硫化砷对急性早幼粒白血病细胞PNAS-2基因表达的影响

目的探讨硫化砷诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞凋亡的分子机制.方法应用基因表达谱芯片、RT PCR技术,检测硫化砷作用前后NB4细胞、APL原代细胞PNAS-2基因表达的变化.结果基因表达谱芯片杂交显示,硫化砷作用于NB4细胞后,PNAS-2基因表达下调;RT PCR结果发现,NB4细胞在硫化砷作用后PNAS-2表达有明显下调,并呈时间依赖性;APL原代细胞经硫化砷作用后,PNAS-2表达也呈下降趋势.结论硫化砷能够下调PNAS-2基因在NB4细胞株和APL原代细胞中的表达,推测PNAS-2基因可能是硫化砷治疗APL的靶基因之一.     

凋亡相关基因PNAS-2参与硫化砷抗APL细胞的研究

目的探讨凋亡相关基因PNAS-2在硫化砷抗急性早幼粒细胞白血病(APL)中的作用。方法应用基因表达谱芯片检测NB4细胞在10mg／L硫化砷作用前后的基因表达改变，RT-PCR方法验证基因表达谱芯片结果和检测白血病原代细胞中PNAS-2基因的表达情况。结果10mg／L硫化砷作用后的NB4细胞中，PNAS-2基因表达特异性下调，且呈时间依赖性，类似变化在K562和U937细胞中未见；10mg／L硫化砷作用后2例M2患者的原代细胞PNAS-2基因表达明显下调，1例M4患者原代细胞该基因表达未见明显改变。结论PNAS-2基因可能是硫化砷抗APL的靶基因之一。     

凋亡相关基因PNAS-2参与硫化砷抗APL细胞的研究

目的探讨凋亡相关基因PNAS-2在硫化砷抗急性早幼粒细胞白血病(APL)中的作用.方法应用基因表达谱芯片检测NB4细胞在10 mg/L硫化砷作用前后的基因表达改变,RT-PCR方法验证基因表达谱芯片结果和检测白血病原代细胞中PNAS-2基因的表达情况.结果10 mg/L硫化砷作用后的NB4细胞中,PNAS-2基因表达特异性下调,且呈时间依赖性,类似变化在K562和U937细胞中未见;10 mg/L硫化砷作用后2例M3患者的原代细胞PNAS-2基因表达明显下调,1例M4患者原代细胞该基因表达未见明显改变.结论PNAS-2基因可能是硫化砷抗APL的靶基因之一.     

四硫化四砷诱导急性早幼粒细胞凋亡的机制

目的:研究四硫化四砷在抗急性早幼粒细胞白血病中诱导细胞凋亡的分子机制.方法:应用cDNA微矩阵技术检测四硫化四砷作用前后NB4细胞基因表达图谱.筛选出有差异表达的与细胞凋亡相关蛋白类基因,合成相应的引物,用RT-PCR方法检测口服四硫化四砷的急性早幼粒细胞白血病(APL)患者缓解前后外周血细胞凋亡相关蛋白类基因的表达,分析四硫化四砷诱导早幼粒细胞凋亡的途径.结果:通过基因微矩阵技术分析发现,四硫化四砷作用NB4细胞有差异表达的细胞凋亡相关蛋白类基因包括编码凋亡蛋白酶活化因子基因(Apaf1),比值为2.910;编码细胞凋亡相关蛋白PNAS-2基因,比值为0.420.RT-PCR检测口服四硫化四砷APL患者缓解前后外周血Apaf1比值2.33,caspase-9比值3.21,PNAS-2比值0.99.结论:四硫化四砷对NB4细胞的细胞凋亡效应主要涉及两个基因表达的改变:细胞凋亡蛋白酶活化因子(Apaf1)基因的表达上调和细胞凋亡相关蛋白PNAS-2基因表达的下调.APL患者PNAS-2基因表达没有明显的改变,可能与使用其他药物的影响有关.Apaf1和caspase-9表达相应的增高提示,四硫化四砷诱导APL细胞凋亡可能是通过以线粒体介导的凋亡通路为主的活化途径,而不是通过死亡受体途径.     

