凋亡诱导因子介导TAp63γ诱导的人食管鳞癌细胞株EC9706细胞凋亡

目的探讨TAp63γ诱导的人食管鳞癌细胞株EC9706细胞凋亡的分子机制。方法用免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测食管鳞癌EC9706细胞中凋亡诱导因子（AIF）和p63的表达;将质粒pcDNA3．1-TAp63γ转入EC9706细胞,流式细胞仪检测凋亡率,并用激光共聚焦显微镜和亚细胞器分离技术观察分析AIF的转位;采用RNA干扰技术下调AIF的蛋白表达水平,caspase广谱抑制剂zVAD．fmk预处理细胞,再用流式细胞仪分析EC9706细胞表达TAp63γ后凋亡率的变化。结果EC9706细胞中AIF表达且定位在细胞质中,p63基因的表达亚型是ANp63,TAp63γ不表达;在pcDNA3．1-TAp63γ转染组和pcDNA3．1-p53转染组的细胞质及细胞核蛋白中分别检测到AIF,pcDNA3．1转染组的胞核蛋白无AIF信号;pcDNA3．1转染组、pcDNA3．1-TAp63γ转染组、AIF—siRNA干扰后再转染pcDNA3．1-TAp63γ组、zVAD．fmk处理后再转染pcDNA3．1-TAp63γ组和AIF-siRNA干扰联合zVAD．fmk处理后再转染pcDNA3．1-TAp631组的凋亡率分别为1．37％、13．64％、4．52％、4．03％和1．91％。结论TAp63γ在诱导EC9706细胞凋亡的过程中,AIF从线粒体释放入胞质并转位到细胞核内;下调AIF的蛋白表达水平可降低TAp631诱导的细胞凋亡;TAp631诱导的细胞凋亡依赖于AIF和caspase。     

小干扰RNA阻断信号转导子和转录激活子3信号对人食管鳞癌细胞株增殖的抑制作用

目的探讨信号转导子和转录激活子3（STAT3）小干扰RNA（siRNA）对食管鳞状细胞癌细胞株（EC9706和Eca109）中持续性激活STAT3信号的阻断情况及阻断STAT3信号对细胞增殖的影响。方法将化学合成的100nmol／L的STAT3 siRNA转染EC9706和Eca109细胞,逆转录聚合酶链反应检测转染前后STAT3mRNA的表达,WeStern blot检测转染前后STAT3及磷酸化STAT3（P—STAT3）蛋白的表达,凝胶电泳迁移率检测转染前后活化STAT3蛋白的核结合情况,四甲基偶氮唑蓝（MTT）检测转染前后细胞增殖能力的改变,流式细胞仪检测转染前后细胞周期的改变。结果STAT3 siRNA以时间依赖方式特异性地抑制STAT3 mRNA及STAT3、P-STAT3蛋白的表达,并且STAT3蛋白的核结合活性下降,使细胞周期阻滞于G0／G1期,细胞增殖受到明显的抑制。与对照组相比EC9706细胞转染后72hG0／G1期的细胞增加了16．1％,同时S期细胞减少11．1％;Eca109细胞转染后72hG0／G1期的细胞增加了11．8％,同时S期细胞也较对照组明显减少。结论STAT3 siRNA能够特异地阻断食管鳞癌细胞中STAT3信号的持续性激活并抑制肿瘤细胞的增殖。     

NQO1生物活性药物β-Lapachone抑制皮肤鳞状细胞癌A431增殖、诱导周期阻滞及ROS生成

目的 探讨NQO1蛋白在皮肤鳞状细胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma, CSCC）组织中的表达及β-Lapachone在CSCC中的抗肿瘤作用。方法 采用免疫组化法检测76例CSCC组织和13例正常皮肤组织中NQO1的表达;分析NQO1表达与CSCC临床病理特征的关系;体外常规培养A431细胞,通过克隆形成、流式细胞术及免疫荧光染色法检测β-Lapachone对细胞增殖、周期进程以及活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成的作用,并通过Western blot检测相关分子和信号通路。结果 免疫组化：NQO1蛋白在CSCC中的阳性率（85.5%,65/76）高于正常皮肤组织（46.2%,6/13,P<0.05）。χ²检验：NQO1蛋白表达与肿瘤大小有关（P<0.05）,与患者年龄、性别、分化和临床分期均无相关性。MTT和克隆形成实验：β-Lapachone可抑制A431细胞的增殖能力。流式细胞术检测：β-Lapachone诱导A431细胞发生周期阻滞。β-Lapachone可促进细胞生成...     

