大鼠肝星状细胞的分离、培养与鉴定

目的:改进大鼠肝星状细胞的分离、培养方法,提高其分离质量。方法:取成年雄性Wistar大鼠,用链蛋白酶、胶原酶体内门静脉灌注消化大鼠肝脏细胞,经Nycodenz密度梯度离心分离肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活力,Desmin免疫细胞化学染色鉴定细胞纯度。结果:肝星状细胞得率为2.8×107/肝。肝星状细胞存活率在90%以上。Desmin阳性细胞原代培养达90%以上,传代培养达95%以上。结论:改良大鼠肝星状细胞的分离、培养方法,有利于原代大鼠肝星状细胞的生物学研究。     

大鼠肝星状细胞和枯否细胞的分离与培养方法

目的建立一种可以同时分离大鼠肝星状细胞(HSC)和枯否细胞(KC)的方法。方法选用SD大鼠,经胶原酶和蛋白酶灌注肝脏后,用18%Nycodenz密度梯度离心,分离大鼠HSC和KC,HSC处在界面,KC处在界面下。常规台盼蓝染色行细胞活力鉴定;荧光显微镜下观察自发荧光确定HSC的纯度;KC免疫细胞化学检测。结果成功分离大鼠肝星状细胞和枯否细胞,HSC得率为2×107/肝,KC得率为(3~6)×106/肝,活性>90%,纯度>90%。结论该方法建立的HSC和KC同时分离培养的方法,简单、易行、可靠,细胞纯度高,同时获得的细胞可保持良好的生物学性状。     

分离日本血吸虫感染小鼠模型肝星状细胞的改良方法

目的提供适用于日本血吸虫感染小鼠模型活化后肝星状细胞分离的新方法,并确定最适宜的密度分离液浓度。方法构建日本血吸虫感染BALB/c小鼠模型,对小鼠模型分别进行经下腔静脉逆行灌注和门静脉顺行灌注,充分完全消化小鼠肝脏,获得肝脏细胞悬液。利用Optiprep密度梯度离心法逐步纯化获得活化的原代肝星状细胞。通过流式分选法和Real-time PCR验证实验结果,统计分析通过不同浓度分离液密度获得的肝星状细胞数量和纯度。结果当分离液密度分别为13.5%、15.0%、16.5%和18.0%时,富集到的肝星状细胞数量依次升高,肝星状细胞的纯度分别可达56.1%、90.3%、75.9%和71.1%。比较流式分选法得到的细胞与本实验得到的原代肝星状细胞纯度,二者间差异无统计学意义(P0.05)。结论改良后的实验方法可在日本血吸虫感染小鼠模型中高产量地分离出活化的高纯度原代肝星状细胞,且更加经济便捷、实验结果稳定。     

大鼠肝星状细胞的分离培养及鉴定

目的　研究肝损伤后细胞基质的沉积及纤维化形成机制 ,建立一套经济、简便、可靠的分离大鼠肝星状细胞的方法。方法　采用胶原酶、链霉蛋白酶循环灌流法分离大鼠的肝星状细胞 ,18%Nycodenz密度梯度离心纯化肝星状细胞 ,采用免疫组织化学方法鉴定Desmin阳性细胞的纯度。结果　每只鼠肝约获取 3 .6× 10 7个星状细胞 ,活率、纯度平均为 95 .4%、95 %。结论　本方法建立了有效的大鼠肝星状细胞的分离和培养方法。     

两种不同纯化大鼠胰岛细胞方法的比较

  目的 比较分析OptiPrep和Ficoll两种介质纯化大鼠胰岛细胞的效果。方法 将24只SD大鼠随机分成2组,采用明尼苏达大学改良方法提取大鼠胰岛细胞,消化分离胰岛细胞后,分别采用不连续密度梯度Ficoll离心法和OptiPrep离心法纯化胰岛,比较纯化后胰岛细胞数量、纯度、存活率及功能,观察OptiPrep和Ficoll两种介质对大鼠胰岛纯化效果的影响。结果 与 Ficoll组相比,OptiPrep组胰岛细胞的产量（分别为304±13.57和346±9.09）和纯度（分别为88.25%±2.22%和94%±0.82%）均显著增加（P0.05）。 结论 OptiPrep法纯化大鼠胰岛比传统的Ficoll法更有优势,而且OptiPrep价格相对便宜,可以作为纯化大鼠胰岛的常规方法。     

