突变乙型肝炎病毒核心蛋白的克隆及表达

目的 克隆并表达发生长片段缺失的HBV核心蛋白(HBV-C)基因,并对其进行DNA序列、蛋白质结构和抗原性分析.方法 采用PCR方法从1株野生型HBV基因组中扩增得到发生长片段缺失的HBV-C基因,克隆至pUCm-T质粒,进行测序、同源性比较和蛋白质结构分析;再将基因编码区克隆至原核表达载体pET-28a,构建含HBV-C基因的重组表达质粒,转化至大肠埃希菌BL21中进行诱导表达并检测其抗原性.结果 PCR扩增出的HBV-C基因长度经序列分析表明,其核苷酸序列缺失了220 bp至317 bp之间的98个碱基,造成从第74个氨基酸起发生移码突变并失去了抗原性.结论 成功克隆和表达了发生长片段缺失的HBV-C基因.     

乙型肝炎病毒核心蛋白原蛋白转化酶切割假定产物的体外研究

目的 通过体外试验探讨furin切割核心蛋白的可能性,并通过重组载体表达,研究其假定产物在HepG2细胞内的分布特点. 方法 重组HBV核心蛋白,并将其在不同温度和时间条件下(4℃消化16 h、30℃消化1h和30℃消化3h)接受furin切割,产物采用Western blot分析.构建HBV核心蛋白furin切割假定产物的真核表达载体,并以完整核心蛋白表达载体作为对照,转染HepG2细胞,获得稳定表达细胞株.使用核心蛋白与假定产物共同区的单克隆抗体进行间接免疫荧光染色,用共聚焦显微镜观察其细胞内分布. 结果 HBV核心蛋白在多种条件下均被furin切断,其主要产物相对分子质量约为15 000,与预期相符,且30℃切割1 h的效果最好.真核表达的核心抗原假定切割产物能与核心蛋白单克隆抗体结合,且在细胞内的分布与完整核心蛋白类似,主要以颗粒形式分布在细胞质. 结论 HBV核心蛋白在体外能被furin切割,其主要产物与完整核心蛋白有类似的免疫原性和相同的细胞内分布,提示furin或其家族成员参与了HBV复制调节,其切割产物对机体抗病毒免疫可能存在深远影响,值得深入研究.     

X蛋白在乙型肝炎病毒生命周期中作用的研究

X基因是一种仅存在于嗜肝乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,HBV)的基因,至今未在其它逆转录病毒和生物细胞中发现它。由于它的基因结构的特殊性及高度的保守性,提示其在HBV的生物学上具有重要的生物学意义,越来越多的证据表明,它是引起肝癌的直接病因,还广泛参与宿主细胞的基因表达、反式激活和细胞信号转导过程。 一、基因在HBV感染宿主细胞过程中具有不可或缺的作用 Chen等以土拨鼠HBV(WHV)质粒感染上拨鼠为模型,将质粒的X基因起始密码子ATG突变为TTG,去除X基蛋白表达,即对X基因表达的C末端突变,形成终止密码,使X蛋白C末端分别截除52、31、16或3个氨基酸,与野生型感染质粒进行对照,结果发现,除在C末端截除3个氨基酸的突变质粒外,其它各种突变均不能有效感染土拨鼠。Zoulim等应用不同的感染性质粒,独立进行了相似的实验,他们将WHV的     

人胰腺细胞cDNA文库中丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白基因的筛选

目的 为进一步研究HCV影响糖、脂代谢机制奠定研究基础.方法 扩增人胰腺cDNA文库并经纯化鉴定后,将文库质粒转化酵母菌株Y 187.诱饵质粒pGBKT7-core转化酵母菌株AH109,在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落.应用酵母双杂交系统3将阳性重组AH109菌株与重组酵母菌株Y187进行配合,在四缺培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的四缺培养基上进行筛选,提取蓝色酵母菌落质粒,电转化大肠埃希菌DH5α后再提取质粒测序,测序结果进行序列比对.结果 筛选出11种与HCV核心蛋白相结合的蛋白基因,包括胰凝乳蛋白酶原B1前体、羧肽酶A1,胰蛋白酶原2、胰凝乳蛋白C、胰蛋白酶1,羧肽酶B1、驱动蛋白家族3B、胰蛋白酶2,线粒体蛋白基因、弹性蛋白酶3A,辅脂肪酶.结论 在筛选出的HCV核心蛋白结合的人胰腺细胞蛋白基因中,部分与糖,脂代谢密切相关.     

