人脐带间充质干细胞体外培养的生物学特性研究

目的建立人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)体外培养的方法,探讨该方法培养的脐带间充质干细胞特性及分化潜能。方法用新取的脐带制成细胞悬液,放入含10%胎牛血清的DMEM/F-12混合培养基培养,动态观察原代培养细胞的生长过程。取生长状态良好的第三代细胞(P3),MTT检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测表面标志物CD29、CD44、CD31、CD45、CD34,鉴定hUC-MSCs;诱导hUC-MSCs分化成为脂肪细胞,鉴定所分离的hUC-MSCs具有多向分化能力。结果来源于人脐带培养的MSCs呈现梭形生长,经流式细胞仪检测示CD29(98.3%)、CD44(99.2%)阳性,CD34(0.3%)、CD31(0.8%)、CD45(0.4%)阴性,经过诱导分化,证实hUC-MSCs有成脂分化潜能。结论采自脐带标本分离培养可获得稳定、均质性良好的hMSCs,并具有多向分化能力。     

人早期胚胎间充质干细胞的定位和体外初步分离培养

目的:从早期入胚分离培养人早期胚胎间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC),并初步鉴定其生物学特性.方法:取4～6周胚龄的人胚,用免疫组织化学法,结合特定抗体SH-2,对MSC在人胚中的分布进行定位,分离组织进行培养.免疫组化和流式细胞术检测MSC的相对特异性抗原SH-2、CD44、OCT-4、S-100、CD34、α-smooth-actin在分离培养细胞中的表达.结果:在胚胎的四肢、躯体部紧邻神经管的下方(不包括原肠等内脏部位)有大量的MSC分布.分离培养可得到成纤维状的MSC,贴壁生长,有生长优势,可多次传代并保持MSC生物学特性不变.结论:通过机械分离和胰酶消化的方法,可从早期人胚得到MSC.利用MSC的贴壁生长特性及生长优势,经4～5次传代后可得到纯度很高的MSC.     

人嗅黏膜间充质干细胞的生物学特性

目的：观察及研究人嗅黏膜间充质干细胞的生物学特性。方法：分离、培养、鉴定人嗅黏膜间充质干细 胞,在透射电子显微镜、扫描电子显微镜下观察其超微结构,并在体外诱导其向脂细胞、骨细胞、神经干细胞球和神 经元分化。结果：人嗅黏膜间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列,高表达表面标志CD73和CD90,不表 达CD34和CD45;在扫描电子显微镜下可见细胞表面有短而粗的微绒毛突起,在透射电子显微镜下可见到两种不同的 细胞形态;具有成脂、成骨、成神经元干细胞球和神经元分化的能力。结论：人嗅黏膜间充质干细胞具有间充质干细 胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能,可作为组织工程修复的理想的种子细胞。     

人羊膜间充质细胞的分离培养及其生物学特性探讨

目的：对人羊膜间充质细胞（hAMC）的分离培养及其生物学特性进行探讨。方法：取38～40周孕妇剖腹产术后羊膜,用多种酶消化分离提纯hAMC ,观察其体外生长的特征和形态学;用免疫细胞化学方法检测hAMC的神经及肝脏发生相关蛋白的表达;同时探讨其致瘤性。结果：从羊膜中分离出高纯度hAMC ,并摸索出其最适合的培养条件;细胞成细长梭形或星形,胞质丰富,细胞核呈圆形,1～3个核仁,易贴壁,生长繁殖快,在体外可连续培养10代以上。免疫细胞化学结果显示：神经发生相关蛋白（Musashi‐1、Nestin、Vimentin）阳性以及肝脏发生相关蛋白[Flt‐1、In‐tegrinβ1、HNF（3β、4α、1α）、C／EBPα、Albumin、AAT ]等阳性;主要组织相容性复合体Ⅱ（Human M HC Class Ⅱ）阴性,主要组织相容性复合体Ⅰ（Human M HC Class Ⅰ）弱阳性;癌化实验显示hAMC无致瘤性。结论：羊膜中分离提纯的hAMC为一种具备多分化潜能的干细胞,至少可分化为神经及肝脏细胞。hAMC具有低免疫源性、无致瘤性等特点,为再生医学研究提供新的细胞来源。     

