重组酶介导等温扩增技术检测疟原虫方法的建立和评价

目的 建立一种重组酶介导等温扩增技术（RAA）检测疟原虫的方法。方法 针对疟原虫属保守18S小亚基核糖体RNA （18S rRNA）基因设计特异性引物,筛选确定最佳引物对组合并建立疟原虫重组酶介导核酸等温扩增体系。通过该RAA体系检测疟原虫标准质粒、4种疟原虫[恶性疟原虫( Plasmodium falciparum, P.f )、间日疟原虫( P. vivax, P.v)、三日疟原虫( P. malaria, P.m)、卵形疟原虫( P. ovale, Po)]病原体以及其他6种输血传播寄生虫（婴儿利士曼原虫、杜氏利士曼原虫、刚地弓形虫、溶组织阿米巴虫、犬吉氏巴贝西虫、田鼠巴贝虫）,以评估该体系的灵敏度和特异度。 结果 筛选出一组扩增效果较好的引物对,整个RAA体系使用最佳引物对在37 ℃,20 min即可完成扩增,对标准质粒的检测下限为10^-2 copies/μL,恶性疟原虫、间日疟原虫和卵形疟原虫为10² copies/μL,三日疟原虫为10 copies/μL。RAA检测体系未与其他输血传播寄生虫产生交叉反应,特异性良好。应用RAA方法检测外籍学生献血者标本,结果与荧光定量PCR结果一致。结论 成功建立了一种快速、简便和特异的疟原虫RAA检测方法,将会给血液筛查和一些基层偏远医院的临床检测提供很大帮助。     

沙门菌荧光重组酶介导等温扩增检测方法的应用研究

目的 建立基于重组酶介导等温扩增（recombinase-aided amplification, RAA）快速、灵敏、特异检测沙门菌的方法。方法 针对沙门菌invA基因保守区段设计特异性引物、探针,通过引物、探针筛选以及反应条件优化,建立检测沙门菌的荧光RAA方法,通过优化引物浓度、探针浓度、醋酸镁浓度、上样量来确定最佳反应体系组成。采用细菌纯培养物评估该方法的最低检测限、特异性等性能,通过模拟样品以及19份真实样品检测,同时采用国标法GB 4789.4-2016同步验证复核,评估该检测方法的可靠性。结果 该方法在39 ℃条件下20 min内可完成检测反应。利用该方法能够特异检测沙门菌,不能检出其他肠道致病菌。该方法检测细菌纯培养物的灵敏度为19 cfu/mL,检测模拟样品的灵敏度为190 cfu/mL。采用建立的沙门菌荧光RAA方法对采集的环境样品、食品污染及人体肛拭子样品共计19份进行检测,按照GB 4789.4-2016方法同步检测,4份阳性,其中3份样本荧光RAA检测呈现沙门菌阳性,1份肛拭子样本该方法未能检出。结论 荧光重组酶介导等温扩增法检测沙门菌快速、特异、简便、灵敏,能够在食源性疫情现场调查以及食源性疾病监测中发挥一定的作用。     

环介导等温扩增技术检测间日疟原虫方法的建立及应用分析

目的建立一种快速、简便的检测间日疟原虫的环介导等温扩增方法(LAMP)并与常规PCR方法作比较。方法根据间日疟原虫环子孢子蛋白(CSP)基因序列合成2对特异性LAMP引物,优化Mg2+浓度、dNTPs浓度、BstDNA聚合酶添加量、反应温度、时间以及设计引物缺省试验。评估优化后的LAMP反应的特异性和灵敏性。检测133份患者血样,以显微镜检方法为金标准,比较LAMP和多重PCR法检测间日疟原虫的敏感性和特异性。结果 LAMP法检测重组质粒DNA(Pv-rDNA)的灵敏度达到10-10,为传统PCR方法的100倍。镜检确诊的68例间日疟、43例恶性疟和22例非疟疾患者中,LAMP法和多重PCR检测间日疟原虫的敏感性为98.53%和97.06%,两法基本相当(χ2=0.34,P>0.05);特异性为86.15%和100%,LAMP法低于多重PCR法,差异有统计学意义(χ2=9.67,P<0.05)。LAMP法的阳性预测值和阴性预测值分别为88.16%和98.25%,多重PCR的阳性预测值和阴性预测值分别为100%和97.01%。结论 LAMP法检测间日疟原虫具有快速简便、敏感性高、设备要求低的特点,具有较好的应用前景。     

