IGF1通过BMP2-Smad1/5信号通路调控犬上颌窦黏膜干细胞成骨分化

目的探讨骨形态形成蛋白2(bone morphogenetic protein2,BMP2)-Smad1/5及p38MAPK信号通路在胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF1)介导的促犬上颌窦黏膜干细胞(maxillary sinus membrane stem cells,MSMSCs)成骨分化中的作用。方法构建表达胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor1,IGF1)基因的重组腺病毒载体(recombinant adenovirus,rAdv)Ad-IGF1。感染Ad-IGF1的犬上颌窦黏膜干细胞,经成骨诱导培养后,qRT-PCR和Western blot检测BMP-Smads信号通路中重要信号蛋白Smad1/5的磷酸化水平和BMP2蛋白的表达;免疫组化观察磷酸化Smad1/5核转位情况;qRT-PCR及Western blot检测BMP-Smads通路抑制剂Noggin和p38MAPK信号通路抑制剂SB203580对IGF1介导的促犬MSMSCs成骨分化的影响。结果成功构建IGF1基因表达重组腺病毒载体Ad-IGF1;感染Ad-IGF1的犬MSMSCs,经成骨诱导培养后,Smad1/5的磷酸化水平和BMP2蛋白的表达升高,IGF1可促使Smad1/5核转位;BMP-Smads信号通路抑制剂Noggin可抑制Smad1/5的磷酸化,降低成骨标志物Runx2、OPN和ALP mRNA的表达,钙结节形成减少。p38MAPK信号通路抑制剂SB203580不能降低Ad-IGF1犬MSMSCs的p38磷酸化水平,亦不能降低成骨标志物Runx2、OPN和ALP mRNA的表达。结论犬MSMSCs成骨分化过程中,IGF1通过经典的Smads蛋白依赖性信号转导通路BMP2-Smad1/5促进成骨,而Smads蛋白非依赖性信号转导通路p38MAPK在IGF1介导的犬MSMSCs成骨过程中可能并不发挥作用。     

组蛋白去甲基化酶FBXL11抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化

目的 研究组蛋白去甲基化酶FBXL11对牙髓干细胞定向分化能力的影响.方法 成骨分化诱导培养基诱导牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化.逆转录病毒转染构建过表达FBXL11的牙髓干细胞稳定转染细胞,进行FBXL11获得性功能研究.碱性磷酸酶活性实验及碱性磷酸酶染色检测成骨/成牙本质分化早期分化指标-碱性磷酸酶活性.茜素红染色及钙离子定量分析检测牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化能力.实时定量RT-PCR检测FBXL11及成骨/成牙本质分化相关基因-骨涎蛋白、骨桥蛋白和骨钙素的表达.结果 成骨诱导牙髓干细胞抑制FBXL11的表达.过表达FBXL11明显抑制牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性、牙髓干细胞体外矿化能力以及骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达.结论 组蛋白去甲基化酶FBXL11具有抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化的潜能.     

糖基化终末产物介导的牙周膜干细胞成骨分化过程中Wnt经典信号通路相关作用机制的研究

目的:探讨人牙周膜干细胞(human periodontal stem cells,HPDLSCs)成骨分化过程中在糖基化终末产物(AGE-HSA)介导下Wnt经典通路β-catenin的变化.方法:体外组织块法和有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,流式细胞仪进行干细胞表型分子鉴定后,根据不同刺激环境随机分为OS组(单纯成骨诱导对照组)、OSA组(成骨诱导液+10 μg/mL AGEs)、OSDKK-1组(成骨诱导液+100 μg/mL DKK-1)、OSA+ DKK-1组(成骨诱导液+ 10 μg/mL AGEs+ 100 ng/mL DKK-1)4组,并进行相应的诱导培养.诱导培养7d后,碱性磷酸酶染色检测ALP活性;RT-PCR检测Wnt经典通路基因3-catenin mRNA以及成骨相关基因Runx2、ALP mRNA的表达变化情况;Western Blot检测细胞核蛋白β-catenin和细胞总蛋白Runx2的表达变化情况.结果:纯化的人牙周膜干细胞各表型分子CD29、CD90、CD146、stro-l均阳性表达,ALP染色结果显示:OSA组颜色最浅,OSDKK-1组颜色最深,OSA+ DKK-1组颜色介于两者之间;RT-PCR及Western Blot结果显示:与OS组相比,OSDKK-1组β-catenin的表达水平明显降低,Runx2、ALP的表达水平明显升高(P＜0.05),表明DKK-1抑制了经典wnt通路,而使HPDLSCs的成骨能力增强;而OSA组β-catenin的表达水平明显升高,Runx2、ALP表达水平明显降低(P＜0.05),表明激活了经典wnt通路,而使HPDLSCs的成骨能力下降;当联合加入AGEs和DKK-1(OSA+ DKK-1组)时,成骨能力与OSDKK-1组相比明显降低,而与OSA组相比明显升高(P＜0.05).结论:在HPDLSCs成骨分化过程中,抑制经典wnt通路可以促进其骨向分化;而10 ng/mL的AGEs可通过激活wnt经典通路从而抑制其成骨分化.     

