基于重组酶介导等温扩增技术检测人腺病毒4型方法的建立与评价

目的 基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)拟建立一种简单快速的人腺病毒4型(HAdV-4)检测方法。方法 以HAdV-4的六邻体(Hexon)基因为靶标设计特异性引物与探针,利用构建的阳性质粒标准品,在39℃、40℃、42℃条件下进行重组酶介导等温扩增,选出最佳反应温度,并对该方法进行灵敏度、重复性及特异性检测。使用实时荧光RAA测定法检测100份临床样本,并与实时荧光PCR检测结果进行比较,评估HAdV-4实时荧光RAA测定法在临床样本中的检测性能。结果 最终确定了实时荧光RAA扩增最适温度为42℃,该方法检测限为10¹ copies/μL。当质粒标准品浓度为10¹～10⁴ copies/μL时,批内的变异系数均<5%,重复性良好。特异性检测结果显示,该方法可以准确检测HAdV-4而不与其他亚型和其他病原体发生交叉反应。100例临床样本分别使用实时荧光PCR和实时荧光RAA测定法进行检测,两种方法的符合率为100%。结论 本研究开发了一种特异且简便的HAdV-4快速检测方法。     

重组酶介导等温扩增技术检测疟原虫方法的建立和评价

目的 建立一种重组酶介导等温扩增技术（RAA）检测疟原虫的方法。方法 针对疟原虫属保守18S小亚基核糖体RNA （18S rRNA）基因设计特异性引物,筛选确定最佳引物对组合并建立疟原虫重组酶介导核酸等温扩增体系。通过该RAA体系检测疟原虫标准质粒、4种疟原虫[恶性疟原虫( Plasmodium falciparum, P.f )、间日疟原虫( P. vivax, P.v)、三日疟原虫( P. malaria, P.m)、卵形疟原虫( P. ovale, Po)]病原体以及其他6种输血传播寄生虫（婴儿利士曼原虫、杜氏利士曼原虫、刚地弓形虫、溶组织阿米巴虫、犬吉氏巴贝西虫、田鼠巴贝虫）,以评估该体系的灵敏度和特异度。 结果 筛选出一组扩增效果较好的引物对,整个RAA体系使用最佳引物对在37 ℃,20 min即可完成扩增,对标准质粒的检测下限为10^-2 copies/μL,恶性疟原虫、间日疟原虫和卵形疟原虫为10² copies/μL,三日疟原虫为10 copies/μL。RAA检测体系未与其他输血传播寄生虫产生交叉反应,特异性良好。应用RAA方法检测外籍学生献血者标本,结果与荧光定量PCR结果一致。结论 成功建立了一种快速、简便和特异的疟原虫RAA检测方法,将会给血液筛查和一些基层偏远医院的临床检测提供很大帮助。     

沙门菌荧光重组酶介导等温扩增检测方法的应用研究

目的 建立基于重组酶介导等温扩增（recombinase-aided amplification, RAA）快速、灵敏、特异检测沙门菌的方法。方法 针对沙门菌invA基因保守区段设计特异性引物、探针,通过引物、探针筛选以及反应条件优化,建立检测沙门菌的荧光RAA方法,通过优化引物浓度、探针浓度、醋酸镁浓度、上样量来确定最佳反应体系组成。采用细菌纯培养物评估该方法的最低检测限、特异性等性能,通过模拟样品以及19份真实样品检测,同时采用国标法GB 4789.4-2016同步验证复核,评估该检测方法的可靠性。结果 该方法在39 ℃条件下20 min内可完成检测反应。利用该方法能够特异检测沙门菌,不能检出其他肠道致病菌。该方法检测细菌纯培养物的灵敏度为19 cfu/mL,检测模拟样品的灵敏度为190 cfu/mL。采用建立的沙门菌荧光RAA方法对采集的环境样品、食品污染及人体肛拭子样品共计19份进行检测,按照GB 4789.4-2016方法同步检测,4份阳性,其中3份样本荧光RAA检测呈现沙门菌阳性,1份肛拭子样本该方法未能检出。结论 荧光重组酶介导等温扩增法检测沙门菌快速、特异、简便、灵敏,能够在食源性疫情现场调查以及食源性疾病监测中发挥一定的作用。     