雄黄对急性早幼粒细胞白血病NB4细胞基因表达谱的影响

目的 研究雄黄作用后白血病细胞基因表达谱的变化，寻找雄 黄作用的靶基因. 方法分别在蛋白质合成抑制剂放线菌酮预处理细胞前 后，以1024D芯片研究雄黄作用前后急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株NB4细胞差异表达的基因.结 果 雄黄（355 μg·L-1砷）作用4 h后，筛选出差异表达基因13条，其中２条表达增加，11条表达降低；放线菌酮抑制试验筛选出 差异基因4条，其中1条表达增加，3条表达下调，与前次芯片结果上下调趋势一致、程度相似. 结论 细胞信号传递蛋白类基因U51903和Z22533, DNA结合转录和 转录因子相关基因AF036613,代谢类基因X66435等可能是雄黄作用于APL细胞的靶基因.      

应用基因表达谱芯片研究硫化砷作用后K562细胞基因表达的变化

目的：利用基因表达谱芯片检测K562细胞在硫化砷作用前后基因表达的差异性进行比较研究。方法：研究对象为人慢性粒细胞白血病细胞株K562,用cy3和cy5两种不同的荧光染料通过逆转录反应将K562经硫化砷作用前后的mRNA分别标记成两种探针,并与载有一组靶的基因表达谱芯片进行杂交,通过计算机扫描分析得到这些基因在经硫化处理前后的表达差异,结果：筛选出包括与DNA结合,转录和转录因子,蛋白翻译,细胞周期等相关表达差异的基因共11条,其中7条表达上调,4条表达下调,结论：周期素E2,周期素G2可能参与硫化砷诱导K562细胞凋亡发生机制。     

全反式维甲酸诱导NB4细胞分化过程中泛素-蛋白酶体系统的表达变化

目的筛选在全反式维甲酸(ATRA)诱导NB4细胞分化过程中,参与早幼粒细胞白血病-维甲酸α受体(PML-RARα)融合蛋白降解的泛素-蛋白酶体系统相关基因。方法采用基因芯片技术检测泛素-蛋白酶体系统相关基因在ATRA诱导NB4细胞分化过程中的表达情况,并运用实时荧光定量RT-PCR和Western Blot方法在基因和蛋白水平对基因芯片部分结果进行验证,同时对这些基因在ATRA诱导急性早幼粒细胞性白血病(APL)初诊患者原代细胞分化时的表达情况进行检测。结果在ATRA诱导NB4细胞向粒系分化的过程中,发现许多泛素-蛋白酶体系统相关的基因主要在ATRA作用12h后表达上调,其中PSMB8和PSMB9这两个基因的芯片结果通过实时荧光定量RT-PCR和Western Blot得到验证。同时在ATRA作用于APL初诊患者原代细胞后,这些基因的变化情况也与作用于NB4细胞相似。结论在ATRA诱导APL细胞分化过程中筛选出一些受ATRA调控的参与PML-RARα融合蛋白降解的泛素-蛋白酶体系统分子。     

用cDNA微矩阵技术分析三硫化二砷作用于NB4细胞后的基因改变

1994年起,我所率先应用口服四硫化四砷和三硫化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)患者,迄今已达100多例,5年存活率90%以上[1].硫化砷对APL患者的治疗作用机制目前尚不清楚.正如肿瘤的发生是多因素、多步骤、多环节的过程一样,药物对肿瘤细胞的作用也是多环节的,硫化砷对NB4细胞的效应也不例外.传统的研究方法仅仅从一个基因、一个蛋白入手研究砷剂对细胞的作用,所获得的信息往往比较单一,很难对砷作用于细胞的机制全面了解.基因微矩阵技术的引入,可以多参数同时研究大量基因在不同刺激条件下的差异表达,更深入、全面了解硫化砷对NB4细胞的作用机制[2,3].为此,我们以三硫化二砷为代表,通过基因微矩阵技术检测其对NB4细胞基因表达的影响,对该药作用于NB4细胞后基因的表达谱改变进行分析,寻找硫化砷对NB4细胞效应的多个"分子靶点",阐明三硫化二砷对NB4细胞效应的分子机制.     

