短发夹RNA靶向抑制suvivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达

目的构建表达靶向抑制survivin基因的三个短发夹结构(shRNA)的RNA干扰载体,使其在胶质瘤细胞发挥干扰效应。方法在survivin全长序列中选取设计3条19个核苷酸靶序列,2条反向重复序列,间以9个核苷酸的茎环序列,加上对应酶切位点,形成3条shRNA的DNA模板,分别克隆到3个干扰载体pG1,pG2和pG3上：采用分布酶切连接的方法,分别将U6启动子以及下游的后2个shRNA模板酶切下来,依次连接到pG1对应酶切位点,构建出含有3条shRNA模板且能独立编码shRNA的重组干扰载体pGenesil-survivin,测序鉴定：将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251,分别采用RT-PCR以及Western Bloting从mRNA和蛋白水平检测干扰后效果。结果重组的干扰载体含有3条正确的shRNA模板；RT-PCR以及Western Blotting检测显示,survivin的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制。结论编码3条shRNA的干扰载体pGenesil-survivin介导的RNA干扰技术(RNAi)可以显著的靶向抑制survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达。     

RNA干涉MSP58基因抑制神经胶质瘤细胞U251增值和侵袭性研究

目的MSP58是一种能够通过调节基因的转录和翻译水平来改变细胞恶性表型的癌基因，其蛋白的分子量大小为58kDa。但截止目前，其在肿瘤发生及发展中所起的作用仍不是十分清楚。我们通过构建MSP58基因的干涉表达载体，下调MSP58基因在人脑胶质瘤细胞系U251中的表达以揭示其在胶质瘤增殖、迁移和侵袭中所起的作用。方法将特异性的MSP58干涉表达载体pSilencer3．1-MSP58转染人脑胶质瘤细胞系U251，同时构建相应的阴性对照载体pSilencer3．1-NC以及空载体pSilencer3．1-H1neo。运用半定量RT-PCR及Westernblot的方法检测稳定转染和未转染干涉载体的胶质瘤细胞的MSP58的mRNA和蛋白的表达水平。运用MTT法测定胶质瘤细胞的增殖水平。流式细胞仪检测细胞周期变化以及单层细胞划痕试验和侵袭小室试验检测胶质瘤细胞的迁移及侵袭能力变化。结果成功建立了三种稳定转染细胞株：分别是具有稳定下调MSP58基因表达的U251-S细胞，阴性对照U251-NC细胞以及含有空载体的u251．H1neo细胞。干涉组细胞的MSP58的表达水平无论在mRNA水平还是在蛋白水平均较阴性对照组及空载体组细胞显著降低。其表达抑制率分别为62．7％和60．3％。干涉组细胞的增殖能力明显降低。同时在细胞周期方面，干涉组细胞与阴性对照组及空载体组细胞相比，发生了显著的G1期阻滞。细胞迁移及侵袭试验结果显示，MSP58干涉组的细胞较其他对照组细胞的迁移及侵袭能力均受到明显抑制。结论通过RNA干涉的方法下调MSP58基因的mRNA和蛋白的表达，不但可以明显的抑制人脑胶质瘤细胞的增殖，并且可以显著的抑制胶质瘤细胞的迁移及侵袭能力。因此，靶向性MSP58基因RNAi介导的胶质瘤基因治疗具有良好的应用前景。     

RNA干涉CD44基因抑制脑胶质瘤细胞U251的增殖与侵袭性研究

目的通过合成靶向分化抗原簇44(CD44)基因的siRNA片段,下调CD44在脑胶质瘤细胞U251中的表达,揭示其在胶质瘤增殖、迁移和侵袭中所起的作用。方法根据CD44基因序列设计并合成的siRNA片段转染U251细胞,利用荧光实时定量(qRT-PCR)检测细胞中CD44基因mRNA水平的变化;蛋白印迹实验(Western blot)检测CD44基因蛋白水平的变化;四甲基偶氮唑蓝染色(methyhhiazolyl tetrazolium,MTT)法检测U251细胞增殖;单细胞划痕愈合实验、Transwell小室侵袭实验检测U251细胞的迁移与侵袭能力变化。结果体外合成的CD44-siRNA能有效抑制U251细胞中CD44基因在mRNA水平与蛋白水平的表达(P0.05),并抑制细胞的增殖(P0.05)和迁移侵袭能力(P0.05)。结论 CD44-siRNA能够有效抑制U251脑胶质瘤细胞的增殖及其迁移侵袭力,为以CD44为靶点的肿瘤基因治疗奠定了基础。     