大鼠肝星形细胞、枯否细胞的同步分离培养与鉴定

目的:建立经济、简便的同步分离培养肝星形细胞及枯否细胞的方法。方法:应用胶原酶和蛋白酶对大鼠肝脏进行原位灌流、消化,获得大鼠肝脏非实质细胞,经18%(W/V)的Nycodenz密度梯度离心,一步分离肝星形细胞及枯否细胞;肝星形细胞处在界面,枯否细胞则处在界面下;台盼蓝染色鉴定细胞活力;Desmin免疫细胞化学染色鉴定肝星形细胞;溶菌酶免疫细胞化学染色鉴定枯否细胞。结果:该方法分离的肝星形细胞和枯否细胞的纯度达95%左右。肝星形细胞得率(3.0±0.5)×107/肝,枯否细胞得率(4.0±0.5)×106/肝。结论:应用Nycodenz一步密度梯度离心法可以很好的同时分离肝星形细胞和枯否细胞。     

长爪沙鼠肝星状细胞的分离培养与鉴定

目的探索长爪沙鼠稳定、经济的肝星状细胞分离和培养方法,为深入探讨长爪沙鼠肝纤维化的细胞机制提供技术支撑。方法取成年雄性长爪沙鼠,用链蛋白酶、胶原酶及DNA酶体内门静脉灌注消化长爪沙鼠肝脏细胞,经Nycodenz密度梯度离心,分离肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活力,α-SMA,Desmin免疫细胞化学染色鉴定细胞性质。结果肝星状细胞得率为0.5~1×107/肝。肝星状细胞存活率在90%以上。原代培养3 dα-SMA阳性细胞达75%以上,传代培养后,α-SMA,Desmin阳性达100%。结论成功建立了稳定可靠的长爪沙鼠肝星状细胞分离培养方法,为肝脏相关疾病研究和防治药物的开发提供了技术支持。     

Optiprep法分离大鼠肝星状细胞的实验研究

目的：建立一种合理、经济、便捷的大鼠原代肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSC）分离方法。方法：运用改良肝脏原位灌注D-Hanks后,改用Ⅳ型胶原酶和DNA酶Ⅰ离体灌注,10%、16%Optiprep密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞,台盼蓝排斥试验鉴定细胞活力,α-SMA免疫细胞化学法鉴定细胞纯度。结果：我们采用Optiprep密度梯度离心法成功分离出大鼠HSC,且活力、纯度均达到研究要求,HSC得率约为2×107/肝,细胞存活率为95%以上,纯度为90%以上。结论：本方法分离大鼠HSC合理、经济、便捷。     

应用Percoll分离纯化组织工程用肌卫星细胞

目的探讨应用改良Percoll非连续密度梯度离心法分离纯化培养组织工程用肌卫星细胞。方法分别采用差速贴壁法和Percoll非连续密度梯度离心法进行兔肌卫星细胞的原代培养、光镜及扫描电镜检查细胞形态,通过免疫细胞化学染色方法鉴定培养细胞纯度,噻唑蓝法测定细胞生长曲线。结果差速贴壁法所得细胞纯度为30%~40%,Percoll非连续密度梯度离心法所得细胞纯度在90%以上,两种方法光镜及电镜检查均符合卫星细胞形态,细胞生长曲线显示细胞生长状况良好。结论应用Percoll非连续密度梯度离心法可以得到高纯度的肌卫星细胞,可以作为组织工程用种子细胞的培养方法。     

大鼠原代肝星状细胞的分离方法研究

目的 探讨分离肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)的有效方法.方法 采用链霉蛋白酶E (pronase E)和胶原酶(collagenase)灌注消化大鼠肝脏,12%Nycodenz密度梯度离心方法分离大鼠原代肝星状细胞.结果 原代肝星状细胞的细胞得率4×107/只大鼠,纯度为95%~98%,存活率96%.结论 肝脏消化酶灌注结合Nycodenz密度梯度离心是一种稳定的分离培养肝星状细胞的方法.     