lncRNA COLCA1/miR-423-5p/FAM172A分子轴对皮肤鳞状细胞癌A431细胞的增殖和迁移的影响

目的 探讨长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)COLCA1在皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,CSCC)组织中的表达及其对细胞增殖和迁移的影响、分子机制.方法 采用qRT-PCR法检测COLCA1在正常皮肤组织和CSCC组...     

miR-194-5p靶向TSPAN1基因对皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡及侵袭的影响

目的:本研究旨在探究miR-194-5p靶向TSPAN1基因对人皮肤鳞状细胞癌(CSCC)细胞增殖、凋亡和侵袭的影响.方法:收集癌组织和癌旁正常皮肤组织,检测组织中TSPAN1和miR-194-5p的表达.双荧光素酶报告实验证实miR-194-5p与TSPAN1的靶向关系.取正常皮肤细胞作为Normal组,CSCC细胞...     

miRNA-25对人食管鳞状细胞癌细胞株TE1增殖的影响

目的:探讨过表达/沉默微小RNA-25(microRNA-25,miRNA-25)对人食管鳞状细胞癌细胞株TE1增殖能力的影响及其作用机制。方法:RT-PCR检测各临床样品组织中miRNA-25的表达水平。建立miRNA-25过表达/沉默的TE1细胞株,采用CCK-8法、Brd U实验和流式细胞术检测TE1细胞增殖能力的变化及细胞周期状态;Western blot法和RT-PCR法检测细胞周期调控因子细胞周期蛋白E1(cyclin E1)和细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)的蛋白与mRNA表达水平。结果:miRNA-25在食管黏膜组织中具有特异性表达并在TE1细胞中呈高表达。CCK-8法和Brd U实验结果显示过表达miRNA-25的TE1细胞的增殖能力显著增加(P0.05),而沉默miRNA-25抑制TE1细胞的增殖;流式细胞术检测结果显示过表达miRNA-25可明显促进TE1细胞从G0/G1期向S期转换,沉默miRNA-25则抑制其转换。同时Western blot和RT-PCR实验结果显示过表达miRNA-25后,cyclin E1和CDK2的蛋白和mRNA表达水平均显著增加(P0.05),沉默miRNA-25后则显著减少(P0.05)。结论:miRNA-25能够促进人食管鳞状细胞癌细胞株TE1的增殖,其作用机制可能与促进细胞周期转换及上调cyclin E1和CDK2的表达水平有关,提示miRNA-25可作为治疗食管鳞状细胞癌的一个潜在靶点。     

汉黄芩素对人口腔鳞状细胞癌细胞生长和侵袭的影响

目的:探讨汉黄芩素对人口腔鳞状细胞癌SCC-4细胞生长和侵袭的影响及其作用机制。方法:使用不同浓度(0、20、40、60、80和100 mg/L)的汉黄芩素处理SCC-4细胞不同时间,分别用MTT法检测细胞活力,流式细胞术及Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡,Transwell小室检测细胞侵袭能力,Western blot法检测Wnt/β-catenin信号通路的活化。结果:汉黄芩素呈剂量及时间依赖性地抑制细胞生长,同时诱导细胞大量凋亡,抑制细胞的侵袭。汉黄芩素明显抑制了细胞中β-catenin的活化,同时其下游靶分子细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和MMP-9的表达水平降低,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达增加。用Wnt/β-catenin通路激动剂Li Cl处理后,汉黄芩素抑制的Wnt/β-catenin通路分子活化明显增强,同时细胞生长能力明显增强,而凋亡能力降低,还明显减弱了汉黄芩素对细胞侵袭能力的抑制作用。结论:汉黄芩素主要通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来调控口腔鳞状细胞癌细胞的生长及侵袭进程,具有一定的抗口腔鳞状细胞癌发展的作用,可成为临床上口腔鳞状细胞癌防治的潜在药物。     

RhoC基因沉默对口腔鳞状细胞癌迁移和侵袭的影响

目的：分析RhoC对口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞迁移和侵袭能力的影响及其潜在机制。方法：利用UALCAN和K-M plotter在线数据库预测分析RhoC在OSCC中的表达及其与病理分期分生存率的关系,并结合IHC实验检测OSCC组织中RhoC的表达水平。按照人RhoC基因构建两条小干扰RNA(siRNA)并将细胞进行实验分组。RT-qPCR检测转染后各组细胞RhoC的mRNA表达水平,Western blot法分析实验分组细胞中RhoC、FAK、MAPK、p-FAK、p-MAPK、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9蛋白表达;此外,比较各实验分组细胞的穿膜细胞数和划痕愈合面积分析细胞的侵袭和迁移活动。最终通过构建裸鼠肺转移模型对上述实验进行验证。结果：RhoC在OSCC中高表达,并和病理分期和病理分级等关联性大。RhoC的mRNA和蛋白相对表达量在OSCC中增高（P<0.01）;RT-qPCR及Western blot结果显示,敲减RhoC表达后,RhoC的mRNA和蛋白表达水平显著下降（P<0.01）,Western blot结果显示p-FAK、p-MAPK、M...     