HCV及HIV二联病毒核酸荧光PCR检测方法的建立

目的建立多联病毒核酸荧光PCR检测方法,为我国核酸检测技术的应用前景提供技术支持。方法使用逆转录实时荧光PCR定量方法（QRT。PCR）检测HCV、HIV病毒,在成功扩增定量单一病毒的基础上,通过主要调整Mg2＋离子、dNTPs、Taq的浓度等优化反应体系,建立同时检测两种病毒核酸的逆转录实时荧光PCR定量检测方法（一步法双检）,并分析双检体系的扩增灵敏度。结果通过优化筛选反应条件,使用QRT．PCR方法成功扩增双模板HCV／HIVRNA,且检测特异性好,灵敏度较高,能达到HCVRNA20IU／ml与HIVRNA80IU／ml的检测灵敏度。结论本试验成功建立能同时检测两种病毒核酸的QRT．PCR方法,为后续研究HBV、HCV、HIV多联荧光病毒核酸检测系统提供了理论依据与技术支持。     

新型等温扩增技术应用于疟原虫等寄生虫快速诊断的研究进展

当前常用基于PCR原理的核酸检测技术来检测疟原虫,疟原虫检测方法主要包括镜检法、抗原免疫检测法和核酸检测法等。但由于存在检测时间长、人员和设备要求高等缺点,限制了其在基层的推广应用。特别是基层普遍缺乏经验丰富的专业技术人员和高端仪器设备,此外在极端环境下快速检测大规模样品的需求等对现存疟原虫检测方法造成了挑战。近年来发展起来的等温扩增技术由于具有简便、快速、灵敏性和特异性高等优点,具有潜在的应用前景。本综述介绍了试对各类等温扩增技术的原理、特点和前景等,并在此基础上重点综述重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification, RPA）与重组酶介导的等温扩增技术（recombinase-aided isothermal amplification assay, RAA）,并提出利用这类重组酶扩增技术,实现常见疟原虫种快速、精确诊断的可能。     

大鼠疑似泰勒氏病毒荧光定量检测方法的建立

目的 建立一种能在临床上快速、准确地检测大鼠疑似泰勒氏病毒（Theiler''s-like virus of rats,TLV）的方法,采用TaqMan探针荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）技术,特异性针对TLV病毒核酸进行检测。方法 通过基因合成序列作为质粒标准品的模板,同时选择特异性的序列在3622~3729 nt处,设计一对引物和TaqMan性探针,优化反应体系及条件,进行qPCR扩增,从而建立TLV TaqMan探针qPCR方法,并对其灵敏度、稳定性和特异性进行评价。结果 建立的TLV qPCR检测方法,标准曲线线性关系良好,R²值可达到0.99,灵敏性最低能够检测到10个拷贝数/μL,对比普通PCR方法,高出其100倍;对其他常见大鼠病毒均无非特异反应;重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%。结论 利用TaqMan探针建立快速检测TLV的荧光定量PCR方法,该方法具有操作简便、灵敏度高、特异性好等特点。     

埃博拉病毒核酸快速检测技术应用及展望

埃博拉病毒(EBOV)是引起人类及哺乳动物高致死性出血热的病原体,2013~2014年已引起了严重的西非埃博拉出血热。快速检测确证病原对于防止疾病的进一步扩散至关重要。目前,实时荧光定量PCR技术及环介导等温扩增技术(LAMP)已经应用于EBOV的核酸快速检测,依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)及重组聚合酶扩增技术(RPA)有望成为EBOV新型核酸快速现场检测技术。本文对几种核酸快速检测方法进行综述。     