乙肝病毒核心蛋白的结构与功能及其在抗病毒治疗中的应用

目前，干扰素和5种核苷（酸）类似物被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于慢性乙型肝炎（CHB）的治疗。但干扰素的低应答率和多种不良反应限制了其使用，核苷（酸）类似物的长期应用又具有明显的耐药性。     

乙型肝炎病毒包膜大蛋白检测与病毒复制的相关性研究

目的探讨乙型肝炎病毒外膜大蛋白(LHBs)与乙肝病毒DNA(HBV DNA)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)之间的关系,寻找既方便操作又能反映病毒复制的指标,为乙型肝炎的诊断及疗效评估提供科学依据。方法 410例临床标本分别采用荧光定量PCR技术检测HBV DNA载量,LHBs检测用ELISA法,HBeAg采用化学发光法检测。结果不同HBV-M模式的HBV DNA与LHBs检出结果均无显著性差异(P0.05)。LHBs含量与HBV DNA拷贝数呈正相关(r=0.958,P0.001)。在HBV DNA(+)模式群体中LHBs阳性率明显高于HBeAg(+)人群,差异具有统计学意义(P0.001)。结论血清LHBs与HBV DNA复制密切相关,可作为反映HBV复制的指标。LHBs检测方法特异性优于HBeAg检测方法,LHBs在HBV的诊断和疗效评估方面有重要的临床应用价值。     

包膜蛋白突变对乙型肝炎病毒包装的影响

目的　探讨包膜蛋白突变对HBV包装的影响。方法　构建包膜蛋白突变的全长HBV基因组表达载体:前S1突变HBV表达载体pHBV mS1、Sloop突变HBV表达载体pHBV mS和前S1、S共突变HBV表达载体pHBV mS1S。分别转染HepG2细胞,以野生型HBV质粒 (adwR9 )转染HepG2细胞为对照;pHBV mS1S和pcDNA3分别与adwR9共转染HepG2细胞。ELISA方法检测上清液中和胞内S抗原;荧光定量PCR检测胞内和上清液中病毒量。结果　突变体pHBV mS1、pHBV mS和pHBV mS1S与对照组adwR9中S蛋白表达量和分泌量无明显差别;单独转染的突变体胞内病毒量较adwR9高,尤其以pHBV mS1S明显,而突变体上清中病毒量较对照组adwR9低,尤其以pHBV mS1S明显;pHBV mS1S与adwR9共转染组上清液中病毒量较pcDNA3与adwR9共转染组低。结论包膜蛋白突变对S蛋白表达量和分泌量无影响,但影响病毒包装,使病毒分泌量下降。     

乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白结合蛋白基因的筛选及其与人胰腺CDK5RAP3的相互作用

我们通过细胞内的免疫共沉淀(CO-IP)技术验证乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白(LHBs)LHBs与人胰腺CDK5RAP3之间的相互作用,为进一步研究HBV影响代谢的分子生物学机制提供一定的思路和研究方向.     