人脐带华通胶间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

目的 研究由脐带华通胶组织(Wharton's jelly)在体外分离、培养、扩增获得脐带间充质干细胞(umbilical cord derived mesenchymal stem cells,以下简称UC MSCs)的方法,并进行UC- MSCs的各项鉴定.方法 脐带华通胶组织采用胶原酶以及胰酶序贯消化法分离得到UC-MSCs,用流式细胞仪分析其表型特征,向成骨、成脂以及成神经元细胞诱导分化并鉴定.结果 由人脐带华通胶可以有效获得间充质干细胞.原代细胞培养24～48 h内细胞开始贴壁生长,5～7 d左右可以传代培养,在2～3周时间内可以迅速扩增至107到108数量级.各项分化鉴定试验证实UC-MSCs具有多向分化潜能,能分化成骨、成脂细胞以及神经元细胞.UC-MSCs在体外培养传至20～30代仍保持稳定的细胞表面标记.结论 由人脐带华通胶可以有效地获得间充质干细胞,这种UC-MSCs能在体外长期传代培养,生物学特性稳定,具有多向分化的潜能,是今后细胞治疗很有前景的种子细胞.     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学特性的研究

目的研究人骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养条件,并探讨其生物学特性。方法取无恶性血液病的32~65岁的成人骨髓7例,经密度梯度离心得到单个核细胞,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液,将细胞的密度调整到1×106个/mL,接种到12孔培养板中(1 mL/孔)进行培养,48 h后更换新鲜培养液,以后每3 d换液1次。当细胞铺满培养板底90%以上时,按常规方法进行细胞传代培养。用流式细胞术检测培养细胞的CD29、CD44、CD166、CD105、CD34、CD45、HLA-DR表达情况。并且使用脂肪细胞诱导培养液诱导培养MSCs,油红O染色检测其能否被诱导分化为脂肪细胞。结果成人骨髓接种后24 h内细胞开始聚集成细胞集落,并从集落中长出少许长梭形细胞,6~15 d细胞进入快速增殖期,一般培养20~25 d后细胞汇合成片铺满培养板底;而传代培养的细胞每代约需10~15 d即可铺满瓶底。流式细胞术检测结果显示,此次培养的骨髓来源细胞高表达CD29、CD44、CD166、CD105,不表达CD34、CD45、HLA-DR,符合骨髓MSCs细胞的特性。油红O染色显示MSCs可以被诱导分化为脂肪细胞。结论用密度为1.077 g/mL淋巴细胞分离液作为分离液,密度梯度离心法分离培养的人骨髓MSCs增殖力强,操作简单,是一种较好的分离和培养MSCs的方法。MSCs可以被诱导分化为脂肪细胞。     

人间充质干细胞体外成骨诱导培养及其生物学特性变化

目的　确定人间充质干细胞 (MSCS)体外扩增培养、向成骨细胞表型转化的方法 ,了解其生物学特性变化。方法　分离人骨髓细胞 ,按不同种植密度、首次换液时间进行原代培养 ,对传代培养细胞用化学药物或生长因子进行成骨诱导培养 ,并检测成骨细胞表型、生长曲线、贴壁率。结果　人MSCS 原代培养种植细胞密度为 1× 10 5～ 3× 10 5/cm2 ,48h后半量换液 ,以后每 3d全量换液的方法较合理。经化学药物 (如地塞米松、β 甘油磷酸、维生素C)或生长因子 (rh BMP2 、BMPS)作用后 ,MSCS 表达碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和骨钙素 ,细胞增殖速度减慢 ,贴壁率略降低。未诱导MSCS 形成细胞团后 ,可自动分化表达碱性磷酸酶活性。结论　合理的人MSCS 培养方法及可靠的诱导条件 ,可为体外构建组织工程化骨提供自体种子细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及其生物学特性研究