荧光定量环介导等温扩增技术检测恶性疟原虫方法的研究

目的建立一种简便、快速和高灵敏度的恶性疟原虫的荧光定量环介导等温扩增检测方法。方法针对恶性疟原虫环子孢子蛋白（CSP）种属特异性基因保守区域8个位点设计3对引物,同时使用PCR法扩增恶性疟原虫219bp保守序列,经克隆后转化入工程菌株JM109感受态细胞中并提取重组质粒作为模板。以探索建立恶性疟原虫荧光定量环介导等温扩增检测技术,并对其试验重复性、灵敏度、特异性及适用性子以评估。结果在重组质粒浓度为1．06×10^4∽10^9拷贝／反应的范围内,标准曲线循环阈值与模板浓度有良好线性关系（相关系数0．9995）,CT值变异系数为6．29％,无非特异性扩增,初步临床试验结果表明,试验的灵敏度为90．00％,特异度为93．33％,准确性为91．67％,试验可在30min内完成。结论荧光定量环介导等温扩增技术检测恶性疟原虫简便、快速、敏感,具有广阔的应用前景。     

双重实时荧光PCR在手足口病快速检测中的应用

目的 探讨双重实时荧光PCR 技术检测手足口病肠道病毒的应用效果.方法 用单一实时荧光PCR先检测标本中的肠道病毒通用病毒核酸,肠道病毒通用病毒核酸阳性再分别用双重实时荧光PCR及单一实时荧光PCR检测CoxA16型和EV71型特异性核酸,比较两种方法检测结果.结果 240份标本中肠道病毒通用型核酸阳性157份,双重实时荧光PCR法CoxA16阳性111份,EV71阳性1份,其他肠道病毒45份,单一实时荧光PCR法CoxA16阳性109份,EV71阳性1份,CoxA16+EV71阳性2份,其他肠道病毒45份.EV71和其他肠道病毒符合率为100%.结论 双重实时荧光PCR 检测技术可以准确检测手足口病肠道病毒,且特异性强、灵敏度高,又可以快速得到检测结果,是一种快速检测手足口病病毒的方法.     

环介导等温扩增技术及其应用

环介导等温扩增法（LAMP）是一种新的核酸扩增法.该方法在一定温度下一步即可完成扩增反应.由于其扩增效率极高、反应简单快速、高特异性和反应结果只需肉眼观察的特点,LAMP法已广泛应用于病毒、细菌等的定性定量检测和临床疾病的诊断.本文介绍了LAMP方法的原理及其在微生物分子检测方面的应用.     

重组酶介导的肠出血性大肠杆菌O157:H7等温扩增方法的建立

目的：建立新的快速检测常见食源性致病微生物肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli,EHEC)O157：H7的方法。方法：根据EHECO157：H7保守区序列,结合重组酶介导的恒温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和荧光定量或胶体金侧向流免疫层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD),建立两种EHEC O157：H7检测方法(RAA荧光法和RAA-LFD法)并进行优化,评估这两种方法的灵敏性及特异性。结果：两种检测方法均可在39 ℃恒温条件下16 min内完成检测,两种方法的检测限均可达1×104 拷贝数,具有较高的灵敏性。两种方法与其他常见的肠道致病菌(金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、弯曲菌、 耶尔森菌、志贺杆菌)质粒模板无交叉反应,具有良好的特异性。结论：本研究建立的两种检测EHEC O157：H7的方法,检测时间短并具有较好的特异性、灵敏性和重复性,可用于EHEC O157：H7的快速检测。     