Nell-1型分子基因对大鼠骨髓基质细胞成骨分化的影响

目的：研究Nel-like1型分子（Nell-1）基因对体外培养大鼠骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,bMSCs）成骨分化的影响。方法：实验分为未转染组、转染β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase,LacZ）基因的LacZ组以及转染Nell-1基因的Nell-1组。取6周龄雄性Fischer344大鼠胫骨和股骨骨髓体外培养,以腺病毒为载体,进行基因转染。以反转录PCR和Western印迹法验证bMSCs中Nell-1基因的表达。以碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性定量测定、骨钙素（osteocalcin,OC）含量测定和Von Kossa法检测Nell-1基因转染对bMSCs成骨分化的影响。采用SAS6.04软件包对数据进行随机设计的方差分析（ANOVA-SNK）。结果：Nell-1组可检测到Nell-1基因转录水平和蛋白水平的表达,未转染组和LacZ组未见明显Nell-1基因表达。Nell-1组ALP活性在转染后3d、6d和9d均高于LacZ组和未转染组。Nell-1组在转染后14d、28d时,OC含量分别为（1.23±0.05）ng/mL和（1.31±0.06）ng/mL,高于未转染组的（0.81±0.09）ng/mL和（1.00±0.05）ng/mL,以及LacZ组的（0.92±0.08）ng/mL和（1.02±0.04）ng/mL。钙结节数Nell-1组在转染后21d和28d分别为4.5±1.1和16.2±2.5,高于未转染组的0.8±0.7和3.2±1.2以及LacZ组的0.7±0.5和3.7±0.8,其差异均有显著性（P〈0.05）。结论：Nell-1基因可促进体外培养bMSCs的成骨分化。     

HOXC6同型蛋白2对根尖牙乳头干细胞成骨/成牙分化功能的影响

目的 探讨同源盒基因C6同型蛋白2对牙源性间充质细胞成骨/成牙分化的影响.方法 成骨诱导培养基诱导人根尖牙乳头干细胞体外成骨/成牙分化;逆转录病毒转染构建过表达HOXC6-ISO2稳定转染牙乳头干细胞进行HOXC6-ISO2获得性功能研究;碱性磷酸酶活性实验检测成骨/成牙早期分化指标-碱性磷酸酶活性;茜素红染色及钙离子定量分析检测干细胞体外矿化能力;实时荧光定量反转录PCR检测成骨/成牙分化相关基因-Sp7转录因子、Runt相关转录因子2和骨钙素及同源盒基因C6下游基因胰岛素结合蛋白5的表达.结果 结果显示过表达同源盒基因C6同型蛋白2明显抑制牙乳头干细胞的碱性磷酸酶活性;茜素红染色及钙离子定量分析结果显示过表达同源盒基因C6同型蛋白2明显抑制牙乳头干细胞体外矿化能力;实时荧光定量反转录PCR显示过表达同源盒基因C6同型蛋白明显抑制骨钙素的表达,并且抑制下游基因胰岛素结合蛋白5的表达.结论 同源盒基因C6同型蛋白2通过抑制下游基因胰岛素结合蛋白5抑制牙乳头干细胞体外成骨/成牙分化的功能.     

糖基化终末产物对人牙周膜干细胞骨向分化过程中的Wnt经典信号通路研究

目的 探讨Wnt经典通路相关因子Dickkopf蛋白1（DKK-1）、β-链蛋白（β-catenin）在糖基化终末产物（AGEs）介导的人牙周膜干细胞（hPDLSCs）骨分化过程中的变化。方法 通过体外组织块法和有限稀释法克隆化培养获取hPDLSCs,实验分两组：正常hPDLSCs组（N-hPDLSCs组）和AGEs刺激的正常hPDLSCs组（A-hPDLSCs组）。对2组细胞成骨矿化诱导后行碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色;实时聚合酶链反应（real time PCR）检测成骨基因,以及Wnt经典通路中相关因子DKK-1、β-catenin;Western blot检测相关成骨蛋白、细胞核蛋白β-catenin。结果 成骨诱导后,A-hPDLSCs组ALP染色明显浅于N-hPDLSCs组;茜素红染色A-hPDLSCs组钙化结节少于N-hPDLSCs组;real time PCR与Western blot的结果显示A-hPDLSCs组BSP、ALP、Runx-2的表达都较低,差异有统计学意义（P<0.05）。Wnt经典信号通路中相关因子：A-hPDLSCs组β-catenin表达高于N-hPDLSCs组,A-hPDLSCs组DKK-1表达明显低于N-hPDLSCs组,并且Weston blot显示A-hPDLSCs组核蛋白β-catenin的表达高于N-hPDLSCs组。结论AGEs可以使hPDLSCs骨向分化过程中Wnt经典通路的抑制因子DKK-1下调,细胞核中的β-catenin表达升高,激活了Wnt经典通路,并且抑制了骨分化。     