目的建立体外分离培养人骨髓间充质干细胞(Human Bone-marrow Mesenchymal Stem Cells,hBMSCs)的方法,建立稳定的hBMSCs体外扩增体系。方法采用密度梯度离心法分离、培养hBMSCs,流式细胞仪检测hBMSCs表型、细胞周期、绘制生长曲线。结果在体外培养条件下,hBMSCs贴壁生长,为成纤维细胞样,CD34/CD45阴性、生长曲线呈S型。结论采用密度梯度离心法获得的hBMSCs纯度较高,形态单一,生长稳定、增殖能力较强,具有独特的生物学特征。     

人脐带间充质干细胞的体外分离、培养及诱导分化

目的:体外分离、纯化及培养人脐带间充质干细胞(MSCs),并观察其生物学特性.方法:将剔除动静脉的新鲜人脐带组织切成小块培养,得到贴壁细胞,倒置显微镜观察细胞形态,绘制第1、5及10代细胞生长曲线;流式细胞仪测定细胞表面标记(CD13、CD44、CD14、CD34与HLA-DR);化学染色(油红O、茜素红染色)及RT-PCR检测其体外诱导成脂和成骨分化的能力;RT-PCR检测胚胎十细胞特异性标志基因OCT-4.结果:体外培养4～6 d后,有细胞从组织块中游出;细胞传代培养达10代后无明显的形态和增殖能力改变.培养细胞表达CD13与CD44,但CD14、CD34及HLA-DR呈阴性表达.体外诱导实验证实,该细胞具有成脂和成骨分化的能力.RT-PCR显示其表达OCT-4基因.结论:人脐带MSCs能在体外培养、扩增并且具有和骨髓MSCs类似的生物学特性,可作为组织工程种子细胞来源.     

人胚胎干细胞向类间充质干细胞的诱导分化及鉴定

目的 建立诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化的方法,并鉴定细胞的生物学特性.方法 人胚胎干细胞在无血清条件下悬浮培养形成类胚体,10 d后在含血清条件下使类胚体贴壁生长,5～6 d后机械法剔除类胚体中心区高密度重叠细胞,保留周边铺展细胞并传代扩增.观察诱导分化与传代扩增后细胞的形态学变化;免疫荧光染色和流式细胞术进行细胞表型分析.取第5代细胞进行成脂、成骨和成软骨诱导,3～4周后运用特殊染色及RT-PCT技术检测细胞成脂、成骨及成软骨分化能力.结果 诱导分化后细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的形态,扩增能力较强,多次扩增传代后细胞形态和增殖能力无明显改变.免疫荧光染色发现细胞表达中胚层标志波型蛋白(vimentin).流式细胞术分析显示,细胞表达CD29、CD105、CD166等间充质干细胞表面标志.特殊染色及RT-PCT检测结果显示,成脂诱导后多数细胞油红染色阳性,脂蛋白酶和leptin表达增加;成骨诱导后细胞茜素红染色阳性,碱性磷酸酶和Cbfa-1表达增加;成软骨诱导后细胞Ⅱ型胶原染色阳性,Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达增强.结论 成功诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化.分化获得的细胞增殖能力强,表达间充质干细胞的特异性标志,并具有多向分化潜能.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分化特性