环介导等温扩增检测甲型H1N1病毒核酸方法的建立

目的建立检测甲型H1N1病毒环介导等温扩增的方法(LAMP)。方法根据已公布的甲型H1N1流感病毒HA基因序列766~995bp的6个位点设计6条LAMP引物(2条内引物,2条外引物,2条环引物),优化并建立LAMP检测体系。并对36例确诊H1N1感染患者和20例健康体检者的咽式子同时采用实时荧光RT-PCR(Real-time RT-PCR)和LAMP进行H1N1病毒核酸的检测。结果所建立的甲型H1N1病毒核酸LAMP反应体系具有良好的特异性,采用该体系检测结果与Real-time RT-PCR检测结果一致,对H1N1核酸阳性的标本经LAMP扩增产物电泳图为阶梯状条带,健康对照标本未见条带产生。灵敏度试验,采用103复制的H1N1质粒进行10倍稀释后LAMP法仍能检出。特异性试验,20例体检标本经两种方法检测全阴性,对肺炎支原体和肺炎衣原体阳性标本采用该反应体系进行检测结果为阴性。结论甲型H1N1病毒核酸LAMP检测方法简便、快捷,对实验仪器设备要求不高,适合各级实验室和现场快速诊断使用。     

荧光定量PCR与免疫荧光法定量定性检测牛血清中呼肠孤病毒

目的采用TaqMan荧光探针定量PCR技术与免疫荧光技术定量定性检测牛血清中呼肠孤病毒。方法以携带有Reovirus保守系列的重组质粒作为标准品,优化定量PCR体系,建立标准曲线,用Vero细胞培养不同病毒评价方法的特异性;用FITC标记的抗Reovirus病毒蛋白单克隆抗体对感染不同滴度Reovirus的Vero细胞培养物进行直接免疫荧光检测,用Vero细胞培养不同病毒评价方法的特异性。结果 Taq Man Real-time PCR方法检测灵敏度可达1.0×102拷贝/l,线性范围为109～103;免疫荧光法对Reovirus检测具有很高的特异性。结论以TaqMan荧光探针检测Reovirus荧光定量PCR方法,灵敏度高、特异性强,辅以免疫荧光定性检测方法,可以作为牛血清感染Reovirus的定量和定性检测。     

猴免疫缺陷病毒(SIV)实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒(SIV)TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法 RT-PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796 bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD-SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIV QPCR检测方法,质粒DNA模板在107～102拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3.26,相关系数为0.999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV%均小于1%。结论建立的SIV QPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)核酸拷贝量。     

咸阳市甲型H1N1流感病例的实时荧光定量RT-PCR检测

目的 对咸阳市首例甲型H1N1流感病例进行病毒核酸检测,为此后疫情的防控提供参考;方法采集病人1份咽拭子标本,使用两种不同厂家试剂,利用实时荧光RT-PCR法检测[1]进行甲型H1N1流感病毒核酸检测;结果结果显示两种试剂RTPCR反应体系扩增曲线都有明显对数增长,且Ct值符合质量控制的标准,为甲型H1N1流感病毒核酸阳性,同一份咽拭子标本送陕西省疾控中心复检,结果为甲型H1N1流感病毒核酸检测为阳性;结论这名病人为1例甲型H1N1流感病毒感染者的密切接触者,由于及时采用灵敏度高,特异性强,检测时间短的实时荧光定量R T-P C R方法检测,快速确诊了病例,为疫情的控制争取了时间,防止了2代病例的出现.     

重组酶聚合酶等温扩增快速检测结核分枝杆菌

目的建立一种基于重组酶聚合酶介导的等温扩增技术(RPA)快速检测结核分枝杆菌的方法。方法根据结核分支杆菌基因保守序列设计的2对引物和特异性寡核苷酸探针,以结核分枝杆菌阳性菌株和其他5种非结核分枝杆菌基因组DNA为模板,考察该方法的检测灵敏度和特异性。结果 RPA快速检测结核分枝杆菌方法仅需15 min,检测灵敏度为可检出0.043 ng/μl的基因组DNA;5种非结核分支杆菌均不能扩增,特异性较高。结论本研究建立了结核分枝杆菌的RPA快速检测方法,具有快速、简单、成本较低等优点,为结核分枝杆菌的快速检测提供一个新的工具。     