大鼠肝星状细胞的简易分离法

目的在肝脏二步酶灌注法分离大鼠肝星状细胞的基础上,探讨一种简单易行且结果稳定的分离方法。方法采用大鼠肝脏二步酶灌注法对成年大鼠的肝脏进行消化,经密度梯度离心去杂质后得到肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活率,结蛋白(Desmin)免疫荧光鉴定肝星状细胞的纯度。结果肝星状细胞的得率为4.0×107以上,肝星状细胞纯度为96%左右,肝星状细胞存活率为(95.0±1.2)%。结论本实验采用的大鼠肝星状细胞的分离方法,结果稳定,细胞纯度较高,有利于进一步的生物学研究。     

大鼠肝星状细胞分离与培养方法的实验研究

目的：探讨一种经济易行的分离与培养大鼠肝星状细胞的方法,为研究肝纤维化的发病机制提供良好条件。方法：采用离体循环酶液灌注法对成年大鼠的肝脏进行消化,经两种密度的Nycodenze密度梯度液高速离心（20000r/min）和细胞悬液低速离心（40×g）去杂质后得到肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活率,desmin和GFAP免疫细胞化学双抗单染色法鉴定肝星状细胞的纯度。结果：肝星状细胞的得率为（3.6±0.1）×10^7/肝,肝星状细胞存活率为（92.8±0.8）%,对培养24h的肝星状细胞行desmin和GFAP共同鉴定DAB显色,细胞阳性率为（96.2±0.5）%。结论：本改良法在保证大鼠肝星状细胞产量的前提下提高了细胞纯度,有利于对原代大鼠肝星状细胞及肝纤维化的进一步研究。     

原位循环灌流法分离大鼠肝星状细胞

目的：为深入探讨肝纤维化的细胞机制，探索经济、稳定的肝星状细胞分离和培养方法。方法：采用胶原酶原位循环灌流法分离大鼠肝星状细胞，１８％Ｎｙｃｏｄｅｎｚ密度梯度离心纯化星状细胞。结果：星状细胞的得率为１×１０７～３×１０７／肝，纯度为９０％，存活率为９６％。结论：原位循环灌流法是有效的大鼠肝星状细胞的分离和培养方法。     

小鼠肝枯否细胞的分离、培养与鉴定

目的研究BALB/c鼠肝枯否细胞分离、培养和鉴定。方法选用健康雌性8￣10w龄鼠,麻醉无菌取肝,D-Hank’s液注射冲洗去血并剪去部分结缔组织,剪碎肝组织,加入链霉蛋白酶E和I型胶原酶,水浴振荡消化,再加入DNaseI,共同消化。不锈钢筛网滤过,用0.005%DNaseⅠ的1640液清洗细胞液,加Tris-NH4CL溶解红细胞。30%￣70%Percoll梯度离心,用含10?S的RPMI-1640贴壁培养4￣6h洗去非贴壁细胞。通过吞噬墨水实验鉴定枯否细胞。结果枯否细胞的数量为(1.07±0.87)×107/g,贴壁率40.3%,用0.4%台盼蓝染色鉴定,细胞存活率在95%以上,吞噬实验发现90%的贴壁细胞具有吞噬功能,即KC的纯度可达90%。贴壁的枯否细胞的形态多样,已经完全伸出了伪足并且伸展贴壁,呈多边形、多角形或者梭形等不规则形状,并且胞浆内可见吞噬的微粒状物质。结论酶消化水浴振荡法结合梯度离心和贴壁培养是分离BALB/c鼠枯否细胞的可靠方法,为进一步实验打下了基础。     

分离、鉴定与培养大鼠肝细胞、肝星状细胞和Kupffer细胞

目的：建立稳定的同时分离原代大鼠肝细胞（HC）、肝星状细胞（HSC）和Kupffer细胞（KC）的方法,并初步评估其在体外培养的特征。方法：通过胶原酶原位灌注获得肝脏单细胞悬液,随后行等密度离心结合选择性贴壁纯化肝脏原代细胞,细胞的产量和活力经自动细胞计数仪计算出,纯度经免疫荧光、特殊染色及吞噬等实验进行鉴定。结果：大鼠原代HC产量为（21.0±8.2）×106/g肝组织,活力为92.1%±2.1%,纯度为96.5%±2.2%;原代HSC产量为（2.5±0.8）×106/g肝组织,活力为90.1%±3.8%,纯度为93.1%±1.5%;原代KC产量为（4.1±1.2）×106/g肝组织,活力为96.2%±2.7%,纯度为95.1%±1.4%。分离的HC、HSC和KC适合体外长期培养。HSC在体外培养过程中失去维生素A,逐渐向成纤维细胞表型转变。KC在体外可增殖,至14 d时仍表达CD68,具有较强的吞噬能力。结论：成功建立同时分离和培养大鼠HC、HSC和KC的方法,为进一步研究肝脏病理生理提供细胞基础。     

一种可靠的大鼠肝星状细胞分离及培养方法

目的 探讨一种高效、经济、稳定的肝星状细胞的分离方法,为肝纤维化研究提供细胞模型.方法 应用链霉蛋白酶、胶原酶灌流,以Nycodenz为分离介质,采用密度梯度离心法分离大鼠的肝星状细胞.结果 肝星状细胞的获得率为（3.2±0.67）×107/只、存活率为90%以上.结论 该法是一种较理想的分离肝星状细胞的方法.     