牙周膜干细胞向成骨细胞方向分化实验

目的:探讨人牙周膜干细胞(Periodontalligament stem cell,PDLSCs)向成骨细胞定向分化潜能,从细胞、分子和基因水平分析矿化诱导过程中细胞形态、功能变化。方法:将免疫磁珠分离的人PDLSCs矿化诱导,通过倒置显微镜观察诱导细胞形态变化,ELISA法检测诱导细胞碱性磷酸酶活性(ALPase)、RT-PCR、Western blot及免疫化学染色分析其成骨相关基因、蛋白表达变化,茜素红染色法检测其矿化结节形成情况来诱导细胞做对照。结果:矿化诱导14d,细胞形态呈成骨样短突起、多角形改变,诱导7d、14d ALPase活性显著增强。21d,诱导细胞高丰度表达骨桥素(OPN)、骨钙素(OCN)、牙骨质附着蛋白(CAP)及I型胶原(COLⅠ)mRNA,而对照组只有COLⅠmRNA弱表达。同时,Western blot及免疫化学染色均显示诱导细胞分泌骨涎蛋白(BSP)。21d,仅诱导组形成大量矿化结节。结论:人PDLSCs在矿化液诱导下可向成骨细胞分化,具有成骨细胞的形态、表型和功能特点,有望成为牙周及种植体周围骨缺损修复再生的理想的种子细胞。     

过表达ADAM10通过调控Notch信号通路对牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的:探讨解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)调控Notch信号通路对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成骨分化的影响.方法:体外培养hPDLSCs并对其进行成骨分化诱导,RT-PCR检测成骨诱导第0、7、14天细胞中ADAM10 mRNA表达水平.采用ADAM10过表达慢病毒感染hPDLSCs,并将细胞分为空白对照组、空载组和ADAM10过表达组,分别采用RT-PCR和Western blot检测感染后hPDLSCs中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平,CCK-8检测各组细胞增值情况.感染的hPDLSCs经成骨诱导分化后,茜素红染色观察各组细胞矿化结节生成情况,RT-PCR检测各组细胞中成骨相关基因ALP、Runx2、OCN以及Notch信号通路相关基因Notch1、NICD、Hes1的mRNA表达水平,Western blot检测Notch信号通路相关蛋白Notch1、NICD和Hes1的蛋白表达水平.结果:hPDLSCs成骨诱导分化的第0、7、14天过程中,ADAM10 mRNA表达水平逐渐降低(P<0.05).感染ADAM10过表达慢病毒后,hPDLSCs中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平显著增加(P<0.05),同时细胞增殖能力明显增强(P<0.05).成骨诱导分化后,与对照组和空载组比较,ADAM10过表达组矿化结节形成量、成骨相关基因ALP、Runx2、OCN的mRNA表达水平以及Notch信号通路相关基因Notch1、NICD、Hes1的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05).结论:过表达ADAM10可促进hPDLSCs增殖并抑制其成骨分化,其机制可能与Notch信号通路的激活有关.     

过表达ADAM10通过调控Notch信号通路对牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的:探讨解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)调控Notch信号通路对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成骨分化的影响.方法:体外培养hPDLSCs并对其进行成骨分化诱导,RT-PCR检测成骨诱导第0、7、14天细胞中ADAM10 mRNA表达水平.采用ADAM10过表达慢病毒感染hPDLSCs,并将细胞分为空白对照组、空载组和ADAM10过表达组,分别采用RT-PCR和Western blot检测感染后hPDLSCs中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平,CCK-8检测各组细胞增值情况.感染的hPDLSCs经成骨诱导分化后,茜素红染色观察各组细胞矿化结节生成情况,RT-PCR检测各组细胞中成骨相关基因ALP、Runx2、OCN以及Notch信号通路相关基因Notch1、NICD、Hes1的mRNA表达水平,Western blot检测Notch信号通路相关蛋白Notch1、NICD和Hes1的蛋白表达水平.结果:hPDLSCs成骨诱导分化的第0、7、14天过程中,ADAM10 mRNA表达水平逐渐降低(P<0.05).感染ADAM10过表达慢病毒后,hPDLSCs中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平显著增加(P<0.05),同时细胞增殖能力明显增强(P<0.05).成骨诱导分化后,与对照组和空载组比较,ADAM10过表达组矿化结节形成量、成骨相关基因ALP、Runx2、OCN的mRNA表达水平以及Notch信号通路相关基因Notch1、NICD、Hes1的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05).结论:过表达ADAM10可促进hPDLSCs增殖并抑制其成骨分化,其机制可能与Notch信号通路的激活有关.     