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞体外分化特性.方法:用密度为1.073 kg/L的细胞分离液分离骨髓间充质干细胞.取第3代培养细胞用含0.1 μmoL/L地塞米松、10mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C的成骨细胞分化培养液培养.于培养7,14 d取细胞爬片做改良的Gomori钙钴法碱性磷酸酶染色,21 d做Von Kassa染色;脂肪细胞分化培养用含10 mg/L胰岛素、1 μmol/L地塞米松、0.25 mmol/L1-甲基-3-异丁基黄嘌呤和100 μmol/L吲哚美辛的培养液诱导培养,于诱导3,7 d取细胞爬片做油红0染色.用含1mmol/L β-巯基乙醇和150 mL/L FBS的DMEM培养基先预诱导分化24 h.再用含有5 mmol/L β-巯基乙醇的DMEM无血清培养基诱导分化5 h.做神经元特异性烯醇化酶、角质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白免疫组化染色.结果:在加入成骨细胞分化培养液后7和14 d钙钴法碱性磷酸酶染色阳性细胞百分率分别为11.5%和37.5%.21 d的细胞爬片Von Kassa染色显示钙盐沉积.在脂肪细胞诱导3和7 d分别得到22%和90.33%油红O染色阳性细胞.5 h神经细胞诱导分化后NSE免疫组化染色阳性率为33%,NF-200阳性细胞率为37.5%,GFAP染色阴性.结论:骨髓间充质干细胞在体外可定向加药诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞.     

人羊水源性间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的 体外分离培养人羊水间充质干细胞(HAFMSCs),观察生物学特性,并鉴定其多向分化能力.方法 采用改良两步法分离培养HAFMSCs,用MTT法观察细胞增殖能力.FACS检测表面抗原CD29,CD34,CD44,CD45,CD73,CD90,HLA-ABC,HLA-DR等的表达.RT-PCR法分析细胞中OCT-4,Nanog mRNA水平的表达.用成脂、成骨、内皮细胞培养基对HAFMSCs进行诱导,并分别采用油红O,Yon Kossa染色及细胞免疫荧光染色检测其分化能力.结果 羊水细胞于2-3d开始贴壁,10-15d形成细胞集落.传至第3代HAFMSCs呈旋涡状排列,生长曲线呈S形.FACS检测显示CD29,CD44,CD73,CD90,HLA-ABC表达阳性,CD34,CD45,HLA-DR表达阴性,RT-PCR法检测显示HAFMSCs中OCT-4、Nanog mRNA的表达阳性.成脂、成骨诱导21d后油红O、Von Kossa染色阳性,成内皮细胞诱导4周后细胞免疫荧光染色检测vWF抗体表达阳性.结论 成功分离培养出HAFMSCs,细胞具有干细胞特征,具有多向分化潜能.     

体外诱导人骨髓间质干细胞分化为肝细胞样细胞

目的:探讨人骨髓间质干细胞(MSCs)在体外特定条件下是否可以转化为肝细胞样细胞.方法:分离培养人骨髓间质干细胞,采用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)及CCl4损伤的小鼠肝脏共培养等诱导方式,在不同时间点分别用RT-PCR和荧光定量PCR检测肝细胞特异性基因的表达,免疫组织化学染色检测肝细胞标志. 结果: 在HGF和bFGF诱导第7天时甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP)、细胞角蛋白18(cytokeratin-18, CK18)和色氨酸2,3-双加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase,TDO)基因表达阳性,CK18和TDO的表达随诱导时间延长增高;第7天诱导细胞组织化学染色AFP、白蛋白(ALB)、肝细胞核因子(hepatocyte nuclear factor,HNF)、肝细胞特异性抗原(HSA)和CK18表达阳性.与损伤小鼠肝组织共培养21 d后细胞表达AFP和TDO.结论:HGF和bFGF联合诱导以及与CCl4损伤肝组织共培养的方法可体外促进人MSCs分化为肝细胞样细胞,可为肝脏疾病或肝损伤的干细胞治疗提供细胞来源.     

