miR-21诱导犬BMSCs骨向分化的体外实验研究

目的 体外研究检测miR-21诱导拉布拉多犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的作用.方法 构建LentimiR-21-Luciferase与Lenti-LacZ-Luciferase慢病毒载体,分别转染犬BMSCs,将研究分为miR-21组与LacZ组.利用体外细胞划痕实验来比较转染后BMSCs的爬行迁移能力.在转染后的第0、1、4、7、14天分别提取miR-21组与LacZ组BM-SCs的mRNAs和蛋白.通过Real time-PCR技术和Westernblot检测成骨分化关键因子骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)的表达.结果 Lenti-miR-21-Luciferase与Lenti-LacZ-Luciferase慢病毒载体成功转入BMSCs后,miR-21组的BMSCs细胞爬行迁移能力显著增强(P＜0.001);Real time-PCR和Western blot结果显示,miR-21可以显著上调BMSCs成骨分化关键因子OCN和OPN的表达(P＜0.05).结论 miR-21可以显著促进BMSCs的成骨分化,为进一步的体内实验奠定基础.     

雌激素诱导 BMSCs 成骨分化机制的研究进展

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMO)是中老年女性的多发病、常见病,严重影响患者的生活质量。PMO 是由于卵巢萎缩、功能下降、雌激素水平降低引起成骨与破骨细胞功能失衡,进而导致骨质丢失加速、骨脆性增加、骨强度减低的一种骨代谢性疾病。根据其发病机制,临床上通过激素替代疗法(hormone replacement therapy,HRT)对 PMO,已经获得了良好的效果。其中雌激素是 HRT 治疗的重要组成部分。雌激素具有广泛的生物学效应,对细胞的迁移、增殖和分化均有影响。同时,雌激素也是骨骼系统中重要的调节因子。有研究表明[1],雌激素可以诱导干细胞向成骨细胞分化,进而影响骨重建过程。近年来,雌激素通过调控干细胞成骨分化治疗骨质疏松的相关研究备受关注。     

miR-152-3p通过调控DUSP1对激素性股骨头坏死BMSCs成骨分化的作用研究

目的 探讨miR-152-3p通过调控双特异性磷酸酶1(DUSP1)对激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的作用。方法 取健康人、激素性股骨头坏死患者骨髓组织进行BMSCs分离、培养及鉴定,检测miR-152-3p、DUSP1 mRNA表达及转染后检测各组细胞miR-152-3p、碱性磷酸酶(ALP)、骨形态发生蛋白2(BMP-2)mRNA表达,验证miR-152-3p与DUSP1的靶向关系,检测DUSP1、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)等蛋白表达。结果 与健康人BMSCs比较,激素性股骨头坏死患者BMSCs miR-152-3p mRNA表达升高,DUSP1 mRNA表达降低(P<0.05)。与空白组、对照组比较,转染组miR-152-3p mRNA表达降低,ALP、BMP-2 mRNA表达升高(P<0.05)。TargetScan软件分析发现,DUSP1 3′UTR含有miR-152-3p的结合位点。与对照组和空白组比较,转染组DUSP1 mRNA 3′UTR野生型荧光素酶报告质粒相对活性值降低,D...     

去分化间充质干细胞成骨再分化潜能的实验研究

目的:研究去分化间充质干细胞(de－differentiated mesenchymal stem cells,De－MSCs)成骨再分化能力?方法:以MSCs为对照,分别采用Cell Count Kit(CCK8)法?实时定量PCR(qPCR)?碱性磷酸酶(ALP)活性和茜素红染色法检测De－MSCs增殖能力?成骨相关基因?成骨再分化能力等?结果:De－MSCs可表达干细胞表面标志,在成骨培养基中增殖能力高于MSCs(P < 0.05),成骨相关基因(Runx2?Osterix?Bmp2)表达明显增加(P < 0.05),ALP活性检测发现De－MSCs明显高于MSCs组(P < 0.05),28 d后茜素红染色可见红色结节?结论:De－MSCs具备某些MSCs特征,但是体外再次成骨效率明显提高,De－MSCs可作为更优质种子细胞,为再生医学开拓新的思路?     