RNA干扰敲低Wnt2的表达抑制U251细胞生长的体内外研究

目的 在体内外研究转染靶向Wnt2的siRNA对U251细胞的抑制效果.方法 向U251细胞转染靶向Wnt2的siRNA后,免疫印记检测转染后Wnt2及相关蛋白表达,MTT检测细胞增殖,annexin标记细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期分布,鼠尾胶3D生长实验检测细胞侵袭能力的变化.建立裸鼠胶质瘤皮下动物模型,瘤内注射Wnt2 siRNA观察肿瘤生长情况.结果 转染Wnt2siRNA后,U251细胞的Wnt2、frizzled2、磷酸化GSK-3β、β-catenin等表达降低,细胞增殖受抑,凋亡率升高,细胞阻滞于G0/G1期.体内研究发现转染靶向Wnt2的siRNA后,裸鼠皮下肿瘤的生长速度缓慢,相应的蛋白表达降低.结论 转染靶向Wnt2的siRNA可有效敲低该基因在U251细胞内的表达,从而抑制了胶质瘤细胞生长,具有潜在的治疗前景.     

稳定整合靶向性Survivin基因RNA干涉载体胶质瘤细胞系的建立

目的构建针对细胞凋亡抑制蛋白survivin（SVV）基因的特异性RNA干涉载体,并建立稳定转染该干涉载体的人胶质瘤细胞系。方法设计合成针对SVV基因和针对荧火虫荧光素酶（FLF）基因特异性RNA干涉片断,并分别克隆入pSilencer3．1-H1neo载体中,成功构建SVV基因RNA干涉载体pSilencer3．1-SVV和无关序列载体pSilencer3．1-FLF。RNA干涉载体、无关序列载体和空白载体经脂质体法转染胶质瘤细胞系U251,经G418筛选,采用实时定量反转录聚合酶链反应（real—timeRT—PCR）、免疫蛋白印迹（Western blot）和免疫细胞化学方法分别检测SVV基因在转染细胞中的表达情况。结果酶切鉴定和核苷酸序列分析证实,成功构建了SVV基因RNA干涉载体pSilencer3．1-SVV。获得了稳定转染干涉载体、无关序列载体和空白载体的细胞系分别命名为U251-S、U251-F和U251-P。U251-S细胞中SVV的mRNA和蛋白表达受到明显抑制,U251-F和U251-P细胞中SVV基因表达水平无明显变化。结论SVV基因特异性RNA干涉载体能够明显抑制SVV基因在U251细胞中的表达,这为进一步研究SVV在胶质瘤细胞系U251中的生物学功能和作用机制奠定了实验基础。     

反义AKT2 RNA抑制U251胶质瘤细胞生长的体内外研究

目的 研究反义AKT2RNA对U251人脑胶质瘤细胞在体内外的生长抑制效用。方法 将逆转录病毒pLXSN为载体的反义AKT2构建体转染U251人脑胶质瘤细胞系，应用蛋白印记确定基因转染前后AKT2的表达水平。流式细胞法与Matrigel基质生长实验评价肿瘤细胞转染前后的增殖活性。进一步应用裸鼠皮下荷瘤模型观察脂质体介导pLXSN、pLXSN-AS-AKT2基因治疗对U251细胞生长抑制作用。在28d的观察期内定期测量皮下肿瘤体积，对肿瘤标本应用免疫组化的方法进行AKT2和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达比较。结果 脂质体介导pLXSN-AS-AKT2可显著抑制U251细胞AKT2表达。与对照组和pLXSN转染组比较，细胞周期分析结果表明AK—AKT2转染组进入S期的细胞数减少了8．5％～8．9％，而进入G0＋G1期细胞则增加了7．9％～8．6％。Matrigel基质生长实验显示对照组和pLXSN转染组细胞呈正常形态贴壁生长，而AS～AKT2转染组细胞不能贴壁生长，呈团块状簇集生长。裸鼠皮下荷瘤模型实验显示pLXSN-AS-AKT2显著抑制皮下肿瘤生长，组织病理学分析显示AS-AKT2转染组AKT2表达下降而GFAP表达上调。结论 体内外实验证明反义AKT2方法在抗胶质瘤增殖方面作用重要，AKT2可作为基因治疗胶质瘤的优选靶标。     