丹参酮ⅡA对APL细胞促凝及纤溶活性的影响

目的:研究丹参酮ⅡA(Tan ⅡA)对急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株NB4细胞及APL原代细胞促凝及纤溶活性的影响。方法:Tan ⅡA与NB4细胞共同培养,用复钙时间检测NB4细胞的促凝活性(PCA),检测TanⅡA处理的APL原代细胞的PCA,用缺FⅦ血浆及缺FⅧ血浆探讨TanⅡA对NB4细胞的PCA作用的途径。并用发色底物法测量反应体系中FX a,发色底物法检测其Plasmin(Plm)活性。结果:不同浓度Tan ⅡA均可下调NB4细胞PCA水平,它们与对照组之间有统计学差异(P<0.01)。Tan ⅡA和ATRA下调NB4细胞的PCA水平相似,无统计学差异(P>0.05)。Tan ⅡA可下调APL原代细胞的PCA水平;缺FⅦ血浆组的NB4细胞未显示PCA作用。经Tan ⅡA作用的NB4细胞,FX a水平降低。Tan ⅡA能降低NB4及APL细胞的Plm活性(P<0.01)。结论:Tan ⅡA可降低NB4细胞及APL原代细胞的PCA水平,其作用强度与ATRA相似。其降低PCA作用的途径是外源性凝血途径。TanⅡA降低其Plm活性不是通过PAI途径而实现的。     

小檗胺诱导白血病细胞株NB4细胞凋亡及其机制的研究

目的：探讨小檗胺对白血病细胞系NB4生长的影响及其机制。方法：体外培养人白血病细胞株NB4细胞，经不同浓度小檗胺处理不同时间后，MTT法检测药物对NB4细胞的抑制作用；细胞形态学观察和DNA琼脂糖电泳检测细胞凋亡；流式细胞仪检测DNA含量及细胞周期；巢式PCR及RT-PCR检测PML／RARα融合基因及Survivin基因表达及流式细胞仪检测Caspase3阳性表达率。结果：经不同浓度小檗胺处理不同时间后，NB4细胞生长出现明显的抑制，并呈现明显的时间剂量依赖性，48h IC50为3．860μg／ml；细胞形态学观察可见细胞凋亡现象，DNA琼脂糖电泳显示典型的凋亡梯形图；流式细胞仪检测发现细胞凋亡率明显增加，经48h作用后，凋亡率从2．83％增至12μg／ml时的58．44％；虽未发现药物作用后PML／RARα基因表达量的改变，但检测到NB4细胞经药物作用后Survivin基因表达量的减少和Caspase3表达的增加，Caspase3阳性率从对照组的2．06％增至12μg／ml时的70．89％。经相关性分析，随着细胞Survivin表达水平的下降和Caspase3表达水平的增高，NB4细胞凋亡率相应地增高。结论：小檗胺对NB4细胞有增殖抑制作用，诱导细胞凋亡可能是其抗肿瘤作用的重要机制之一，但不是通过作用于NB4细胞特异性融合基因PML／RARα发挥作用的，其抗凋亡的可能分子机制之一是抑制Survivin基因的表达和增加Caspase3的表达。     