基因Hath1表达对结肠癌细胞的抑制作用

目的研究Hath1基因对结肠癌细胞体外增殖的抑制作用。方法用trizol试剂提取肿瘤细胞总RNA,定量逆转录PCR法检测Hath1在结肠癌细胞和正常组织细胞中的表达;MTS和流式细胞仪法分别检测Hath1在结肠癌细胞中的增殖率和凋亡百分率;构建IEC-6稳定表达Hath1siRNA细胞系,检测Hath1siRNA对IEC-6细胞生长的影响。结果在正常人的小肠与结肠组织及大鼠小肠上皮细胞IEC-6中有着比较高水平的Hath1的表达,而在4株结肠癌细胞中Hath1的表达都很低。在表达Hath1的4株结肠癌细胞SW480、HT29、LS174T、SW620中,其细胞增殖率分别被抑制了38.5%、23.4%、55%、35.6%。在LS174T细胞中Hath1不能有效地诱导肿瘤细胞发生凋亡,但是可以显著地提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。siRNA干扰试验进一步证明了Hath1起到肿瘤抑制基因的作用。结论 Hath1不能有效地诱导肿瘤细胞发生凋亡,但是可以显著地提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。     

靶向VEGF的shRNA对皮肤鳞癌A431细胞的作用

 目的 构建靶向VEGF的shRNA（psilencer-VEGF1-shRNA,VEGF-s1;psilencer-VEGF2-shRNA,VEGF-s2）干预皮肤鳞癌细胞（A431）的一系列生物学行为,探讨VEGF-s1和VEGF-s2干预作用的意义。方法 构建psVEGF-shRNA真核表达质粒干预体外培养的A431细胞, 同时构建含随机靶序列的阴性对照表达质粒(psilencer-Target-off-shrank,T-off)。RT-QPCR,western blot 和ELISA检测细胞内VEGFmRNA和蛋白表达水平的变化;CCK-8法检测细胞活性;流式细胞仪检测癌细胞增殖周期细胞百分比与细胞凋亡;划痕试验和Transwell小室试验别检测癌细胞二维和三维空间的迁移能力;FN黏附试验检测癌细胞的黏附潜能。结果 A431细胞转染psVEGF-shrank后活性降低,细胞周期发生阻滞,与对照组相比细胞在G1期比率显著增加(P<0.05),在S期比率明显降低,细胞调亡增加(均P<0.05),细胞内VEGFmRNA和蛋白表达水平下降,细胞迁移和黏附潜能均受到抑制。结论 VEGF是人皮肤鳞癌细胞生长相关的重要基因,干扰VEGF基因能有效抑制人皮肤鳞癌细胞的生物学行为。     

应用siRNA抑制K562细胞中c-Myc基因的表达

目的利用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制白血病细胞系K562细胞中c鄄Myc基因的表达,为研究c鄄Myc基因在K562细胞中的作用提供一个新的方法。方法设计c鄄Myc基因特异性小分子干扰RNA,用体外转录方法合成c鄄Myc基因的小分子干扰RNA并转染K562细胞,培养48h后,收集细胞,应用实时荧光定量RT鄄PCR和westernblot方法检测转染细胞中c鄄Myc基因mRNA水平和蛋白表达量的变化,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性。结果转染siRNA后,与对照组相比,实验组c鄄MycmRNA水平和蛋白表达量明显降低,抑制率分别为82.16%和74.0%,MTT法表明实验组的增殖速率明显低于对照组的增殖速率。结论在K562细胞中存在RNA干扰的机制,特异性siRNA能够有效的抑制c鄄Myc基因的表达,为研究c鄄Myc基因在肿瘤细胞中的调节途径提供了一个新的方法。     