靶向表皮生长因子受体的shRNA抑制U251胶质瘤生长的实验研究

目的探讨靶向表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的RNA干涉(RNAi)技术抑制恶性胶质瘤体外细胞系U251的EGFR表达后,在体内外对U251细胞生长抑制作用。方法在人EGFR开放阅读框的细胞内区酪氨酸激酶结构域选择1个siRNA靶序列、进行短发夹RNA(shRNA)表达载体psiRNA-2400的构建,并以含有随机序列的psiRNA-scr表达质粒为对照进行了脂质体介导的U251人脑恶性胶质瘤细胞系表达。应用RT-PCR检测EGFR表达水平,应用MTT法、流式细胞术和Matrigel基质生长实验评价肿瘤细胞转染前后的生物学行为。进一步应用裸鼠皮下荷瘤模型观察脂质体介导shRNA基因治疗对U251细胞生长抑制作用。对肿瘤组织应用免疫组化的方法进行EGFR、PCNA和GFAP表达比较。结果脂质体介导、靶向EGFR的shRNA可显著抑制U251细胞ECFR表达,MTT法分析显示psiRNA-2400转染组细胞生长抑制率为68%;与对照组和psiRNA-scr转染组比较,细胞周期分析结果表明psiRNA-2400转染组G_0～G_1期细胞数没有明显变化,进入S期的细胞数较对照组减少了12.7%～13%,而进入G_2期细胞则增加了10.5%～11.7%。Matrigel基质生长实验显示对照组和psiRNA-scr转染组细胞呈正常形态贴壁生长,而psiRNA-2400转染组细胞不能贴壁生长,呈团块状簇集生长。裸鼠皮下荷瘤模型实验显示psiRNA-2400显著抑制皮下肿瘤生长,组织病理学分析显示治疗组EGFR表达下降、PCNA标记指数降低而GFAP表达上调。结论靶向EGFR的RNAi技术可以显著抑制U251细胞的EGFR表达,在体内外对U251细胞生长均产生明显抑制作用。因此,shRNA表达质粒介导的基因治疗可以成为胶质瘤靶向性EGFR治疗的新策略。     

Livin基因短发卡RNA表达质粒的构建及其对胶质瘤Livin基因表达的影响

目的构建凋亡抑制基因livin基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体,并观察其在人脑胶质瘤细胞中对livin基因表达的抑制。方法设计有小发夹结构的2条livinβ siRNA对应的DNA序列,将其克隆入pSliencer 3.1质粒,构建重组质粒pSliencer-livinβ,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。以脂质体法将pSliencer-livinβ转染人胶质瘤细胞。采用RT-PCR和Western-blot检测Livinβ蛋白的表达,筛选最有效的一组pSliencer-livinβ质粒。结果酶切及测序证实质粒pSliencer-livinβ构建成功。转染后胶质瘤细胞livinβmRNA和蛋白表达均受到明显抑制。结论成功构建livinβ基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体能够显著抑制人胶质瘤细胞livinβ基因的表达。     

RNA干扰技术联合抑制AKT1和COX-2表达对U251胶质瘤细胞增殖的影响

目的 探讨应用RNA干扰(RNAi)技术抑制U251恶性胶质瘤细胞株AKT1和COX-2表达后,在体外对U251细胞增殖的抑制作用.方法 构建靶向AKT1和COX-2的RNAi重组腺病毒表达载体(rAd-A+C)转染至U251细胞.应用Realtime PCR检测AKT1和COX-2 mRNA水平的变化;应用Western blot检测AKT1和COX-2蛋白水平的变化,并对肿瘤细胞中相关功能蛋白的表达进行分析;应用MTr法和流式细胞术评价肿瘤细胞的增殖活性.结果 rAd-A+C可显著抑制U251细胞AKT1和COX-2的表达;与对照组和无义序列处理组(rAd-HK)比较,Western blot分析结果显示下游相关因子PCNA、Cyclin D1表达下降,而p53表达上调;细胞周期分析结果表明rAd-A+C处理组进入S期的细胞数较对照组减少了7.0%～7.8%,出现G0/G1期阻滞;MTT法分析显示rAd-A+C处理组细胞生长抑制率＞58%.结论 靶向AKT1和COX-2的RNAi技术可显著抑制U251细胞AKT1和COX-2表达,在体外对U251细胞增殖活性产生明显抑制作用.因此,RNAi重组腺病毒表达载体介导的基因治疗可成为胶质瘤靶向治疗的新策略.     

