壁率和克隆形成率3个方面评估细胞活力。结果与结论:原代细胞多呈梭形和圆形,48h后大部分细胞贴壁,8-10d细胞融合达80%-90%,传代周期为3-5d;流式检测显示CD14、CD34和CD45表达阴性,CD29、CD44和CD90表达阳性;成骨诱导茜素红染色可见明显的钙结节,成脂诱导油红O染色可见大量脂肪细胞;细胞生长曲线、贴壁率及克隆形成率的结果表明第1代和第3代细胞的活力优于第5代细胞。结果说明密度梯度离心联合贴壁筛选的方法能够有效的分离纯化骨髓间充质干细胞,并能较好的保持其生物功能,在扩增传代过程中,细胞活力会有不同程度的下降。     

兔骨髓间充质干细胞生物学特性的实验研究

目的:体外优化获取兔骨髓间充质干细胞并对其进行纯化、扩增,同时对其生物学特性进行研究,获得足量细胞用于材料细胞的相容性研究.方法:抽取新西兰大白兔骨髓,采用密度梯度离心法和贴壁筛选法相结合进行分离培养,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线,测定贴壁率.结果:经密度梯度离心法和贴壁筛选法相结合得到的骨髓间充质干细胞纯度高,性状稳定,生长曲线相似,传代后第12小时贴壁率高达90%;Giemsa染色光镜观察免骨髓间充质干细胞为单核细胞,呈梭形或不规则长多边形.结论:建立兔骨髓间充质干细胞体外分离培养的最适条件,骨髓间充质干细胞增殖能力强,可作为材料细胞相容性研究的受试细胞,并可作为组织工程的种子细胞.     

Tiotidine and cimetidine--kinetics and dynamics

Tiotidine and cimetidine kinetics and dynamics were compared to assess mechanisms of the longer duration of effect of tiotidine in man. Both drugs has similar lag times for absorption. Tiotidine with a meal was more slowly absorbed than when fasting and was also more slowly absorbed than cimetidine with a meal. The elimination rates for both drugs did not differ; they were both approximately 2 to 3 hr. Oral doses of cimetidine achieved areas under the plasma concentration curve approximately three times that of tiotidine but these concentrations were only 1/10 as potent. The cimetidine concentration inducing 50% inhibition of food-stimulated gastric acid secretion was 0.41 +/- 0.04 whereas it was 0.04 +/- 0.003 microgram/ml for tiotidine. The effect of tiotidine lasted longer than that of cimetidine because the doses recommended for use in man resulted in higher concentrations in plasma relative to effective concentration than clinical doses of cimetidine.