人胎盘来源间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征比较

目的:从人足月的胎盘羊膜中和Wistar 大鼠股骨及胫骨骨髓中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,研究人胎盘来源MSCs（HPMSCs）和大鼠骨髓来源MSCs（BMSCs）的分离培养方法和生物学特征、表面标志及其多分化潜能。方法:将人足月胎盘组织通过胶原酶Ⅱ消化培养获取HPMSCs,采用全骨髓贴壁法从4周龄Wistar大鼠双侧股骨及胫骨中分离、纯化大鼠BMSCs,运用活细胞计数法检测其增殖能力,采用流式细胞术检测2种细胞表面标志物的表阳性率;
用地塞米松、维生素C和β磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,用茜素红染色鉴定;用胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,以油红O染色鉴定。结果:HPMSCs为梭形贴壁细胞,增殖能力较强,CD44和CD34表达阳性率分别为94.45%和1.67%;BMSCs为圆形、梭形和多角形,增殖能力强,CD44和CD34表达阳性率分别为93.11%和2.68%。2种细胞经过成脂诱导液和成骨诱导液诱导后,茜素红和油红O染色结果均为阳性,表明2种细胞均可向脂肪细胞和成骨细胞分化。结论:HPMSCs与大鼠BMSCs的生物学特征相似,同样具有多分化潜能,HPMSCs具有更强的增殖能力。     

人胎儿骨髓间充质干细胞体外向类肝细胞诱导分化条件的优化

目的 :建立和优化骨髓间充质干细胞 (marrowmesen chymalstemcells,MMSCs)向类肝细胞诱导分化的条件及分化过程观察、鉴定 .方法 :采用体外分离培养的MMSCs为研究对象 ,设计不同的诱导分化条件进行体外诱导 ,观察细胞诱导分化过程中形态结构变化及细胞生物学特性 ,应用免疫组化检测肝细胞标志ALB和CK18的表达 ,建立人胎儿MMSCs向类肝细胞分化的优化条件 .结果 :未进行诱导的对照组细胞保持长梭型 ,形状因子 4 .5± 1.0 ,面积较小 ,增生较快 ,呈典型成纤维细胞的漩涡状或火焰状生长 ,培养后期可见 5～ 7个分支 ,无细胞变圆 ,双核细胞率小于 0 .1% ,逐渐老化 ,颗粒增多 .组化染色未见表达ALB和CK18.所有诱导组细胞在培养中细胞分支均减少 ,多为 1～ 3个分支 ,未用基质的细胞仍保持长梭形生长 ,给予基质的诱导细胞部分形态由长变圆 ,形状因子下降 ,给予 5 氮胞苷 (5 azacitidine,AZA)预处理可抑制细胞过度增生 ,细胞形态由长梭型逐渐变短 ,PDGF BB预处理对细胞增生无明显抑制作用 ,细胞容易出现分支 .诱导各组组化染色显示 ,第 2 1日时均有ALB和CK18阳性表达 .诱导 2组～诱导 5组的细胞转圆率、双核细胞比率及ALB ,CK18阳性细胞比例均显著高于对照组及诱导 1组 (P <0 .0 5 ) .结论 :在无血清培养条件下 ,     

慢病毒转染人骨髓间质干细胞研究

目的:分离培养人骨髓来源间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)并进行慢病毒载体介导的基因转染研究。方法:采取全骨髓贴壁培养法分离培养人骨髓MSCs。利用脂质体法进行慢病毒感染人骨髓MSCs。结果:分离培养出人骨髓来源的MSCs,并用携带绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的慢病毒成功感染人骨髓MSCs。结论:获得人骨髓MSCs并进行慢病毒载体介导的基因修饰,为间质干细胞基因工程和组织工程研究奠定了基础。     

成人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的体外研究

目的 探索成人骨髓间充质干细胞在体外定向分化为神经元样细胞的条件。方法 采用Ficoll-paque(1．077g／m1)分离液密度梯度离心从人的骨髓分离出骨髓间充质干细胞，体外扩增到第10代，选择4组不同组合的神经分化诱导条件，分别诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化，通过免疫细胞化学鉴定诱导后细胞神经元烯醇化酶、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白的表达情况。结果各组诱导剂诱导后，骨髓间充质干细胞分化为具有典型的神经元形态的细胞，免疫细胞化学显示、NF-M呈强阳性反应，NSE表达强度提高，在最佳的分化条件下，即加入bFGF、ATRA、BME、BHA、DMSO诱导条件下，大约80％细胞表达NF—M，86％的细胞为NSE强阳性。结论 成人MSCs在体外可定向诱导分化为神经元样细胞，且具有较高的阳性分化率。