全仅式维甲酸(ATRA)和三氧化二砷(As2O3)对APL细胞组织因子表达的影响

目的　探讨全反式维甲酸 (ATRA)和三氧化二砷 (As2 O3)在体内外对急性早幼粒细胞性白血病 (APL)细胞组织因子 (TF)表达的影响。方法　利用复钙时间测定、ELISA和RT PCR等方法 ,分别检测了ATRA和As2 O3 治疗前后APL患者骨髓单个核细胞的促凝活性、TF抗原及其mRNA的转录水平 ,同时还检测了使用ATRA和As2 O3 处理APL细胞株NB4细胞和NB4 R1细胞以及转染PML RARa融合基因的U937细胞的促凝活性、TF抗原及其mRNA的转录水平。结果　ATRA和As2 O3 在体内和体外均可以时间依赖的方式下调NB4细胞的促凝活性、TF抗原水平以及TFmRNA的转录。转染PML RARa融合基因的U937细胞与仅转染逆病毒载体的U937细胞相比 ,其TF表达水平显著升高 ;使用ATRA或As2 O3 分别处理转染PML RARa和转染逆病毒载体的U937细胞 ,其TF抗原水平均显著降低。结论　ATRA和As2 O3均可下调APL细胞TF的表达并降低其PCA ,As2 O3在诱导APL细胞凋亡的同时有可能通过下调APL细胞TF的表达而改善APL患者与DIC相关的出血症状。结果还提示APL细胞染色体易位产生的融合蛋白PML RARa可能对TF的异常表达有一定的影响 ,而ATRA和As2 O3对TF的下调作用可能不依赖于对融合蛋白PML RARa的降解。     

In vitro study on arsenic sulfide(realgar)-induced apoptosis of retinoic acid susceptible or resistant acute promyelocytic leukemia cell lines

Objective: To further understand the possible mechanisms of arsenic sulfide (realgar) in the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL). Methods: All-trans retinoic acid (ATRA)-susceptible APL cell line (NB4 cells) and ATRA-resistant APL cell line (MR2 subclone) were used as models in vitro. At various times after incubated with various concentrations of realgar, NB4 and MR2 cells were observed by cell viability , cell proliferation and cell morphology; cell cycle and the expression of Annexin V were assayed by flow cytometry. Results: Cell viability and proliferation of NB4 and MR2 cells were inhibited after the treatment, to some extent, in a dose and time dependent manner. 177 - 711g/L of realgar treated NB4 and MR2 cell presented morphologically some features of apoptotic cells such as intact cell membrane, chromatin condensation and nuclear fragmentation, apoptosis body could be found by electron microscopy as well. Sub-Gl cells and cell cycle arrest were observed by flow cytometry. The proport     

c-Myb在急性早幼粒细胞白血病发病过程中的作用

目的探讨转录因子c—Myb在急性早幼粒细胞白血病（APL）发病过程中的作用。方法通过分析患者的表达谱数据,比较在正常早幼粒细胞和APL细胞中c—Myb的表达水平;然后通过全反式维甲酸（ATRA）诱导NB4细胞分化和PR9加ZnSO4模拟APL发病,研究c—Myb是否参与APL发病过程;利用RNAi干扰c—Myb表达的技术,明确c—Myb对逆转APL的作用。结果在APL细胞中c—Myb的表达水平高于正常早幼粒细胞;c—Myb的表达随着ATRA的诱导分化逐渐下降,在ZnSO。诱导PR9模拟APL发病的过程中逐渐上升;c—Myb的敲除可以促进NB4细胞的分化,使NB4细胞的CD11b阳性率增加约20％。结论APL细胞中c—Myb的表达高于正常早幼粒细胞,它对APL的发病有着重要的作用,对其选择性敲除可以部分逆转APL细胞的分化阻滞。     

维甲酸和三氧化砷对急性早幼粒细胞性白血病细胞组织因子表 …

目的 探讨全反式维甲酸（ＡＴＲＡ）和三氧化二砷（Ａｓ２Ｏ３）在体内外对急性早幼粒细胞性白血病（ＡＰＬ）细胞组织因子（ＴＦ）表达的意义。方法 利用复钙时间测定、ＥＬＩＳＡ和ＲＴ－ＰＣＲ等方法,分别检测了ＡＴＲＡ和Ａｓ２Ｏ３治疗前后ＡＰＬ患者（２３例）骨髓单个核细胞的促凝活性、ＴＦ抗原及其ｍＲＮＡ的转录水平,同时还检测了使用ＡＴＲＡ和Ａｓ２Ｏ３处理ＡＰＬ细胞株ＮＢ４－Ｒ１细胞以及转染ＰＭＬ－ＲＡＲａ融     