RNA干涉技术在胶质瘤基因治疗研究中的进展

RNA干涉(RNA interfernce,RNAi)机理为利用双链RNA(dsRNA)特异性地降解相应序列的mRNA成为siRNA,从而特异性地阻断靶基因的表达,最近对其在应用于胶质瘤基因治疗方面的研究也有进展。本文介绍了RNA干扰的分子机制、技术应用及在胶质瘤基因治疗方面的进展和广阔的发展前景。     

RNAi对U251细胞c-Met基因表达水平的影响

目的 探讨RAN干扰作用对人脑胶质瘤U251细胞c-Met基因表达的影响。方法 设计3对以c-Met为靶基因短发夹RNA片段,pGenesil-1质粒为载体,构建pGenesil-1/c-Met-shRNA重组质粒,将其转染人脑胶质瘤U251细胞。采用PCR和免疫印迹法分别检测c-Met基因mRNA和蛋白的表达水平。结果 成功构建pGenesil-1-c-Met shRNA重组质粒,并转染至U251细胞。转染重组质粒的U251细胞c-Met基因mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。结论 RNA干扰能明显降低U251细胞c-Met基因mRNA和蛋白的表达水平。     

miR-203靶向抑制survivin影响胶质瘤细胞的生长和增殖

目的 探讨miR - 203靶向抑制survivin对人胶质瘤细胞株U251生长和增殖的影响.方法 利用生物信息学预测miR -203靶基因;通过脂质体将miR - 203模拟物或表达质粒转染至U251细胞,使用Real - time PCR和Western blot检测靶基因survivin的mRNA和蛋白水平,采用双荧光素酶报告基因系统进行功能验证,应用细胞生长曲线、MTT实验、流式细胞术评价细胞生长、增殖和凋亡的变化及对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和塞来昔布的敏感性.结果 TargetScan预测发现survivin是miR - 203的靶基因;转染miR - 203模拟物或表达质粒后,Real - time PCR与Western blot结果分别提示survivin的mRNA和蛋白水平下调(P＜0.05);双荧光素酶报告分析技术证实抗凋亡基因survivin为miR - 203的直接靶点;细胞生长曲线结果显示miR - 203组的生长速度明显受抑(P＜0.05);MTT实验表明miR - 203组的增殖能力减弱(P＜0.05)及药物敏感性增加;流式细胞术结果示miR -203组的凋亡比例明显升高(P＜0.01).结论 miR - 203在胶质瘤细胞中能靶向抑制survivin的表达,是一个抗增殖、促凋亡的miRNA,有可能作为今后胶质瘤干预治疗的新靶点.     

小发夹RNA抑制Nogo基因表达促进脊髓损伤修复的实验研究

目的 利用RNA干涉（RNAi）技术使特定的基因（Nogo）沉默，探索脊髓损伤的治疗方法。方法 设计有小发夹结构的两条DNA序列，PCR扩增带有U6启动子的小发夹，腺病毒包装重组体，转染少突胶质细胞，采用Westernblot法分析Nogo-66的蛋白表达水平。结果成功地构建了靶向Nogo基因RNAi的带有U6启动子的小发夹重组体，Nogo-66蛋白表达水平明显下降。结论 靶向RNAi小发夹重组体经腺病毒包装后，成功转染少突胶质细胞并能有效抑制Nogo-66基因的表达。     

海参皂苷抑制人脑胶质母细胞瘤U251细胞生长实验研究

目的研究一种新型海参皂苷fuscocineroside A对人脑胶质母细胞瘤U251细胞的生长抑制作用及其机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法绘制细胞生长曲线;用Hoechst33342荧光染色、末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法（TUNEL）及流式细胞仪检测分析U251细胞凋亡;并通过Western blot检测细胞内survivin蛋白表达情况。结果Fuscocineroside A能显著抑制U251细胞的生长,诱导其凋亡,下调survivin的表达,呈浓度及时间依赖性,而对正常胶质细胞并没有明显抑制作用。结论Fuscocineroside A能诱导U251细胞凋亡,这种作用可能与survivin的表达下调有关。     

靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选

背景：已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮细胞生长因子基因的表达。尚未见关于RNA干扰血管内皮生长因子抑制胆囊癌肿瘤的相关研究。 目的：创新性构建编码胆囊癌血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA 质粒表达载体,筛选出沉默血管内皮生长因子基因效果最明显的短发夹样RNA表达质粒。 设计、时间及地点：基因工程观察实验,于2008/2009在中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成。 材料：人胆囊癌细胞株GBC-SD购于同济大学肿瘤研究所。 方法：设计4对针对血管内皮生长因子基因不同位点的短发夹样RNA片段, 构建携带此短发夹样RNA片段的表达质粒(短发夹样RNA1~4)并行酶切鉴定分析。然后通过脂质体将重组质粒转染到胆囊癌细胞株GBC-SD中,48 h后测定转染率。 主要观察指标：重组质粒酶切鉴定结果。转染效率。采用及荧光PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达。 结果：成功构建了靶向血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA 质粒表达载体, 其中抑制效果最为明显的短发夹样RNA 质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2 质粒。重组质粒经酶切鉴定证实构建成功。质粒在GBC-SD细胞中的转染率约为58.6%。短发夹样RNA抑制血管内皮生长因子基因的mRNA表达,短发夹样RNA2抑制率最高,可达86%。 结论：成功构建并筛选出的靶向血管内皮生长因子的短发夹样RNA表达质粒,其对胆囊癌GBC-SD细胞内的血管内皮生长因子表达具有明显抑制作用。短发夹样RNA2表达质粒抑制作用最明显。     