脑源性神经营养因子在人牙髓干细胞中的表达及其对细胞增殖分化的影响

目的:检测脑源性神经营养因子(brain-derived neurtrophie factor,BDNF)在人牙髓干细胞中的表达,初步观察其对细胞增殖和分化的影响.方法:采用酶消化法分离培养人牙髓干细胞;RT-PCR检测细胞中BDNF mRNA表达;MTT和碱性磷酸酶活性检测观察其对细胞增殖分化的影响.结果:RT-PCR反应扩增出BDNF mRNA阳性产物;与对照组相比,25 ng/mL BDNF可显著促进牙髓干细胞的增殖(P<0.05);100 ng/mL时可显著提高碱性磷酸酶活性(P<0.05).结论:BDNF可表达于人牙髓于细胞,对细胞增殖分化有一定促进作用.     

Notch信号通路对大鼠牙囊细胞增殖和成骨分化的调控作用

目的 探讨Notch信号通路对大鼠牙囊细胞(rDFCs)增殖和成骨分化的调控作用.方法 体外培养rDFCs,经细胞形态、免疫组化鉴定rDFCs后,使用10 ng/L大鼠重组Jagged1蛋白、10μmol/L DAPT溶液、对照组培养液作用于细胞,CCK-8检测增殖能力;利用碱性磷酸酶、茜素红染色分析rDFCs成骨分化能力;Western Blot检测关键蛋白Notch受体胞内段(NICD)、碱性磷酸酶(ALP)、骨形成蛋白2(BMP2).结果 rDFCs呈成纤维细胞形态;rDFCs中波形丝蛋白明显表达,角蛋白未表达;诱导组ALP染色、茜素红染色均强于对照组;Jagged1第4天后能明显促进rDFCs细胞增殖,DAPT第4天后能显著抑制rDFCs细胞增殖(P<0.05).Jagged1组ALP、BMP2的表达趋势下降,DAPT组ALP、BMP2的表达趋势升高(P<0.05).结论 激活Notch信号通路可促进rDFCs的增殖,抑制Notch信号通路可促进rDFCs的成骨分化.     

Nell-1基因修饰骨髓基质细胞复合β-磷酸三钙提升兔上颌窦底的实验研究

目的：评价Nel样I型分子（Nell-1）基因修饰骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,bMSCs）复合β-磷酸三钙提升兔上颌窦底的效果。方法：抽取兔骨髓进行bMSCs培养,体外采用腺病毒载体携带Nell-1基因（AdNell-1）及绿色荧光蛋白EGFP基因（AdEGFP）转染bMSCs,GFP表达检测转染效率、Nell-1免疫细胞化学检测目的基因的表达。碱性磷酸酶（ALP）染色、半定量检测及钙结节茜素红染色检测细胞成骨分化。将基因修饰bMSCs与β-磷酸三钙颗粒复合用于兔上颌窦底提升,分别在术后2周和8周取材,HE染色,测量成骨面积,并采用SPSS11.0软件包对2组间数据进行t检验。结果：AdEGFP基因修饰组GFP表达效率可达60%～80%,Nell-1细胞化学染色显示,AdNell-1基因修饰组呈阳性表达。AdNell-1基因修饰组ALP染色及钙结节茜素红染色均高于AdEGFP基因修饰组,ALP半定量检测具有统计学差异（P〈0.05）。体内实验研究中,AdNell-1基因修饰组新骨形成面积在8周时显著高于AdEGFP基因修饰组（P〈0.05）。结论：采用AdNell-1基因转染兔bMSCs可促进其成骨分化,体内可促进上颌窦底提升的效果。     