基于环介导等温扩增技术快速鉴定宽体金线蛭

[目的] 建立中药材宽体金线蛭的环介导等温扩增（LAMP）检测技术,实现对宽体金线蛭及其常见混伪品的快速检测。[方法] 针对宽体金线蛭线粒体细胞色素氧化酶I（COI）的基因序列设计LAMP引物。在64℃恒温条件下,用设计的LAMP引物组对水蛭进行LAMP扩增。[结果] LAMP反应结束后,宽体金线蛭均扩增出梯状条带,对照组无条带产生。加入0.2 μL荧光染料10 000×SYBR Green Ⅰ后,宽体金线蛭反应液在自然光下呈绿色（阳性）,对照组呈橙色（阴性）。将加入了0.2μL 10 000×SYBR Green Ⅰ的扩增产物置于紫外灯下观察,结果宽体金线蛭在紫外光下呈绿色荧光（阳性）,对照组无绿色荧光产生（阴性）。[结论] 利用LAMP技术可实现宽体金线蛭及其常见混伪品的快速鉴别,为水蛭中药材的现场鉴别提供技术支撑。     

环介导等温扩增法检测孕妇血清中单纯疱疹病毒Ⅰ型方法的建立

目的建立稳定、可靠的环介导等温扩增法（LAMP）快速检测孕妇血清中单纯疱疹病毒Ⅰ（HSV-Ⅰ）DNA的方法。方法通过对影响LAMP反应体系的几个主要因素进行优化,确定最佳反应条件,并对其特异性、灵敏度及可靠性进行评判。结果 LAMP检测HSV-Ⅰ DNA的最佳反应条件：甜菜碱和Mg2＋的终浓度分别为1.0mol/L和10mmol/L,于62℃恒温反应1h。扩增产物可被Hinf Ⅰ消化,理论上检测下限可达10个拷贝,与定量PCR相比符合率达94.5%。结论本实验建立的LAMP检测HSV-I的方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等特点,适合基层用于HSV-Ⅰ筛查。     

荧光环介导等温扩增检测化脓性链球菌sdaB方法的建立

目的 建立荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测化脓性链球菌毒力基因sdaB的方法。方法 根据GenBank公布的化脓性链球菌sdaB基因保守序列(GenBank:69901515),使用引物设计软件Primer Explorer V5.0获得LAMP引物。在LAMP体系中加入荧光染料,对引物、MgSO₄、甜菜碱、脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate, dNTP)、Bst DNA聚合酶的使用浓度进行了筛选,MgSO₄浓度范围为0～12 mmol/L、甜菜碱浓度范围为0～2.4 mol/L、dNTP浓度范围为0.2～2μmol/L、上游内部引物(forward inner primer, FIP)和下游内部引物(backward inner primer, BIP)浓度范围为0.2～2μmol/L、上游外部引物(forward outer primer, F3)和下游外部引物(backward outer primer, ...     