乙型肝炎病毒核心相关抗原的监测及临床意义

监测乙型肝炎病毒核心相关抗原(HBcrAg),能有效预测核苷(酸)类药物抗病毒治疗后产生的病毒学反弹及耐药风险,具有重要的临床实用价值。     

乙型肝炎病毒前核心区及基本核心启动子变异的检测及其对患者疾病谱的影响

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)前核心区(前C区,nt1896)及基本核心启动子(BCP,nt1762/1764)变异在慢性HBV感染者疾病谱的分布及对患者疾病谱的影响。方法416例血清HBsAg阳性、HBVDNA定量大于1.0×104拷贝/毫升的患者,采用微流基因芯片检测HBV前C区及BCP变异。结果416例HBV感染者中302例为HBeAg(-)患者,其中248例(82.12%)有前C区或BCP变异,41.06%为前C区变异,31.12%BCP变异,2种同时变异为9.94%。HBeAg(-)的慢性乙型肝炎和肝硬化患者前C区变异分别为64.72%和83.33%(x2=0.89,P>0.05),均大于HBeAg(-)无症状携带者的28.47%(x2=54.20,P<0.01;x2=5.29,P<0.05);而HBeAg(-)无症状携带者BCP变异达77.19%,大于HBeAg(-)慢性乙型肝炎和肝硬化患者(x2=69.73,P<0.01;x2=10.58,P<0.01)。而在114例HBeAg(+)患者中28.95%有前C区或BCP变异。结论前C区或BCP变异在慢性HBV感染者疾病谱的分布不同,在HBeAg(-)/HBVDNA(+)与HBeAg(+)/HBVDNA(+)患者变异率差异显著。HBV前C区可能是该病变反复及加重的一个重要原因,但BCP变异临床意义不明确。     

DMSO促进HepG2细胞感染乙型肝炎病毒后核心蛋白入核

目的:探讨DMSO诱导处理的HepG2细胞被HBV感染的作用机制.方法:将HepG2分为DMSO处理组和对照组,分别用添加或不添加2%DMSO的DMEM培养基培养4 d.将HBV病毒颗粒(1000拷贝/细胞)加入培养基中于37℃感染12h.以蛋白免疫印迹,免疫荧光染色及共聚焦显微镜观察HBcAg在细胞内的定位.选择性PCR检测HBV cccDNA,流式细胞分析仪检测细胞周期.结果:对照组HepG2细胞在感染HBV阳性血清后,HBcAg在细胞质内分布,核内呈阴性,至感染后2 d细胞内核心蛋白消失,未检出明显的cccDNA信号.2%DMSO处理后的HepG2细胞感染后12 h细胞质内HBcAg水平明显高于对照组,感染后24 h HBcAg在核周浓集.在感染后24 h和48 h核内HBcAg明显增高,且cccDNA结果阳性.流式分析结果显示DMSO处理后处于G_1/G_0和G_2/M期的HepG2比例升高,处于有丝分裂期的HepG2细胞内HBcAg弥散分布于全细胞.结论:HepG2细胞感染HBV后核心颗粒不能穿过核孔携带HBV DNA进入细胞核可能是其抵制HBV感染的重要原因.DMSO可促进HBV核心颗粒进入细胞核而有助于感染.     

丙型肝炎病毒核心蛋白DNA结合区的测定

目的 阐明丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的DNA结合特性及其意义。方法 在大肠杆菌中表达谷胱甘肽转移酶（GST）融合HCV核心蛋白不同长度片段,并进行纯化。经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,通过更换缓冲液的方法将这些蛋白片段相对固定在凝胶中,用γ－^32P[4667-0091]ATP标记人工合成的DNA进行2次电泳,通过放射自影检测核心蛋白的DNA结合区。结果 HCV核心蛋白N端第10－16位氨基酸残基和第46－70位氨基酸残基可独立地结合DNA,核心蛋白既能和单链DNA结合又能和双链DNA结合,对单双链DNA的结合域相同。对所结合的DNA序列无选择性。结论 HCV核心蛋白的N端含有两个DNA结合区,结合区序列与核内转移信号的部分重迭以及对结合靶DNA序列的非选择性可能是HCV核心蛋白具有多功能的基础。     

HBV X基因-HCV C基因cDNA融合基因真核表达载体的构建及其表达

目的：构建HBV X-HCV C融合基因真核表达载体，并获得稳定表达该基因的HepG2细胞株。方法：双酶切质粒pXT1-X，得到完整的HBV X基因片段后，将其插入到质粒PBK-CMV和PBK-HCVC的相应酶切位点，得到重组质粒PBK-X和PBK-X-C；再将质粒RBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C分别导入肝癌细胞株HepG2中，G418筛选，RT-PCR、蛋白印迹鉴定HBV X和HCV C蛋白表达。结果：质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C在HepG2细胞中有稳定表达。结论：成功构建HBV X-HCVC融合基因真核表达载体，并获得稳定表达该基因的HepG2细胞株。     

