DNA TYPING SYSTEM FOR HLA-A2 ALLELES BY POLYMERASE CHAIN REACTION WITH SEQUENCE-SPECIFIC PRIMERS

Objectivs. To establish a PCR-SSP method for discriminating as many HLA-A 02 alleles, which could easilybe introduced into a routine laboratory. Methods. In this study we typed HLA-A 02 polymorphisms by a sequence-specific primer (SSP) method,which involved round 1 and round 2 PCR reactions to detect 17 HLA-A 02 alleles (they are HLA-A 0201- 0217 alleles) covering exon 2 and exon 3. Results. We have fmmd that DNA sample concentration and purity were the most important variables in determin-ing the quality of the results. For identiffing correct band size, the size marker used was important. We noticed that different PCR machines pedormed differently. By this method, we detected 20 HLA-A 02 positive genomic DNA samples and found 4 kinds of HLA-A 02 alleles. They were HLA-A 0201, 0203, 0206 and 0210. Condusion. The HLA-A 02 PCR-SSP method was proven to be a reliable and easily applicable typing method. Our results suggest that the SSP described here provides an optimal HLA-A 02 typing technique that may be useful in selecting donor-recipient pairs in bone marrow transplantation between unrelated individuals.     

PCR-SSP快速HLA-DR基因分型法的建立及临床初步应用

采用序列特异性引物聚合酶链反应（ＰＣＲＳＳＰ）方法，对２２份国际标准细胞株ＤＮＡ及２３例临床血标本ＤＮＡ进行ＨＬＡＤＲ基因分型，扩增条件为９４℃，３０ｓ，５８℃，３０ｓ共３０个循环，对各个标准ＤＮＡ的分型结果显示，符合率为１００％，无假阳性及假阴性，提示本方法快速、准确，适合于临床应用     

PCR-SSP方法作HLA-DR亚区的基因分型

采用序列特异性引物－聚合酶链反应（ＰＣＲＳＳＰ）技术对ＨＬＡＤＲ亚区进行基因分型。使用鉴定ＤＲ１～ＤＲｗ１８的序列特异性引物和阳性对照引物，双盲检测了２２例已知ＤＲ血清型的标本，二者完全一致。并对未知血清型的标本作ＤＲ基因分型。本法具有较高分辨度、高特异性和简便快速的特点，为临床器官组织移植配型、疾病相关性分析、法医鉴定和人类学研究提供了新的技术方法     

顺序特异引物聚合酶链反应技术HLA－DR1，DR51组的基因快速分型

采用快速基因分型技术对人类白细胞抗原（ＨＬＡ）－ＤＲ１、ＤＲ５１组准确分型，为临床选择理想配型的供受者提供依据。根据核苷酸序列合成系列特异引物，借助ＰＣＲ技术，建立顺序特异引物聚合酶链反应方法（ＰＣＲ－ＳＳＰ）快速基因分型方法，对６９例肾移植供受者ＨＬＡ－ＤＲ１、ＤＲ１５、ＤＲ１６和ＤＲ１０分型，同时与血清学方法对比研究。分型结果采用限制性内切酶分析和寡核苷酸探针杂交证实。结果：６９例供受者ＨＬＡ－ＤＲ１、ＤＲ５１组ＰＣＲ－ＳＳＰ分型均获成功，无假阳性和假阴性，总耗时５ｈ，分型结果经酶切分析和探针杂交证实符合。血清学分型耗时２４ｈ，误差率达３２．４％。结论：ＰＣＲ－ＳＳＰ用于ＨＬＡ－ＤＲ１、ＤＲ５１组基因分型，具有快速、精确的特点，适合于临床应用。     

HLA-DR快速基因分型PCR-SSP方法的建立

目的：探讨应用于器官移植配型及疾病相关性分析的方法及基本数据,建立一种高分辨率、高特异性、简单、快速、方便的ＨＬＡＤＲ基因分析方法。方法：利用ＤＲ１～ＤＲ１８序列特异性引物及１对内对照引物,采用序列特异性引物聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓ,ＰＣＰＳＳＰ）技术对２２份国际标准细胞株ＤＮＡ及２０例未知ＤＲ型别的临床血液标本进行ＨＬＡＤＲ基因分析,扩增条件为：变性９４℃,６０ｓ;退火６５℃,６０ｓ;延伸７２℃,６０ｓ。２５个循环后,７２℃保温７ｍｉｎ。结果：对各个标准ＤＮＡ的分型结果显示,准确率及重复率均为１００％,无假阳性及假阴性。结论：该方法快速、简便、灵敏、重复性好,结果易于判断,适合临床器官移植组织配型、疾病相关性分析、法医鉴定及人类学研究等。     