荧光定量环介导等温扩增技术检测恶性疟原虫方法的研究

目的建立一种简便、快速和高灵敏度的恶性疟原虫的荧光定量环介导等温扩增检测方法。方法针对恶性疟原虫环子孢子蛋白（CSP）种属特异性基因保守区域8个位点设计3对引物,同时使用PCR法扩增恶性疟原虫219bp保守序列,经克隆后转化入工程菌株JM109感受态细胞中并提取重组质粒作为模板。以探索建立恶性疟原虫荧光定量环介导等温扩增检测技术,并对其试验重复性、灵敏度、特异性及适用性子以评估。结果在重组质粒浓度为1．06×10^4∽10^9拷贝／反应的范围内,标准曲线循环阈值与模板浓度有良好线性关系（相关系数0．9995）,CT值变异系数为6．29％,无非特异性扩增,初步临床试验结果表明,试验的灵敏度为90．00％,特异度为93．33％,准确性为91．67％,试验可在30min内完成。结论荧光定量环介导等温扩增技术检测恶性疟原虫简便、快速、敏感,具有广阔的应用前景。     

环介导等温扩增技术及其应用

环介导等温扩增法（LAMP）是一种新的核酸扩增法.该方法在一定温度下一步即可完成扩增反应.由于其扩增效率极高、反应简单快速、高特异性和反应结果只需肉眼观察的特点,LAMP法已广泛应用于病毒、细菌等的定性定量检测和临床疾病的诊断.本文介绍了LAMP方法的原理及其在微生物分子检测方面的应用.     

环介导等温扩增快速检测HIV一1DNA病毒

目的建立一种快速、敏感度高的HIV．1DNA病毒检测方法。方法针对HIV一1型病毒序列的特点寻找6个相对保守的区域设计4条环介导等温扩增（LAMP）引物,建立HIV一1DNA—LAMP快速检测方法,并评价其特异性和灵敏度。结果200例HIV感染者外周淋巴细胞中,应用LAMP法检测出195例HIV一1DNA阳性（阳性率为97．5％）,50例健康对照结果阴性。采用10倍稀释法,LAMP技术的最低检出限为50copies／m1的HIV一1DNA病毒。对乙型肝炎病毒、疱疹病毒、丙型肝炎病毒进行交叉实验结果均为阴性。结论LAMP是一种快速、敏感度高、特异性强的方法,适合各级医院的临床检测。     

环介导等温扩增技术在寄生虫分子诊断、检测中的应用

环介导等温扩增技术应用4条不同的引物特异地识别目标基因上的6段区域,在一个恒温的环境中进行链置换反应,是一种简单、快速、特异、敏感并且低成本的对已知基因的检测方法.本文就环介导等温扩增技术的原理及其在寄生虫分子诊断和检测中的应用作一综述.     

淋病奈瑟菌porA基因实时荧光环介导等温扩增方法的建立

目的 运用实时荧光环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种快速准确检测淋球菌的方法,以期用于淋病的早期临床诊断.方法 以淋球菌porA为靶基因,设计保守性和特异性良好的引物,以淋球菌标准菌株基因组DNA为模板,进行LAMP扩增,用23种其他在生殖系统中存在的微生物验证其灵敏度和特异性.结果 实时荧光LAMP法可检测到1 pg/μl(103CFU/ml)淋球菌基因组DNA,稳定性良好,其针对23种其他在生殖系统中存在的微生物均不能扩增,porA引物对淋球菌高度特异,阳性结果15 min可快速检出.结论 成功建立了检测淋球菌porA的LAMP技术,为淋球菌的快速检测提供了新的手段,有望成为淋球菌常规检测的简便方法.     

重组酶聚合酶扩增技术在寄生虫快速检测中的应用

重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)是一种新型核酸等温扩增技术,具有特异性强、灵敏度高、恒温反应、操作简单和耗时短等优点.该技术自2006年面世以来,被逐渐应用于医学、食品安全、公共卫生和农业生产等领域.寄生虫病不仅会影响人畜健康,还阻碍经济发展,带来严重...     

环介导等温扩增技术在疾控机构微生物检测中的应用

环介导等温扩增技术(LAMP)是一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术,具有特异性强、灵敏度高、快速简便等优点.本文综述了近年来LAMP在微生物检测领域的具体应用实例和研究进展,并对其应用前景做了展望.     