长片段RNA抑制HepG2.2.15细胞中HBV基因的表达和复制

目的 评估长的反义RNA干扰片段在培养细胞株中对HBV复制的抑制效应.方法将HBV基因组S区的全部核苷酸序列插入至pTARGETTM载体中,并将重组载体转染入HepG2.2.15细胞中.用酶联免疫吸附法检测HBsAg与HBeAg水平,用荧光定量PCR法检测HBVDNA水平.对数据采用多个独立样本Kruskal-Wallis检验与两两比较的Mann-Whitney U检验.结果 经过处理后,HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg表达量(A值)在HBS2组(携带长片段反义RNA)为0.621±0.027,在HBS4组(携带正义RNA)为3.399±0.018,对照组为2.232±0.187;HBeAg表达量(A值)在HBS2组、HBS4组和对照组分别为0.749±0.019、1.548±0.025和1.570±0.044; HBV DNA水平(×104拷贝/ml)在HBS2组、HBS4组、对照组分别为1.597±0.082、3.381±0.297和3.610±0.063.与对照组相比,HBS2组HBsAg、HBeAg和HBV DNA表达量均降低,统计量Z值均为-2.309,P值均＜0.05; HBS4组HBsAg表达量增高(Z=-2.309,P＜0.05),而HBeAg和HBV DNA表达量无明显差异,统计量Z值分别为-0.866、-1.155,P值均＞0.05.结论 长片段反义RNA能抑制HBV基因的表达和病毒复制.

Abstract：

Objective To evaluate the inhibitory effects of long antisense RNA on HBV replication in HepG2.2.15 cells. Methods The coding region of HBV S gene was cloned into pTARGET vector in sense and antisense orientations and the recombinant plasmids were transfected into HepG2.2.15 cells which were divided into HBS2 (antisense RNA) group, HBS4 (sense RNA) group and control group. HBsAg and HBeAg in the culture supernant were detected by ELISA. The HBV DNA in the supernant was quantified by real-time PCR. Results After treatment, the levels of HBsAg in HepG2.2.15 cell supernatants of three groups were 0.621 ± 0.027, 3.399 ± 0.018 and 2.232 ± 0.187 respectively; the levels of HBeAg were 0.749 ± 0.019,1.548 ± 0.025 and 1.570 ± 0.044 respectively and the levels of HBV DNA were 1.597 ± 0.082, 3.381 ± 0.297 and 3.610 ± 0.063 respectively. The expressions of HBsAg and HBeAg and the HBV DNA level in HBS2 group were remarkably reduced as compared to the control (Z = -2.309, P ＜ 0.05); whereas the sense plasmid transfection (HBS4) did not affect HBeAg (Z= -0.866) and HBV DNA (Z = -1.155) levels in the culture supernant but slightly increased the HBsAg level (Z = -2.309). Conclusion Antisense RNA might be a useful tool to repress HBV replication.     

乙型肝炎病毒X变异体穿梭载体的成功构建及在酵母中的表达

目的构建表达乙肝病毒（HBV）X变异体基因的穿梭载体。方法用PCR法扩增HBVX基因及变异体基因序列，用EcoRⅠ和PstⅠ双酶切pAS2-1和PCR产物．连接酶切片段pAS2—1及X变异体片段以构建pAS2-1-（X变异体）穿梭质粒，并通过醋酸锂转化法转化入酵母AH109中。结果已构建的pAS2-1-（X变异体）穿梭质粒经序列测定含有所需的HBV—X变异体基因片段，转入酵母细胞后经PCR证实酵母内有表达。结论成功构建了pAS2-1-X变异体穿梭质粒，为进一步在真核细胞内更全面了解HBV-X蛋白作用奠定了基础。     

乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因共表达对血管内皮细胞生长因子的影响

目的建立乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因（HBV X—HCV C）共表达HepG2细胞模型，并探讨其对血管内皮细胞生长因子表达的影响。方法双酶切质粒pXT1—X，得到完整的HBV X基因片段后，将其插入到质粒PBK—CMV和PBK—HCV C的相应酶切位点，得到重组质粒PBK—X和PBK—X—C；再将质粒PBK—CMV、PBK—X、PBK—HCV C和PBK—X—C分别导入肝癌细胞株HepG2中，G418筛选，逆转录聚合酶链反应、Western blot鉴定HBV X和HCV C蛋白表达，免疫组织化学、Western blot检测血管内皮细胞生长因子蛋白质表达。结果质粒PBK—CMV、PBK—X、PBK—HCV C和PBK—X—C在HepG2细胞中有稳定表达。共表达HBV X—HCV C蛋白的细胞血管内皮细胞生长因子蛋白质表达较转染空载体的细胞及单独表达HBV X、HCV C蛋白的细胞明显升高。结论HBV X—HCV C共表达能显著上调血管内皮细胞生长因子蛋白质表达，提示HBV、HCV可能具有协同致癌作用。     

丙型肝炎病毒感染者血清核心蛋白水平与抗病毒治疗效果相关性分析

目的 探讨血清HCV核心蛋白与抗病毒治疗效果的相关性.方法 采用ELISA法检测162例丙型肝炎患者血清HCV核心蛋白量,采用荧光定量PCR检测HCV RNA;观察35例接受聚乙二醇干扰素+利巴韦林治疗的患者在治疗前、治疗4周、治疗24周、治疗48周时HCV RNA与HCV核心蛋白水平,比较两者血清水平随临床疗效变化的一致性.两组计量资料比较采用t检验,多组配对资料进行方差分析.结果 162例患者中56例HCV RNA≤1×103IU/mL,HCV核心蛋白吸光度(A)值为0.100±0.029;9例1×103IU/mL＜HCV RNA≤1×104 IU/mL,A值为0.246±0.213;11例1×104IU/mL＜HCV RNA≤1×105IU/mL,A值为0.235±0.179;28例1×105 IU/mL＜HCV RNA≤1×106IU/mL,A值为0.422±0.319;51例1×106IU/mL＜HCVRNA≤1×107IU/mL,A值为0.603±0.330;7例1×107IU/mL＜HCV RNA≤1×108IU/mL,A值为0.900±0.379.对HCV RNA与HCV核心蛋白水平进行相关性分析,结果呈正相关(r=0.36,P＜0.05).35例接受抗病毒治疗患者治疗前、治疗4周、治疗24周和治疗48周时的核心蛋白A值分别为0.564±0.296、0.144±0.062、0.091±0.035和0.112±0.103.与抗病毒治疗前比较,治疗4周、24周、48周患者血清HCV核心蛋白水平均明显下降(t=8.563、9.195、9.250,均P＜0.05);治疗4周与24周比较,差异也有统计学意义(t=4.301,P＜0.05).结论 在疾病进程及抗病毒治疗过程中血清HCV核心蛋白的量的变化与HCV病毒载量变化是平行的.     

乙型肝炎病毒X蛋白对HepG2细胞中细胞色素P450同工酶3A4诱导的影响

目的 观察乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对1α,25-(OH)2D3诱导的HepG2细胞色素P450(CYP)3A4的影响.方法 将重组HBx真核表达质粒pcDNA3-X与pEGFP-N1质粒(转染对照)瞬时共转染HepG2细胞,分为空白细胞对照组(对照组)、转染pEGFP-N1组、转染pEGFP-N1+1α,25-(OH)2D3组、共转染pEGFP-N1+pcDNA3-X+1α,25-(OH)2D3组.同时以0.35 μmol/L1α,25-(OH)2D3诱导HepG2细胞CYP3A4表达72 h,分别以RT-PCR法和Western印迹法,在mRNA水平和蛋白水平检测CYP3A4的表达.组间比较行F检验.结果共转染pEGFP-N1+pcDNA3-X+1α>,25-(OH)2D3组CYP3A4 mRNA表达量是空白对照组的1.52倍,而转染pEGFP-N1+1α,25-(OH)2D3组为3.97倍(F=4.72,P<0.05);共转染pEGFP-N1+pcDNA3-X+1α,,25-(OH)2D3组CYP3A4蛋白诱导倍数是2.1,而转染pEGFP-N1+1α,25-(OH)2D3组是5.9(F=4.68,P<0.05).结论 HBx干扰1α,25-(OH)2D3对HepG2细胞CYP3A4的诱导,提示HBx对CYP3A4的表达调控有抑制作用.