共表达EGFP和CXCR4的大鼠骨髓间充质干细胞的构建及其迁移能力

目的 构建携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)及CXCR4慢病毒载体并实现其在大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)中的表达,观察转CXCR4基因后对rMSCs迁移能力的影响。方法 RT-PCR扩增大鼠CXCR4编码区片段,将其插入慢病毒载体质粒PNL-IRES2-EGFP,获得的PNL-CXCR4-IRES2-EGFP与包装及包膜质粒用脂质体法共转染293T细胞,包装生产慢病毒。所获慢病毒转染rMSCs后,用RT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光组织化学和流式细胞术检测转CXCR4基因rMSCs组、转空载体rMSCs组中CXCR4表达情况。利用Transwell方法检测两组rMSCs在SDF-1作用下的迁移能力。结果 双酶切和测序证实,PNL-CXCR4-IRES2- EGFP构建正确,转CXCR4基因rMSCs组CXCR4表达明显增多,在SDF-1α作用下迁移能力明显增强。结论 成功构建带有EGFP和大鼠CXCR4的慢病毒载体,并获得CXCR4-rMSCs基因工程细胞,为深入研究SDF/CXCR4轴在rMSCs向损伤组织定向迁移中的作用奠定了基础。     

携带大鼠酪氨酸羟化酶基因慢病毒载体的构建及转染

目的:构建携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)和大鼠酪氨酸羟化酶(TH)基因的慢病毒载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC),观察TH基因的表达.方法:RT-PCR方法获得大鼠TH基因,将其克隆至慢病毒载体.通过瞬时转染法包装出病毒上清,鉴定滴度.感染rMSCs,荧光显微镜下观察EGFP的表达、转染效率,RT-PCR、免疫印迹法分别检测TH mRNA和蛋白的表达情况.结果:重组慢病毒载体质粒pNL-TH-IRES2-EGFP经双酶切鉴定正确,所获TH基因经测序后与GenBank报道序列完全一致;生产的病毒浓缩后滴度为4.1×10~7TU/ml;感染rMSCs结果显示荧光激发可见绿色荧光,TH-rMSCs、空载体-rMSCs组5d转染效率差异无统计学意义.RT-PCR、免疫印迹法显示TH基因成功在rMSCs中表达.结论:成功构建带有EGFP和大鼠TH基因的慢病毒载体,并获得TH-rMSCs基因工程细胞.     

血管生长素-1基因慢病毒载体的构建及其在间质干细胞的表达

目的： 构建带有血管生长素-1（Ang-1）基因的慢病毒载体并实现该基因在大鼠骨髓间质干细胞（rMSCs）中的表达。方法： RT-PCR获得大鼠Ang-1基因，限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒PNL-Ang-1-IRES₂-EGFP，在脂质体介导下与包装质粒HELPER,包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒颗粒并感染rMSCs。 PCR检测Ang-1基因的插入，细胞RT-PCR检测Ang-1 mRNA表达，免疫细胞化学和Western blotting检测Ang-1蛋白的表达。结果： 所获Ang-1基因经测序证实与GenBank报道的序列一致。慢病毒载体质粒PNL-Ang-1-IRES₂-EGFP经SalⅠ和BamHⅠ双酶切后电泳显示 1 512 bp Ang-1目的基因片段和10.5 kb PNL-IRES2-EGFP载体片段。病毒基因组PCR证实Ang-1基因插入。荧光显微镜观察到EGFP表达。细胞RT-PCR检测到Ang-1 mRNA表达。免疫细胞化学和Western blotting检测到Ang-1蛋白表达。结论： 成功构建带有Ang-1基因的慢病毒载体并实现在rMSCs中的表达，为Ang-1基因修饰干细胞的应用研究奠定了基础。     

大鼠ferroportin 1过表达慢病毒载体构建及其转染PC12细胞

目的:构建含大鼠ferroportin 1(FP1,膜铁转运蛋白1)基因和EGFP(绿色荧光蛋白)基因的过表达慢病毒载体并转染PC12细胞。方法:化学合成含有目的基因FP1的质粒,将酶切获得的目的基因连接入线性化慢病毒载体,构建重组质粒PGC-FU-FP1并进行测序鉴定;鉴定正确的阳性克隆采用Lipofectamine2000转染293T细胞,通过荧光显微镜和Western Blot检测FP1表达情况;在脂质体介导下将PGC-FU-FP1、pHelper1.0和pHelper2.0三质粒系统共转染入293T细胞,包装产生慢病毒,并通过实时荧光定量PCR法检测病毒滴度。以重组慢病毒载体质粒PGC-FU-FP1转染PC12细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达,实时荧光定量PCR和Western Blot法分别检测FP1mRNA和蛋白表达情况。结果:FP1基因序列经测序后与GeneBank报道的序列完全一致;重组质粒PGC-FU-FP1中携带有正确的FP1基因并能在293T细胞中表达;病毒滴度为2×108TU/ml。荧光显微镜、实时荧光定量PCR和Western Blot法证实目的基因FP1能被重组慢病毒高效导入PC12细胞并得到过表达。结论:成功构建携带FP1基因的慢病毒载体,并获得FP1基因修饰的PC12基因工程细胞。为进一步研究FP1在帕金森病中的作用及基因治疗奠定基础。     

靶向人STAT3基因的shRNA慢病毒载体的构建

目的:构建并鉴定靶向人转录因子STAT3基因的shRNA慢病毒载体.方法:设计合成针对人STAT3基因的shRNA序列,运用基因重组技术将其插入到含U6启动子及绿色荧光蛋白基因的慢病毒表达载体pSicoR中,构建shRNA重组质粒pSicoR-STAT3-shRNA.经双酶切及DNA测序鉴定后,利用转染试剂X-tremeGENE HP将第3代慢病毒载体共转染至HEK293细胞进行病毒包装.以阴性载体为对照,用RT-PCR和Western blot分别检测STAT3基因和蛋白表达水平.结果:双酶切及测序证实载体构建正确,在HEK293中成功包装出高滴度慢病毒颗粒,感染HEK293后STAT3基因表达和蛋白质表达水平均较对照组明显降低(P＜0.05).结论:成功构建了靶向人STAT3基因的shRNA慢病毒载体.     