miR-26a对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的调控作用

 目的 利用小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化模型, 探讨 miR-26a 在成骨分化中的表达趋势及调控作用。方法 提取雌性C57/BL6J小鼠双侧下肢股骨骨髓分离培养BMSCs,诱导分化为成骨细胞,通过实时定量PCR检测miR-26a在BMSCs及其诱导分化细胞中的表达。使用miR-26a的促进物miR-RiboTM microRNA-26a mimics通过siPORTTMNeoFXTMagent转染试剂瞬时转染BMSCs并加入成骨诱导剂培养,并同时设立转染microRNA-26a mimics NC的对照组。培养7 d、14 d后,进行细胞形态、碱性磷酸酶（ALP）染色、钙盐结节（茜素红染色）等项目的检测。另外制造绝经后骨质疏松小鼠模型（OVX组）与假手术动物模型（sham组）,RT-PCR检测OVX组中miR-26a的表达。结果 miR-26a的表达在BMSCs向成骨分化过程中上升约25倍,成骨基因表达也随着诱导时间的增加逐渐升高。转染miR-26a mimics后的BMSCs在培养7d后逐渐由梭形变为多角形,与阴性对照组类似;ALP染色显示阴性对照组培养7 d后为阳性,而实验组在培养7 d时呈强阳性;茜素红染色显示实验组培养14 d后出现数量较多的钙盐沉积结节,而阴性对照组则较少。miR-26a mimics组成骨基因的表达均高于对照组。RT-PCR检测结果显示OVX组中miR-26a的表达低于sham组4倍。结论 miR-26a mimics的转染可以促进BMSCs的成骨分化潜能,在骨质疏松的环境中miR-26a表达下降,间接证实了miR-26a对小鼠BMSCs成骨潜能的促进作用。     

蛋白激酶CβⅡ负调控小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

目的观察蛋白激酶C(PKC)各亚型在小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化中的作用。方法Western blot检测小鼠BMSCs成骨分化中PKC各亚型的活化情况;利用PKC阻断剂GFX分析PKC在BMSCs体外成骨分化中的作用;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测成骨早期分化指标ALP的活性;茜素红染色检测BMSCs体外矿化能力;实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测成骨分化相关基因Runx2、Ⅰ型骨胶原a1(ColⅠa1)和ALP的表达情况。结果小鼠BMSCs成骨分化过程中,仅检测到PKCβⅡ亚型活化,其他亚型均无明显活化。利用PKC阻断剂GFX抑制PKCβⅡ活化后,茜素红染色结果显示BMSCs的成骨分化过程受到促进;PCR结果显示成骨分化相关基因Runx2、ColⅠa1和ALP的mRNA水平均有不同程度增加;ALP活性检测结果也显示BMSCs的成骨分化过程受到促进。结论PKCβⅡ可负调控小鼠BMSCs的成骨分化。     

BMP-2体外诱导OPG-/-小鼠BMSCs向成骨方向分化的实验研究

目的 探讨骨形成蛋白-2(BMP-2)对OPG-/-小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外定向诱导成骨的能力,评价BMP-2活性多肽的成骨诱导性及诱导成骨的剂量依赖性.方法 取OPG-/-小鼠股骨,分离骨髓基质细胞进行体外培养,传至P1代时改用条件培养基,在15％FBS培养条件下培养基中分别加入浓度为0.3 μg、0.2 μg、0.1 μg、0.05 μg、0μg的BMP-2,并依次记为A、B、C、D和E组.细胞培养至1、3、5、7d,PNPP法测定碱性磷酸酶(ALP)、钙试剂盒测定细胞钙含量、酶联免疫法测定细胞上清中抗酒石酸酸性膦酸酶5b(TRACP5b)的表达,检测不同浓度BMP-2活性多肽体外诱导成骨的能力.结果 ALP活性和钙含量检测显示,A组和B组较其他组增加明显(P＜0.05),但A、B组间比较差异无统计学意义( P＞0.05).TRACP5b检测显示,A、B、C组第3、5和7日TRACP5b表达均低于D、E组(P＜0.05),但A和B组差异不显著(P＞0.05).结论 BMP-2活性多肽能有效地促进OPG-/-小鼠BMSCs向成骨方向分化,其诱导作用存在剂量依赖关系,最佳诱导剂量为0.2 μg/ml.     