NET-1蛋白表达与肝癌临床病理因素相关性探讨

NET-1属于四次跨膜蛋白（TM4S）家族成员,其有显著上调癌形成的作用。我们在研究人体组织中NET-1表达及分析肝与肝癌组织中NET-1表达差异的基础上,通过基因生物工程的方法制备NET-1多克隆抗体,用免疫组织化学方法检测肝癌中NET-1蛋白表达,探讨其临床病理因素的关系。     

靶向APRIL基因小干扰RNA对鼠肠癌细胞生长与迁移能力的影响

目的 制备并筛选靶向鼠结直肠癌细胞株CT-26增殖诱导配体(APRIL)基因小干扰RNA(siRNA),通过检测APRIL siRNA抑制肠癌细胞生长及迁移等指标,为体内递送APRIL siRNA靶向治疗小鼠结直肠癌原位模型奠定基础.方法 分别设计、合成4种不同位点的APRIL siRNA,同时以合成无序序列作为阴性对照,再用LipofectAMINE 2000转染高表达APRIL的鼠结直肠癌细胞株CT-26,荧光显微镜下计数评价6-FAM标记的APRIL siRNA转染效率与筛选转染浓度;FQ-RT-PCR检测APRIL mRNA水平,Western印迹分析APRIL蛋白表达,筛选沉默效率最高的APRIL siRNA片段;细胞损伤修复法检测APRIL siRNA抑制肠癌细胞迁移的能力;CCK-8(cell counting kit-8)法检测细胞增殖情况;RT-PCR检测基质金属蛋白酶MMP-2及TIMP-1 mRNA水平.结果 4种不同siRNA瞬时转染CT-26细胞后APRIL mRNA和蛋白表达有明显差别(P＜0.05).APRIL siRNA组与对照组相比,细胞生长与迁移能力明显减弱(P＜0.05),MMP-2及TIMP-1 mRNA水平均有显著性差别(P＜0.05).结论 成功筛选靶向鼠结肠癌细胞株CT-26增殖诱导配体APRIL siRNA,其中APsi737敲低效率可达到90%.靶向APRIL基因小干扰RNA可有效降低肠癌细胞的生长与转移能力,可能与MMP-2及TIMP-1的调节有关.可用于后续的靶向治疗结直肠癌研究.

Abstract：

Objective To construct and screen siRNA targeting a proliferation-inducing ligand (APRIL) gene in a mouse colorectal cancer celline, CT-26. To investigate the effects to the cell growth and migrant capacity of CT-26 after knockdown APRIL gene, lay the foundation for molecular targeted therapy to colorectal cancer. Methods Four pairs of APRIL siRNA were designed and chemically synthesized. And disorder sequences were synthesized as a negative control. These sequences were transfected with LipofectAMINE 2000 into CT-26 cells, which high-expressed APRIL gene. The transfection efficency rate of 6-FAM labelled control siRNA was detected by fluorescence microscope. The inhibition effectiveness of APRIL mRNA and protein was analyzed by FQ-RT-PCR and Western blot, respectively. Cell proliferation activity was analyzed by cell counting kit-8, cell migration capacity was detected by the repair of cell damage, and MMP-2 together with TIMP-1, two important regulatory genes in cell metastasis, were measured by RT-PCR.Results The different kinds of APRIL siRNA effectively suppressed the level of APRIL mRNA and the protein expression in CT-26 (P ＜ 0.05 ). Cell proliferation and metastasis ability were repressed after APRIL siRNA transfection( P ＜ 0.05 ), compared with random siRNA control and nontransfected control. The mRNA levels of MMP-2 and TIMP-1 genes wre significantly altered among APRIL siRNA groups and two control groups ( P ＜ 0.05). Conclusion We have constructed and screened a kind of siRNA (APsi737) targeting APRIL gene in a mouse colorectal cancer cell line, CT-26. APRIL siRNA can effectively inhibit the cell growth and migration capacity, maybe be regulated by MMP-2 and TIMP-1.     

大蒜素对人皮肤基底细胞癌A431细胞的放疗增敏作用研究

目的 探讨大蒜素(Allicin)是否能增加人皮肤基底细胞癌A431细胞的放疗敏感性及其作用机制.方法 MTT法检测Allicin对A431细胞的生长抑制率,筛选出半数抑制浓度(IC50);将细胞分为对照组、照射组(IR组)、Allicin组和IR+Allicin组.采用流式细胞仪检细胞自噬水平.结果 MTT结果显示大蒜素作用A431细胞24、48、72 h后IC50分别为35.47、18.64、6.56 mmol/L(F =22.54、18.94和21.63,P＜0.05).和对照组相比,Allicin组和Allicin+ IR组A431细胞的自噬水平均增加(F=30.15、28.36,P＜0.05),以Allicin+ IR组升高最显著.结论 Allicin通过上调人皮肤基底细胞癌A431细胞的自噬水平来增加其放疗敏感性.     