液氮冻存人T淋巴细胞用于HLA 血清定型试验:方法的改进

报告我室参照Terasaki 实验室用液氮冻存人外周血T淋巴细胞方法的改进及其效果。冻存11—14个月后仍可进行HLA—A、B、C血清定型试验。     

家族性肥厚型心肌病家系的HLA分型及其临床意义探讨

家族性肥厚型心肌病是常染色体显性遣传病，该文报导家族性肥厚型心肌病（ＦＨＣ）３个家系，并对３个家系中全部成员进行ＨＬＡＤＱＡ１－ＤＱＢ１基因分型，确定其以ＤＱＡ１－ＤＱＢ１单倍型。结果显示３个家系中，每个家系的第Ⅱ代所有患病同胞与第Ⅰ代表病双亲间共有一个相同的ＤＱＡ１－ＤＱＢ１单倍型，而第Ⅱ代未患病同胞则不带有这个单倍型。     

SPECIFIC UP-REGULATION OF DNA POLYMERASE BY HUMAN PAPILLOMAVIRUS 16

Obje, etive To analyze how the infection of human papillomavirus 16 （ HPV16 ） affects expression of DNA poly- merase β（DNA polB） with the aim of probing the mechanism of over-expression of DNA polB in human cancers. Methods Four fragments of human DNA polB promoter were amplified and constructed into luciferase reporter vec- tor pGL-Basic, generating pGL-BP, pGL-BMH, pGL-BMS, and pGL-BAT constructs respectively, and co-transfected with HPV16 or HPV6 into Hep2 cells. Luciferase activity was assayed 48 hours after transfectiorL Semi-quantitative RT- PCR was used to measure mRNA expression of endogenous DNA polB. Immunohistochemistry and in situ hybridization were used to analyze DNA polB expression and HPV16 or HPV6 infection in 38 cases of cervical lesions respectively. Results With co-transfection of HPV16 and DNA polB promoter-driving reporters into Hep2 cells, pGL-BP re- porter in full-length DNA polB promoter presented markedly elevated luciferase activities （ P 〈 0.05 ）. However, the other three mutant reporters： pGL-BMH, pGL-BMS, and pGL-BAT, generated no reporting activities in the presence of HPV16 （P 〉0.05 ）. On the contrary, all of polB promoter reporters were little stimulated in co-transfection of HPV6 （P 〉0.05 ）. The transfection of HPV16 could enhance the endogenous polB mRNA expression compared with that of HPV6 （3.42 vs. 0.80, P 〈0.05）. The DNA polB expression was found in 8 of 10 HPV16-positive cervical intraepi- thelial neoplasia grade Ⅲ（ CIN Ⅲ） cases, while was only found in 3 of 11 HPV6-positive condyloma accuminatum cases, but was negative in all chronic cervicitis cases. The correlation of DNA polB expression with HPV16 infection in cervical lesions was significant （ P 〈0.05 ）. Conclusions HPV16 is able to specifically stimulate the expression of DNA polB in human epithelial cells through interaction with the core upstream regulatory sequences of DNA polB promoter. Over-expression of DNA polB might be an explanation for the molecular mechani     

基因释放剂制备结核杆菌热休克蛋白70(hsp70)DNA模板与传统制备方法比较

目的:比较常规试剂盒和使用基因释放剂提取结核杆菌热休克蛋白70(hsp70)DNA模板的质量,为进一步获得目的基因优化方案.方法:提取结核杆菌DNA阶段,分别使用常规试剂盒和基因释放剂,然后采用相同的PCR方案进行扩增,溴化乙锭染色,紫外光下观察目的基因扩增效果.结果:常规试剂盒提取结核杆菌DNA,未能扩增出相应的目的基因;而使用基因释放剂,则扩增效果良好.结论:常规试剂盒相比,基因释放剂在提取结核杆菌DNA时,能够制备良好的模板,为PCR扩增目的基因奠定基础.     