环介导等温扩增技术在诊断结核病中的研究进展

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术是利用两对特殊设计的引物和链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下对目的片段进行特异、高效扩增的技术。LAMP技术具有简单、快速、特异、灵敏、经济等优点,因此在结核分枝杆菌的现场快速检测和基层应用中具有广阔前景。基于此,本文主要阐述了LAMP 技术的基本原理和特点、诊断结核病的主要分子标志物,以及利用不同的分子标志物和各种类型的新型技术在诊断肺结核、肺外结核、耐药性结核病中的应用。LAMP 技术在诊断结核病中已经得到了广泛的应用,且具有较高的灵敏性和特异性,但该技术仍存在部分缺陷。本文综述了近年来LAMP 技术在结核病中的应用进展,并对其发展前景进行了展望,以期在资源有限的环境中为结核病的快速诊断提供合理的研究方向。     

环介导等温扩增技术在寄生虫检测中的应用研究

随着分子生物学技术的快速发展,以检测核酸为基础的分子生物学技术如PCR、再生式序列复制以及链置换扩增技术等广泛应用于医学和生物学等领域,在病原体的检测以及疾病诊断方面发挥着重     

环介导等温扩增技术的研究进展和微生物检测应用

环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种新型的核酸扩增技术。本文概述其反应原理、技术特点、相关技术、微生物检测应用及发展前景。     

基于环介导等温扩增技术建立的假丝酵母菌快速检测方法

目的  基于环介导等温扩增技术（LAMP）建立一种假丝酵母菌的快速检测方法。方法  依据假丝酵母属18 S rDNA基因保守序列,采用Primer Explorer V4软件设计引物,建立LAMP扩增方法和反应体系,对体系的4种关键参数和3项性能指标进行优化和探讨,并用临床样本进行方法验证。结果  6种常见假丝酵母菌LAMP法检测均为阳性;最适扩增条件为：温度63～65℃、Bst酶活性4 IU、Mg2+浓度4 mol/L、扩增时间1 h;7种对照菌种及人全血DNA样本LAMP扩增结果均为阴性;检测限为102～107 CFU/ml。经52例临床样本验证,该法敏感性为100%,特异性为95%。结论  该研究建立的LAMP假丝酵母菌检测方法具有实用、简便、快速、特异和敏感的特点,可为临床提供一种新的假丝酵母菌诊断方法。

     

重组腺病毒介导的CTLA-4Ig基因在人源性细胞中的表达

目的：了解CTLA－4Ig重组腺病毒在不同人细胞中的转染能力及表达效率，为其器官转染研究及其治疗应用奠定基础。方法：用所构建的CTLA－4Ig腺病毒感染培养的HeLa细胞，人成纤维细胞，人脐静脉内皮细胞，应用免疫组化检测CTLA－4Ig的表达情况，结果：与重组腺病毒共培养6h使HeLa细胞获得转染，12h开始表达，36h表达达高峰；人成纤维细胞8h获得转染，24h开始表达，60h后达高峰，人脐静脉内皮细胞4h获得转染，12h开始表达，36h后达高峰。结论：CTLA－4Ig重组腺病毒能高效转染HeLa细胞，人成纤维细胞，人脐静脉内皮细胞。     

环介导等温扩增技术检测铜绿假单胞菌的研究

用环介导等温扩增技术(LAMP)快速、灵敏地检测铜绿假单胞菌.利用铜绿假单胞菌gbca基因,特异性设计3对LAMP引物,在反应体系中添加羟基萘酚蓝(HNB)荧光染料,通过反应前后颜色的变化肉眼观察结果,并用琼脂糖凝胶电泳加以验证.对临床标本利用LAMP和PCR法平行检测,验证该法灵敏度、特异性.针对铜绿假单胞菌DNA特异性引物的LAMP法可以扩增,其他无扩增产物.本实验建立的LAMP法具备简便、快速、特异性强和灵敏度高的特点,适于实际应用.