HIV-1前病毒基因扩增诊断早期HIV感染的研究

目的 建立HIV前病毒核酸的检测方法，并探讨其早期诊断断HIV-1感染的效果。方法从HIV1 2蛋白印迹法确定HIV抗体阳性、并经病毒载量检测阳性的HIV感染者血浆中提取基因组DNA，应用合成HIV-1基因组gag区九条引物随机组合RT-PCR扩增HIVgag区核酸片断，筛选扩增灵敏度最高的三个扩增片断。其引物组合扩增样本核酸PCR产物经凝胶电泳观察判断结果。结果该方法的敏感性为94．17％，特异性为100％，三个片断扩增灵敏度分别为76．67％、87．5％、69．17％。结论PCR扩增HIV前病毒保守区多个基因片断，具有较高的灵敏度和特异度，方法简单，可以应用到HIV感染的早期诊断中。     

大鼠细小病毒双重PCR检测方法的建立

目的 建立快速检测大鼠细小病毒的PCR方法.方法 根据大鼠细小病毒基因序列的特点,建立鉴别检测大鼠细小病-(RPV)与其他三种大鼠细小病毒(H-1、KRV、RMV)的双重PCR方法.根据RPV核酸序列的性质,在VP2基因筛选了一对用于特异扩增RPV株的引物,在NS1基因设计了一对用于特异性扩增H-1,KRV和RMV的引物.结果 两对引物组成的二重PCR方法可以特异性的扩增RPV而不扩增核酸同源性高的小鼠细小病毒和多种其他病原微生物;敏感性实验表明,二重PCR的最低检测限可达1 000拷贝/μL.双重PCR结合测序在检测23份临床样本中,检测出7份RMV阳性,包括1份与RPV共感染阳性样本.结论 本研究建立的检测RPV的双重PCR方法具有特异性好、灵敏度高及操作简单等优点,是一种简便、可靠的检测方法.     

CHIKV Real-time PCR检测方法的建立及试剂盒研发

目的建立快速特异检测基孔肯雅病毒的Real-time PCR方法及试剂盒。方法根据发表在Genbank上15株基孔肯雅病毒基因序列全长,应用ClustalW2.0和DNAMAN8软件筛选出位于其E1基因上的种内保守种间特异的目的片段,并据此设计出最优引物。人工合成该基因片段并构建重组质粒,对重组质粒梯度稀释后,再利用SYBR Green I Real-time PCR的方法检测该特异基因的浓度,建立标准品曲线,用于临床上基孔肯雅病毒的早期诊断。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示,标准品的PCR扩增产物的电泳条带长度与目标条带一致,测序结果显示与目标条带序列一致,说明引物与阳性质粒性能良好。经优化确定CHIKV荧光定量PCR反应体系中最佳的引物浓度为350 nmol/L,最佳的反应条件为：50 ℃ 2 min;95 ℃预变性2 min;以95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min进行40个循环扩增,在72 ℃进行荧光采集。根据荧光定量PCR熔解曲线出现特异性单峰,并对黄病毒属成员登革病毒和寨卡病毒的检测为阴性,表明该检测方法特异性高;检测阈值达302 拷贝 ,显示敏感性好,重复试验的变异系数均小于0.1%,说明该实验设计稳定性良好。结论基于该方法的试剂盒具有特异性好、灵敏度高、重复性好、能够快速定量等优点,有利于临床上基孔肯雅病毒的早期诊断,具有良好的应用前景。     

输入性登革热的实验室诊断

目的通过实验室检测发现并确诊1例输入性登革热阳性病例。方法采用实时荧光(RT-PCR方法对病人血清进行检测,并对RT-PCR扩增产物进行核苷酸序列测定,检测结果使用BLAST进行比对;并采用间接ELISA法和捕获ELISA法分别检测登革热特异性抗体IgG、IgM。结果通过实时荧光RT-PCR方法检测出该病例呈登革热病毒核酸Ⅲ型阳性;对RT-PCR扩增产物进行序列比对,结果显示与登革病毒III型同源性很好;ELISA法检测登革热特异性抗体IgG、IgM均为阴性。结论通过实验室确诊,该病例为登革热阳性病例。