miR-338-3p通过靶向RUNX2负调控人骨髓间充质干细胞成骨分化且促进骨质疏松

目的:探讨miRNA-338-3p在骨质疏松症进展中的作用及其对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化的影响.方法:选择60例骨质疏松症患者为研究对象,另选同期60名非骨质疏松者作为对照组.检测两组血清miR-338-3p表达水平.采用RT-qPCR检测miR-338-3p、骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)和Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ)水平.Western blot检测miR-338-3p对RUNX2蛋白表达的影响;采用碱性磷酸酶(ALP)测定法和茜素红染色评估miR-338-3p和RUNX2对成骨分化和矿化能力的影响;采用生物信息学和荧光素酶报告基因检测验证miR-338-3p和RUNX2之间的关系.结果:骨质疏松患者血清miR-338-3p水平相比对照组表达量明显上升(P<0.05),且其表达随着成骨诱导时间的延长而逐渐降低(P<0.05).与对照组比较,miR-338-3p表达情况影响OCN、OPN和Collagen Ⅰ mRNA的水平(P<0.05).与对照组相比,miR-338-3p过表达削弱了hBMSCs矿化能力和ALP活性(P<0.05).双荧光素酶报告基因检测证实,RUNX2是miR-338-3p的直接靶点,miR-338-3p过表达降低了RUNX2蛋白及其mRNA的表达水平(P<0.05).RUNX2过表达可逆转miR-338-3p对hBMSCs成骨分化的抑制作用.结论:miR-338-3p通过靶向RUNX2负调控hBMSCs的成骨分化,从而促进骨质疏松的进展.     

miR-125b对人骨髓间充质干细胞成骨潜能的影响

目的观察抑制miR-125b的表达对人骨髓间充质干细胞（MSC）成骨潜能的影响。方法由健康青年男性髂骨取骨术中抽取骨髓分离培养MSC,将其诱导分化为成骨细胞,通过实时定量PCR检测miR-125b在MSC及其诱导分化细胞中的表达。然后进行miR-125b在MSC中的功能试验,使用miR-125b的抑制物GMR-mi RTM microRNAinhibitors通过RNAi-Mate转染试剂瞬时转染MSC,然后再加入成骨诱导剂进行培养,并同时设立转染microRNAinhibitor NC的阴性对照组。细胞培养7天后,进行细胞形态、碱性磷酸酶（改良钙钴法染色）、钙盐结节（茜素红染色）等项目的检测。结果 miR-125b的表达在MSC向成骨分化过程中呈明显下降。转染miR-125binhibitor后的MSC在培养7天后细胞形态逐渐由梭形变为多角形,与阴性对照组类似;ALP染色显示阴性对照组培养7天后为阳性,而试验组在培养7天就呈现强阳性;茜素红染色显示试验组培养7天后即出现了大小不等的钙盐沉积结节,而阴性对照组则暂未出现钙盐结节。结论 miR-125b inhibitor的转染可以促进MSC的成骨分化潜能,间接证实了miR-125b对人骨髓间充质干细胞成骨潜能的抑制作用。     

人骨髓间充质干细胞体外诱导培养成骨的实验研究

目的 观察人骨髓间充质干细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力。方法 抽取人骨髓组织，梯度离心后，保留贴壁细胞传代，稳定传代后改用含地塞米松、β—甘油磷酸钠和维生素C的诱导培养液，通过倒置显微镜观察、碱性磷酸酶染色、骨钙素免疫组化染色等方法进行观测。结果 原代人骨髓间充质干细胞10～12d左右即可长满，并可稳定传代，传代细胞5～6d即可传代，在诱导培养液中2周形成多层结构，并聚集成细胞钙化结节。诱导培养细胞碱性磷酸酶染色，骨钙素免疫组化染色阳性。结论 人骨髓间充质干细胞经合理的体外诱导培养后，符合成骨细胞的形态特征和生物学特性，可为体外构建组织工程化骨提供自体种子细胞。     

补肾方药诱导BMSCs骨向分化的研究述评

中医学理论认为“肾藏精,主骨生髓”,骨的生长与肾关系密切。骨髓间充质干细胞（BMSCs）主要存在于骨髓,与肾中精气一样,与人的生长壮老有着密切的关系。目前研究就单味中药及其单体、复方等不同方面探讨了补肾法对BMSCs骨向分化的影响,从“以药证效”的角度一定程度上阐明了＂肾主骨生髓＂理论的科学内涵,但仍存在一些亟待解决的问题：①补肾复方多采用血清药理学的方法,虽然其可较为客观地反应中药的药效,但成分复杂,其诱导BMSCs骨向分化的机制有待深入研究。②目前研究多集中于自拟方及临床效方,对经典补肾方的研究较少。③对于补肾方药促进成骨分化主要集中在检测一些成骨标志物如碱性磷酸酶、胶原、骨钙素等方面,对其产生具体作用的相关信号通路研究较少,有待于进一步研究。相信随着研究不断地深入,积极寻找有效促进成骨的药物,为中医药现代化及临床治疗提供帮助。     