酵母质粒PCR扩增及酶切在酵母双杂交中的运用

目的:减少对初步筛选获得的阳性克隆进一步鉴定的工作量,防止阳性克隆的丢失.方法:提取酵母双杂交筛选cDNA表达文库获得的阳性克隆酵母细胞质粒,以文库载体插入片段两端特异序列为引物,PCR扩增插入片段,限制性核酸内切酶酶切扩增产物,琼脂糖凝胶电泳,根据带型对阳性克隆进行分类.结果:将初步获得的107株阳性克隆,分为24类,在PCR扩增过程中发现个别克隆含有两种以上的文库质粒.结论:酵母质粒PCR扩增,酶切分类的方法,不仅可以大大减轻阳性克隆进一步鉴定的工作量,避免不必要的浪费,而且还可以避免阳性克隆的丢失.     

从石蜡包埋和甲醛浸泡组织中提取DNA进行PCR扩增

对石蜡色埋组织用二甲苯或水浴法脱石蜡,乙醇进行梯度水化,溶液A裂解细胞,对经抽提、纯化后的DNA进行PCR扩增,获得了较满意的效果。同时对石蜡包埋组织与甲醛浸泡组织中的DNA受损程度进行了比较,此工作为能使肿瘤等症病将在基因水平上进行回顾性分析提供了一个良好开端.     

乙型病毒性肝炎的基因诊断

对１２０例乙肝病毒（ＨＢＶ）感染者血清中ＨＢＶ－ＤＮＡ用ＰＣＲ技术进行检测，结果表明，ＰＣＲ法的敏感性阳性检出率７５．８％，明显高于ＥＬＩＳＡ法（ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ和ＨＢＣＡｂ）的阳性率分别为６１％、３８％和６２％）；ＰＣＲ检测ＨＢｓＡｇ和ＨＢＡｂ一血清的ＨＢＶ－ＤＮＡ，阳性率分别为２６％、５２％和２４％，ＰＣＲ检测三者均为阳性血清的ＨＢＶ－ＤＮＡ，阳性率为１００％慢性迁延肝炎、慢性活动性肝炎     

PCR检测乙肝病人肝组织和血中HBVDNA

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）结合地高辛素标记的乙肝病毒ＤＮＡ探针（ＨＢＶＤＮＡ－Ｄｉｇ）杂交技术检测了４９份乙型肝炎患者的肝组织标本和４６份血清标本中的ＨＢＶＤＮＡ。结果表明：ＰＣＲ检出乙肝病人肝组织和血清中ＨＢＶＤＮＡ阳性率比斑点杂交高（Ｐ＜０．０５）。在２１例同时检测了肝组织和血清中ＨＢＶＤＮＡ的病人中，肝组织ＨＢＶＤＮＡ阳性率为５７．１％（１２／２１）；血清阳性率为６１．３％（１３／２１）；两者总阳性率为８０．９％（１７／２１），说明用ＰＣＲ同时检测肝组织和血中ＨＢＶＤＮＡ，可明显提高ＨＢＶＤＮＡ的检出率。     

干化学分析仪测尿比重方法探讨

目的：探讨干化学分析仪检测尿比重结果是否可靠。方法：使用CLINITEK200型尿液分析仪及配套Multistix尿试带Miditron尿液分析仪及配套Combur-10尿试带和折射仪法同步对100例尿液标本进行检测对比分析，同时，用上述三种仪器进行比重液测定。结果：对100例尿液标本分别用于化学法及折射仪检测尿比重的结果差异显著（P＜0．05），折射仪与比重计所测得的比重结果无显著性差异（P＞0．05），结论：干化学尿液分析仪测定尿比重误差大，建议使用折射法。     