Berbamine selectively induces apoptosis of human acute promyelocytic leukemia cells via survivin-mediated pathway

Background Currently, resistance and relapse are still major problems in acute promyelocytic leukemia （APL） cases. Thus, new agents that override the resistance are crucial to the development of curative therapies for APL. In this study, we investigated the effects of berbamine on the proliferation of APL cell line NB4 and its possible mechanisms. Methods NB4 cells were treated with berbamine at different concentrations （0-64 μg/ml） for 72 hours. MTT assay was used to determine proliferation inhibition of NB4 cells. Cell apoptosis was evaluated by both flow cytometry （FCM） and morphological examination. PML/RAR-α and survivin mRNAs were measured by nested-RT-PCR and RT-PCR, respectively. Activated-caspase 3 was determined by FCM. Results Berbamine greatly inhibited the proliferation of NB4 cells in dose- and time-dependent manners, and its IC50 value was 3.86 μg/ml at 48 hours. Both morphological observations and FCM results showed that berbamine induced apoptosis of NB4 cells with concomitant increase of activated caspase-3 and decrease of survivin mRNA. After treatment with berbamine at 8 μg/ml for 48 hours, the percentage of apoptotic cells increased from 2.83% to 58.44% （P〈0.01）, and the percentage of cells with activated-caspase 3 elevated from 2.06% to 70.89% （P〈0.01）, whereas, level of survivin mRNA was reduced to 38.24% of control （P〈0.01）. However, no significant change was observed in PML/RAR-α mRNA. Conclusions Berbamine induces caspase-3-dependent apoptosis of leukemia NB4 cells via survivin-mediated pathway, suggesting that berbamine may be a novel potential agent against APL with a mechanism distinct from that of all-trans retinoic acid （ATRA） and arsenic trioxide （ATO）.     

As2O3诱导NB4、HL-60细胞凋亡的机制研究

目的探讨三氧化二砷(As₂O₃)在体外抑制急性早幼粒白血病(acute promyelocyticleukemia, APL)细胞NB4、HL-60细胞增殖,诱导细胞凋亡的分子机制。方法 通过WST-8法检测上述两个细胞株的增殖抑制曲线;用AnnexinV/PI流式细胞术检测细胞的凋亡;用Real time PCR检测凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bax、p53、C-myc、Survivin在As₂O₃处理前后的表达变化,同时用Westernblot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bax、P53在As₂O₃处理前后的表达变化。结果 As₂O₃能够显著抑制两种细胞增殖, Westernblot检测及Realtime PCR结果显示,As₂O₃处理引起了两种细胞中Bax、Caspase-3、Caspase-8 、Caspase-9基因表达水平增加,且蛋白表达水平上都出现了活性形式的Caspases。NB4细胞中Survivin、C-myc、Bcl-2的基因表达水平都显著降低,突变型p53蛋白在细胞内的量同样显著下降;HL-60细胞的C-myc表达水平显著降低,但Survivin、Bcl-2表达水平无明显变化。结论 As₂O₃能在药物临床浓度范围内有效抑制急性早幼粒白血病细胞HL-60、NB4的细胞增殖, 但方式不同;1.5μmol/L浓度的As₂O₃对NB4细胞生长的抑制体现在诱导细胞分化并诱导细胞凋亡,对HL-60细胞生长的抑制只体现在诱导细胞分化。HL-60细胞中高表达的Survivin、Bcl-2抑制了细胞的凋亡。NB4、HL-60细胞株中P53基因的细胞遗传学变异的不同可能是As₂O₃对这两种细胞增殖抑制机制差异的主要原因之一。