慢病毒介导沉默NIPBL基因对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响

目的 探讨慢病毒介导沉默NIPBL基因对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响.方法 将第三代c57小鼠骨髓间充质干细胞分为实验组、阴性对照组、空白对照组.将慢病毒载体转染至小鼠骨髓间充质干细胞,倒置荧光显微镜观察慢病毒转染结果,Real-time PCR检测NIPBL基因表达情况.成骨诱导培养,检测碱性磷酸酶活性,应...     

不同牵张应力对大鼠BMSCs增殖和成骨分化作用

目的:考察牵张应力大小和作用时间对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和成骨分化的影响。方法:SPF级SD大鼠10只,分离培养并采用成骨和成脂分化法鉴定BMSCs。细胞分组设置为牵张应力加载大小(0.5%拉伸幅度,5%拉伸幅度,10%拉伸幅度、15%拉伸幅度)和作用时间(0.5h, 6h, 12h, 24h, 48h, 72h)。CCK-8法测定BMSCs增殖。BCIP/NBT法测定细胞碱性磷酸酶活性。茜素红和油红O染色法检测细胞成骨和成脂分化。结果:10%拉伸幅度的牵张应力作用12h,可最大提高BMSCs增殖速度1.53倍,高于5%和15%拉伸幅度组,差异具有统计学意义(P<0.01)。5%拉伸幅度的牵张应力作用48h,可最大提高BMSCs碱性磷酸酶表达4.2倍,提高BMSCs矿化结节形成65%,减少BMSCs形成脂滴32%,高于10%和15%拉伸幅度组,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:牵张应力拉伸幅度为10%作用时间12h促进BMSCs增殖效果最佳。牵张应力拉伸幅度为5%作用时间48h提高BMSCs碱性磷酸酶和矿化结节形成最显著,进而对BMS...     

不同糖浓度对颌骨骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 研究不同糖浓度对颌骨骨髓间充质干细胞（orofacial bonemesenchymal stem cells, OFMSCs）增殖和成骨分化的影响。方法 体外分离、培养OFMSCs,成骨、成脂、成软骨分化诱导及鉴定,并使用不同含糖量培养基（5.5、11、16.5、25、44 mmol/L）培养OFMSCs,以5.5 mmol/L基准糖浓度为对照组,其余组为实验组。采用CCK-8及流式细胞仪检测各组OFMSCs的增殖活性及增殖指数,OFMSCs成骨诱导后4、7 d检测碱性磷酸酶（ALP）活性,21 d进行茜素红染色及矿化定量分析,同时用RT-PCR检测3、7、14及21 d相关成骨基因Runx2、Osterix的表达。结果 培养的OFMSCs成骨诱导21 d后茜素红染色可见钙结节,成脂诱导14 d 后油红O染色可见红色脂滴,成软骨诱导14 d 后阿利新蓝染色可见蓝色胞浆;糖浓度在5.5～25 mmol/L促进OFMSCs的增殖,但随着糖浓度的继续增加（25～44 mmol/L）,OFMSCs的增殖活性受抑制;成骨诱导时,随着培养液糖浓度升高,ALP活性呈剂量依赖性降低（P Runx2、Osterix mRNA 表达量高于实验组（P Runx2、Osterix mRNA 表达量均出现先上调再下调的趋势。结论 在一定范围的糖浓度内,糖浓度升高可促进OFMSCs的增殖;而糖浓度升高对成骨分化呈抑制效应。     

内参基因GAPDH和β-actin在BMP9诱导的骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的表达情况

目的:观察常用内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和β肌动蛋白(β-actin)在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化过程中表达情况,以确定相关研究的内参基因。方法:检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)确定BMP9诱导的MSCs(包括C3H10、C2C12和MEF)向成骨分化;以real-time PCR分别检测0、1、3、5、7 d GAPDH和β-actin的m RNA表达水平;以Western blot检测GAPDH和β-actin蛋白。结果:(1)β-actin在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中m RNA表达水平逐渐升高,0 d与5 dβ-actin的m RNA表达量存在统计学差异(C3H10、C2C12和MEF的P值均为0.000,GAPDH的m RNA表达水平未见明显改变(P>0.05);β-actin蛋白表达量随成骨分化逐渐增加,而GAPDH蛋白表达未见明显变化。结论:在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中,GAPDH比β-actin更适合做内参。     