siRNA对人脑胶质瘤细胞Survivin基因表达的影响

目的 探讨siRNA敲除Survivin基因的可行性,并观察其对人脑胶质瘤细胞凋亡的影响.方法 采用人工合成的小干扰RNA(siRNA)体外阻抑人脑胶质瘤细胞T98和SF767 Survivin基因的表达,即时定量PCR方法检测Survivin mRNA表达水平,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 Survivin siRNA转染后24 h,T98、SF767细胞中Survivin mRNA表达水平同阴性对照相比下调分别达92.6%、89.5%,48 h后表达量则下降了 80.1%、67.6%.T98细胞在干扰后24、48 h平均凋亡率分别达50.2%、38.4%,SF767分别达40.1%、25.6%,同阴性对照相比差异有统计学意义(P＜0.01).结论 针对Survivin的siRNA Oligo能有效抑制Survivin基因的表达,并诱导细胞凋亡,为RNA干扰技术用于胶质瘤的临床治疗打下了基础.

Abstract：

Objective This study was to investigate the feasibility ofknockdown of Survivin gene with small interfering RNA and to observe the apoptosis in gliomas which was influenced by siRNA.Methods Survivin specific siRNA oligonucleotides were designed and synthesized artificially.This siRNA were transfected into human glioma cells T98 and SF767 to inhibit the expression of Survivin RNA in vitro.The mRNA level of Survivin was detected by real- time quantitative polymerase chain reaction (PCR) and the apoptosis of cells was assayed by flow cytometry (FCM).Methods The expression of Survivin mRNA in siRNA- transfected samples decreased by 92.6% and 89.5% in T98,SF767 cells respectively in 24 hours after transfected with siRNA oligos.The expression amount was declined by 80.1% and 67.6% in 48 hours after RNAi.The apoptosis rate of T98 cells was 50.2% in 24 hours after interfere,and was 38.4% in 48 hours.The apoptosis rate of SF757 cells were 40.1% and 25.6% respectively.There was a significant difference between the RNAi cells and negative controls(P ＜0.01 ).ConclusionThe specific siRNA oligo which was aim to Survivin could knockdown the expression of Survivin mRNA,and induce apoptosis in human glioma cells.The experiment had made the foundation of the clinical RNA interfering technique.     

No prognostic impact of survivin expression in glioblastoma

Survivin is a member of a novel protein family of inhibitors of apoptosis, and also plays a role as a potent regulator of mitosis. In semiquantitative Western blot analysis of glioblastomas, survivin expression was shown to be a prognostically significant factor. In the present study we investigated the immunohistochemical expression of survivin and its prognostic impact in a large glioblastoma series comprising 104 consecutive adult patients undergoing a first operation for glioblastoma. We analyzed survivin, Ki-67, and topoisomerase-II-alpha expression in paraffin-embedded tissue, and correlated patient age, Karnofsky performance score, vascular pattern and survivin-, Ki-67-, topoisomerase-II-alpha-, and apoptotic indices with patient outcome using univariate and multivariate survival analysis. Survivin was expressed in all glioblastoma samples, and was prominent in a fraction of nuclei of tumor cells and vascular cells. Further, survivin labeled spindle- and chromosomal material of mitotic figures. Faint cytoplasmic expression was also seen. The survivin index showed significant correlation with Ki-67 and Topo-II-alpha indices. On average, 58.85% of Ki-67 and 91.08% of survivin-expressing nuclei co-expressed Ki-67 and survivin. The survivin index did not correlate significantly with overall survival, whereas patient age, Karnofsky performance score, vascular pattern, and Ki-67 and topoisomerase-II-alpha indices were associated with patient outcome. In summary, in glioblastoma, survivin is expressed predominantly in proliferating tumor cell nuclei. In contrast to Ki-67 and topoisomerase-II-alpha, survivin expression does not influence patient outcome. So, in contrast to Ki-67, survivin does not seem to be useful as prognostic factor in the clinical setting.