SD大鼠肝脏枯否细胞分离方法改进研究

目的：研究一种简单、高效、实用并且稳定的SD大鼠肝脏原代枯否细胞( KCs)的提取及培养方法。方法选择体质量200 g左右的健康SD雄性大鼠,采用0．05% IV型胶原酶在体原位灌注法结合剪碎法,37℃水浴振荡20 min,经30%和60%Percoll密度梯度离心后,再经40% Percoll离心及贴壁法纯化提取KCs。倒置显微镜下观察细胞形态,并用台盼蓝染色实验鉴定细胞活力,吞墨实验观察细胞吞噬功能及流式细胞术鉴定细胞纯度。结果每只大鼠平均肝脏KCs的获得量为(1．00±0．20)×107(n=20),细胞活力为(92．34±0．15)%,细胞纯度均在(93．56±0．24)%。结论改良的SD大鼠肝脏KCs提取方法操作简单,效果可靠,可为今后KCs的研究奠定基础。     

小鼠肝枯否细胞的分离、培养与鉴定

目的研究BALB／c鼠肝枯否细胞分离、培养和鉴定。方法选用健康雌性8—10w龄鼠，麻醉无菌取肝，D—Hank’s液注射冲洗去血并剪去部分结缔组织，剪碎肝组织，加入链霉蛋白酶E和Ⅰ型胶原酶，水浴振荡消化，再加入DNase Ⅰ，共同消化。不锈钢筛网滤过，用0．005％DNase Ⅰ的1640液清洗细胞液，加Tris—NH4CL溶解红细胞。50％-70％Percoll梯度离心，用含10％FCS的RPMI-1640贴壁培养4—6h洗去非贴壁细胞。通过吞噬墨水实验鉴定枯否细胞。结果枯否细胞的数量为（1．07±0．87）×10^7／g，贴壁率40．3％，用0．4％台盼蓝染色鉴定，细胞存活率在95％以上，吞噬实验发现90％的贴壁细胞具有吞噬功能，即KC的纯度可达90％。贴壁的枯否细胞的形态多样，已经完全伸出了伪足并且伸展贴壁，呈多边形、多角形或者梭形等不规则形状，并且胞浆内可见吞噬的微粒状物质。结论酶消化水浴振荡法结合梯度离心和贴壁培养是分离BALB／c鼠枯否细胞的可靠方法，为进一步实验打下了基础。     

胰蛋白酶和胶原酶灌注法分离提取小鼠原代肝细胞的比较

目的：胰蛋白酶和胶原酶灌注法分离提取小鼠原代肝细胞的比较。方法：改良Seglen两步灌注法,选用胰蛋白酶和胶原酶D分别对同批生长的10～16周C57BL/6J雄性小鼠进行在体灌注分离肝实质细胞,比较分离肝细胞的存活率、纯度、形态、活性、获取数量等。结果：两种方法分离得到的小鼠原代肝细胞的存活率和纯度均达到90%以上,且在形态学上无明显差异,不同培养时间的细胞活性基本一致。胶原酶灌注法所得到的细胞数量多于胰蛋白酶灌注法。结论：胰蛋白酶和胶原酶灌注法均适用于分离提取小鼠原代肝细胞,可根据实验条件选择不同的灌注方法。     

小鼠肝星状细胞分离方法的优化

目的：建立一种高效稳定的小鼠肝星状细胞的分离方法,为进一步研究肝纤维化的机制奠定基础。方法：采用Ⅳ型胶原酶灌注消化法分离肝星状细胞,省略链酶蛋白酶的使用,利用肝星状细胞密度低的特性,使用Nycodenz进行梯度密度离心。结果：同时分离两只小鼠,使得细胞得率大大提高,细胞存活率和活力也能满足后续实验。结论 ：同时分离两只小鼠解决了细胞得率低的难题,建立了一种稳定高效的分离方法。