定量PCR检测乙肝患者HBV-DNA及其意义

目的 :了解乙肝患者E抗原阳性和抗 -HBe阳性血清的HBV -DNA含量和血清ALT水平之间的关系。方法 :临床标本经ELISA测定后 ,分为HBeAg(+) /HBeAb(- ) ,HBeAg(- ) /HBeAb(+)血清。采用BIO -RADiCyclerPCR定量技术 ,测定HBV -DNA使用全自动生化分析仪测定血清ALT水平。结果HBeAg(+) /HBeAb(- )血清 85例 ,HBV -DNA平均含量为 (4 .4 2± 3.2 3)× 10 7;HBeAg(- ) /HBeAb(+) 12 8例 ,HBV -DNA平均含量为 (8.32± 6 .4 4 )× 10 4。两组具显著差异。轻度慢型乙肝 2 9例 ,HBV -DNA平均含量为 (5 .92± 4 .0 1)× 10 7,中度 19例 ,HBV -DNA平均含量为 (1.2 9± 0 .72 )× 10 6,重度 2 5例 ,HBV -DNA平均含量为 (4 .4 3± 2 .4 1)× 10 3 ,轻重度组间HBV -DNA平均含量有显著差异 (P <0 .0 5 ) ,血清ALT水平与HBV-DNA含量无明显关系。结论 :多数抗 -HBE阳性患者HBV仍持续复制 ,血清病毒量低于HBeAg(+)者 ,慢乙肝病变程度与HBV -DNA平均拷贝数。     

ELISA检测脐血中巨细胞病毒IgM抗体诊断先天性巨细胞病毒感染的探讨

作者用直接和间接ELISA方法,对成都市6所医院初生婴儿582例的脐应进行了巨细胞病毒(CMV)IgM抗体检测。结果:两种方法检出CMV IgM抗体阳性者共27扮,阳性率4.6％,其中用直接ELISA检测,阳性者25份,间接ELISA阳性者为15份。前者明显优于后者(P<0.05),表明其敏感性高,特异性强。CMV IgM抗体阳性儿临床随访至5～6月龄,2例听力异常,1例眼底可疑异常。     

慢性乙型肝炎病人外周血单个核细胞HBV DNA的PCR检测

①目的 探讨慢性乙型肝炎病人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ和血清ＨＢＶＤＮＡ的感染情况及其临床意义。②方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术对１２８例慢性乙型肝炎病人和２０例健康人进行了ＰＢＭＣ及血清中ＨＢＶＤＮＡ检测。③结果 慢性乙型肝炎病人ＰＢＭＣ中ＨＢＶ ＤＮＡ的感染率为６４．２％,和血清ＨＢＶＤＮＡ的感染率具有一致性倾向（Ｘ＾２－０．６３,Ｐ〉０．０５）,慢性肝病病     

定量PCR检测慢性肝病患者血清HBV DNA含量及其临床意义

目的 :探讨慢性肝病患者血清 HBV DNA含量与乙肝标志物 (HBVM)和肝损害程度的关系。方法 :分别用定量聚合酶链反应 (PCR)法和酶标法 (EL ISA)检测 2 0 7例乙型肝炎病毒慢性感染者血清 HBV DNA含量与乙肝病毒血清标记物(HBVM)。结果 :HBs Ag(+) ,HBe Ag(+) ,抗 - HBc(+)患者血清 HBV DNA含量 (10 7.4 0 70± 2 .3830 拷贝 / m l)显著高于 HBs Ag(+) ,抗 - HBe(+) ,抗 - HBc(+)患者的含量 (10 5.1 2 51± 3.4 797拷贝 / ml) (P <0 .0 0 1) ;不同临床类型 HBV感染者 HBV DNA含量 :慢性肝炎轻、中、重度 ,肝炎后肝硬化 ,慢性重症肝炎 5组间无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 :HBV DNA含量与 HBe Ag密切相关 ;HBV DNA复制水平与慢性肝病的病期无明显关系     

EB病毒转化HLA标准抗原B细胞株的建立及鉴定

本文报导应用EB病毒转化技术,建立7株人B淋巴母细胞样细胞株,其中4株为HLA标准抗原B细胞株。经免疫荧光染色及生物化学分析鉴定,所有细胞株均表达及合成HLAⅠ类和Ⅱ类抗原,可供HLA抗血清筛选及其它研究应用。     

应用DNA体外PCR扩增技术对地贫症进行产前基因诊断

应用基因工程技术中最新的方法—DNA体外PCR扩增技术,对4例正常人和4例地贫患者的胎儿绒毛DNA中的α和β珠蛋白基因片段进行扩增成功,并对一例Hb Bart’s水肿胎儿进行了基因诊断。本法最大优点为迅速、灵敏、简便,且不需同位素标记探针,适用于边远地区进行地贫症产前基因诊断。