外源性FHIT基因对人皮肤癌细胞系A431细胞增殖与凋亡的影响

目的 研究脆性组氨酸三联体基因(FHIT)对皮肤癌细胞株A431增殖与凋亡作用的影响，探讨FHIT基因在皮肤肿瘤发生发展中的作用。方法 脂质体介导的质粒pcDNA3-FHIT转染到有FHIT基因表达异常的皮肤癌细胞株A431，用G418 对转染后细胞进行筛选，获得G418 抗性的细胞用免疫细胞化学方法进行FHIT基因表达鉴定。用MTT法、克隆形成试验及流式细胞仪观察转染前后细胞生长特性的变化。结果 转染FHIT基因的A431细胞FHIT蛋白表达阳性,其增殖活性减弱、克隆形成能力降低、凋亡率增加,且与对照组差异均有统计学意义。结论 导入外源性FHIT基因可以抑制皮肤肿瘤细胞A431的增殖,诱导细胞凋亡。     

Association of NET-1 gene expression with human hepatocellular carcinoma

NET-1 is a member of the NET-x family. To explore the potential role of NET-1 in hepatocellular carcinoma (HCC), the expression of NET-1 and the relationship with HCC were examined for the first time. We found that NET-1 was frequently expressed in HCC and the peritumor tissue. The relative amounts of NET-1 mRNA in HCC and peritumor tissue were 0.645 +/- 0.37 and 0.466 +/- 0.30, respectively, indicating a higher expression level in HCC than in the peritumor (P < .05). NET-1 protein is usually located on the cell membrane and in the cytoplasm of HCC cells. NET-1 immunoreactivity was found in 126 out of 130 samples of HCC tissue (96.92%). An association of NET-1 expression with cytological variants, histopathological grading, and clinical stages of HCC was also found (P < .05). Detection of NET-1 gene expression in liver biopsy may provide useful information about the biological behavior of HCC.     

siRNA沉默Musashi-1基因表达对人HCT116结肠癌细胞生物学行为的影响

目的探讨表达载体介导小干扰RNA（siRNA）对人HCT116结肠癌细胞Musashi-1基因表达的抑制作用,揭示其对结肠癌细胞生物学行为的影响。方法构建靶向Musashi-1的siRNA质粒表达载体,在脂质体介导下转染HCT116细胞,实时定量PCR检测Musashi-1 mRNA表达水平,MTF法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期状况。结果DNA测序证实2条Mu-sashi-1 siRNA表达载体构建成功,与对照组相比均可有效抑制Musashi-1的表达,细胞增殖能力显著降低。结论Musashi-1的siR-NA质粒表达载体可以有效地阻断HCT116结肠癌细胞Musashi-1的mRNA表达从而抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

穿心莲内酯对人皮肤基底细胞癌A431细胞生长、凋亡及增值细胞核抗原蛋白表达的影响

目的 探讨穿心莲内酯（AD）对人皮肤基底细胞癌A431细胞生长、凋亡及增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达的影响。方法 应用酸性磷酸酶（APA）法检测细胞增殖抑制率,荧光显微镜观察细胞形态,Annexin V-FITC/PI双染法、流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率, Rh123染色FCM检测细胞线粒体膜电位,免疫细胞化学法检测细胞PCNA蛋白表达。结果AD呈时间、剂量依赖性抑制A431细胞生长增殖;且同一时间点50mg/L、100mg/L AD组与溶媒对照组相比差异显著（P＜0.05）。AD组作用A431细胞24h时,部分细胞核染色质出现典型凋亡形态学改变。不同浓度AD作用A431细胞24h,早期凋亡率、晚期凋亡及坏死率均随AD浓度升高而逐渐增加,且50mg/L、100mg/L AD组与溶媒对照组相比差异显著（P＜0.05）。AD作用A431 24h细胞内PCNA蛋白随AD浓度升高表达逐渐减少。AD作用A431细胞24h后,线粒体膜电位下降明显,与溶媒对照组相比较,50mg/L、100mg/L AD组差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 AD可明显抑制A431细胞生长增殖,其抑制细胞增殖可能与下调PCNA蛋白表达有关。AD能诱导A431细胞凋亡,其凋亡机制可能与细胞线粒体膜电位下降有关。