低强度高频振动对人牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 研究低强度高频振动（low-magnitude high frequency vibration,LMHFV）对人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）增殖、迁移、成骨分化能力的影响。方法 体外分离培养hPDLSCs;流式细胞术检测间充质干细胞表面标志物;加载LMHFV（加速度=0.3 g,频率=40 Hz,时间=15 min/24 h）刺激后,采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力,通过细胞划痕实验检测细胞迁移能力;通过qRT-PCR、Western免疫印迹检测成骨相关基因、蛋白表达水平,通过茜素红染色检测细胞成骨分化能力。采用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果 加载振动刺激后,hPDLSCs的增殖能力增强,迁移能力上升;RUNX2、ALP、Col-1、OCN的mRNA表达量和蛋白表达量均上升,茜素红染色结果与qRT-PCR、Western免疫印迹结果一致。结论 LMHFV可提高hPDLSCs的增殖、迁移能力和成骨分化能力。     

牙周膜相关蛋白1在人牙周膜细胞成骨分化过程中的表达

目的 研究牙周膜相关蛋白1（PLAP-1）在人牙周膜细胞（PDLC）成骨分化过程中的表达变化,为明确PLAP-1 在牙周组织中的作用奠定基础.方法 酶消化法培养人PDLC,免疫细胞化学染色鉴定其来源和PLAP-1 的表达,茜素红染色和碱性磷酸酶（ALP）实验鉴定其成骨分化能力,定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测其成骨分化过程中,PLAP-1、Periostin、RGD-CAP、RUNX2、OCN 和OPN mRNA 表达变化,Western blot 检测PLAP-1、RUNX2 和OCN 蛋白表达变化并进行统计分析.结果 培养的人PDLC 来源于间充质;人PDLC 矿化诱导21 d 后茜素红染色阳性,矿化诱导后7、14、21 d 时ALP 活性较对照组明显增高（P ＜ 0.05）,具有成骨分化能力;PLAP-1 免疫细胞化学染色阳性;定量RT-PCR 和Western blot 结果显示,人PDLC 在mRNA 和蛋白水平均表达PLAP-1,且mRNA 表达量随人PDLC 成骨分化过程发生变化,诱导14 d上调,诱导21 d 下调,较对照组有明显差异（P ＜ 0.05）,Western blot 检测蛋白表达显示类似的表达趋势.结论 PLAP-1 在基因及蛋白水平均高表达于人PDLC,其表达量随人PDLC 成骨分化成一定模式,提示其参与调控牙周膜的功能与稳定,但其精细的调控功能还有待进一步深入研究.     

组蛋白去甲基化酶KDM6A促进骨髓间充质干细胞成骨分化研究

目的研究组蛋白去甲基化酶KDM6A对骨髓间充质干细胞成骨定向分化能力的影响。方法构建Flag-KDM6A慢病毒表达质粒。利用慢病毒转染构建稳定过表达KDM6A的骨髓间充质干细胞。碱性磷酸酶活性实验检测成骨分化早期指标-碱性磷酸酶活性。茜素红染色及钙离子定量分析检测干细胞体外矿化能力。实时：毫量RT-PCR检测成骨分化相关基因．骨桥蛋白和骨钙素的表达。结果过表达KDM6A促进骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性、骨髓间充质干细胞体外矿化能力以及骨桥蛋白和骨钙素的表达。结论组蛋白去甲基化酶KDM6A具有促进骨髓间充质干细胞成骨分化的潜能,可以作为一个候选的靶基因用于骨组织工程技术,促进骨组织再生。．     

GLUD1基因对人牙髓干细胞的体外增殖、分化和矿化的影响

目的:探索谷氨酸脱氢酶1 (Glutamate dehydrogenase 1,GLUD1)基因在人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hPDCSs)体外增殖、成骨分化和矿化中的作用.方法:体外分离培养hPDCSs,利用慢病毒感染方式沉默GLUD1基因的表达,分别采用RT-PCR和Western免疫印迹检测mRNA及蛋白水平的沉默效率.采用CCK8法检测细胞的体外增殖水平.对hDPSC进行体外成骨诱导分化培养,采用茜素红染色法检测矿化结节的形成,利用RT-PCR和免疫荧光染色分别检测Runx2、OCN基因的表达.采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析.结果:hDPSCs经过成骨诱导分化培养后,GLUD1的表达量较对照组明显上升;hDPSCs经shGLUD1病毒转染后,GLUD1表达明显下调;沉默GLUD1表达的hDPSCs体外增殖能力减弱;经成骨诱导分化培养后,与对照组相比,矿化结节形成明显减少;成骨早期标志基因Runx2上调,成骨晚期标志物OCN在mRNA和蛋白水平均显著下调.结论:沉默GLUD1表达抑制hDPSCs的体外增殖和矿化形成,影响晚期成骨分化;GLUD1在hDPSCs的成骨分化中具有重要作用.