骨质疏松症抑制人间充质干细胞的成骨分化

摘 要: 【目的】 为研究患者来源干细胞成骨分化的差异性,选取临床诊断为骨质疏松症患者的骨髓干细胞进行成骨分化诱导? 【方法】 采用密度梯度离心法,从临床6名患者(骨质疏松症3人,非骨质疏松症3人)的腰椎骨髓血液中分离获得原代骨髓间充质干细胞,并体外扩增至3-4代后进行实验?成骨诱导液的成分包括地塞米松(100 nmoL/L),二磷酸抗坏血酸(0.05 mmoL/L),β-甘油磷酸钠(10 mmoL/L)溶解于含有100 mL/L胎牛血清的低糖DMEM中?通过测定hMSC的增值与碱性磷酸酶(ALP)含量反应干细胞成骨分化活性?定量PCR检测Runx-2?ALP及成骨标志基因osteocalcin(OC)和osteonectin(ON)表达水平;通过矿化结节茜素红染色确认并定量检测钙离子浓度?【结果】 比较两组干细胞增殖差异,骨质疏松组较非骨质疏松组降低,而ALP含量无显著差异?Q-PCR检测显示在第3?7天时,骨质疏松组Runx-2?ALP的mRNA表达水平均显著低于非骨质疏松组?骨质疏松组的成骨相关基因OC在3?7?14 d时mRNA表达水平均显著低于非骨质疏松组,而ON仅在第7天表达具有显著差异;矿化结节染色及钙离子定量检测显示,较之非骨质疏松组,骨质疏松组矿化结节染色浅,钙定量降低?【结论】 使用成骨诱导干细胞分化方案(地塞米松?二磷酸抗坏血酸?β-甘油磷酸钠)结果提示骨质疏松症患者的干细胞成骨分化能力较非骨质疏松患者降低?因此,选取有骨质疏松症患者自身的骨髓间充质干细胞作为治疗的种子细胞可能并不适用于临床?     

补肾方药诱导BMSCs骨向分化的研究进展

中医理论认为骨的生长与肾有着密切关系,所谓＂肾藏精,主骨生髓＂.近年来许多学者对骨髓间充质干细胞与中医＂肾精＂的诸多相似性进行了论述,并从＂肾藏精,主骨生髓＂理论出发,探讨补肾方药对BMSCs骨向分化的影响,取得了一些进展.本文针对补肾方药诱导骨髓间充质干细胞骨向分化的研究进展进行回顾与总结.     

姜黄素促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中活性氧表达变化研究

目的研究姜黄素对成年大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）的成骨性分化中活性氧（ROS）表达变化的影响。方法贴壁筛选法体外培养健康SPF级SD大鼠rBMSCs,分为四组,姜黄素组（15μmol/L姜黄素干预）,N-乙酰半胱氨酸（NAC）组（含40 mmol/L NAC）,姜黄素＋NAC组（含15μmol/L姜黄素＋40 mmol/L NAC）,对照组（只含等体积溶剂）。比较各组间碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性,骨钙素（bone glaprotein,BGP）含量和ROS相关蛋白表达变化。结果①姜黄素组第4、8、12天ALP表达OD值[（35.72±0.295）、（60.44±0.347）、（51.51±0.487）]均高于对照组[（19.96±0.874）、（53.55±0.978）、（41.32±0.755）],差异均有统计学意义（P〈0.05）;NAC组和姜黄素＋NAC组第4、8、12天ALP活性表达的OD值低于姜黄素组,差异均有统计学意义（P〈0.05）。②姜黄素组培养12 d时BGP活性[（6.900±0.026）μg/L]高于对照组[（5.690±0.099）μg/L],差异有统计学意义（P〈0.05）,说明姜黄素可明显增强rBMSCs的BGP活性。NAC组和姜黄素＋NAC组的BGP活性[（5.360±0.254）、（5.500±0.232）μg/L]低于姜黄素组[（6.900±0.026）μg/L],差异有统计学意义（P〈0.05）。③rBMSCs诱导成骨化培养8 d后,姜黄素组ERK1/2,p38蛋白的表达量高于对照组,差异有统计学差异（P〈0.05）;NAC组ERK1/2,p38蛋白表达量低于姜黄素组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论姜黄素促进rBMSCs成骨分化过程中ROS表达量的增加。