携EGFP的人Synoviolin基因慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建携EGFP的人Synoviolin基因慢病毒表达载体。方法应用基因重组手段,SalⅠ/NotⅠ双酶切质粒pIRES2-EGFP-syno,得到含EGFP和人Synoviolin的基因片段,将其亚克隆至入门载体pENTR1A的多克隆位点内得到入门质粒pENTR1A-syno-egfp。采用LR重组酶将pENTR1A-syno-egfp和目的载体pLenti4/TO/V5-DEST进行重组反应,形成慢病毒表达载体pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp。将pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp与包装质粒混合,利用脂质体共转染293FT细胞,包装产生慢病毒,以293FT细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果PCR,酶切及测序结果表明慢病毒表达载体pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp构建成功,转染后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光。包装的慢病毒原液滴度为1×10~8TU/ml。结论成功构建了EGFP和Synoviolin基因共表达的慢病毒表达载体,为Synoviolin基因的功能研究提供了高效稳定的转基因技术平台。     

重组慢病毒表达载体介导HIV-1 Vpr蛋白调控KSHV潜伏感染的初探

目的 利用慢病毒载体系统包装含人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)病毒蛋白R(Vpr)的重组慢病毒,使之感染原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞BCBL-1,并检测Vpr蛋白对细胞中卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)潜伏感染与裂解性复制的影响.方法 从实验室先前构建的重组真核表达质粒pCI-neo-Vpr中扩增出Vpr基因,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen载体中构建成重组慢病毒质粒pHAGE-Vpr,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2及包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达,293T细胞培养上清经0.45 μm滤器过滤后即获得重组病毒悬液.慢病毒系列稀释后感染293T细胞,荧光计数法测定病毒滴度,逆转录PCR(RT-PCR)检测Vpr基因在293T细胞中的转录.以感染复数(MOI)为1的病毒量感染靶细胞BCBL-1,荧光显微镜观察靶细胞中GFP的表达,并利用RT-PCR和和免疫印迹(Western blot)技术分别检测Vpr基因在靶细胞中的转录和表达情况,同时检测KSHV裂解期基因复制与转录激活子(Rta)mRNA转录及蛋白表达.结果 经酶切鉴定、核酸序列测定和293T细胞中GFP表达证实成功包装了携带HIV-1Vpr基因的重组慢病毒,滴度为4×107TU/ml.重组慢病毒感染BCBL-1细胞后,细胞中有GFP表达,RT-PCR和Western blot均能够在相应位置检测到目的 基因Vpr的条带,并且Vpr降低了KSHV RtamRNA转录及蛋白表达水平.结论 重组慢病毒介导的HIV-1 Vpr蛋白过表达能够抑制KSHV裂解性复制、增强病毒的潜伏感染.     

携人PTHLH基因慢病毒表达载体的构建

目的构建携带人甲状旁腺相关激素（PTHLH）基因的慢病毒表达载体pGC-FU/PTHLH。方法酶切载体pGC-FU,根据人PTHLH基因合成特定引物,扩增目的基因片段,将其克隆到pGC-FU质粒（含EGFP基因）上,菌落PCR鉴定及测序分析重组载体,使用Lipofectamine 2000诱导转染pGC-FU、pHelper1.0和pHelper2.0载体三质粒进入293T细胞包装慢病毒,并用带PTHLH的慢病毒感染293T细胞和鼻咽癌CEN1细胞确认慢病毒包装是否成功。结果菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,与理论预计值阳性转化子735bp,阴性转化子198bp基本相吻合;PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,结果完全匹配,进一步鉴定载体构建成功。分别将质粒包装系统共转染293T细胞,包装产生空白对照慢病毒（pGC-FU）和过表达PTHLH的慢病毒（pGC-FU/PTHLH）;或用携带PTHLH和EGFP基因的病毒上清感染CNE1细胞,48h后,倒置荧光显微镜下观察293T和CNE1细胞,均可见绿色荧光,转染成功。结论成功构建携人PTHLH基因慢病毒表达载体,为进一步研究PTHLH基因在鼻咽癌转移中的作用及鼻咽癌发病分子机制奠定了基础。     

人树突状细胞SOCS1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建人树突状细胞（hDCs）信号传导通路抑制因子1（SOCS1）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体。方法根据人树突状细胞SOCS1基因（NM-0037）,筛选出一个靶序列,设计并合成包含正反义靶序列的互补单链寡核苷酸,与经BamH和Xho酶切后的慢病毒载体质粒pRNA-Lenti-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）（含U6启动子和EGFP）连接产生pRNA-Lenti-SOCS1-EGFP慢病毒重组质粒,与慢病毒包装混合物共转染293T细胞,包装产生慢病毒,收集病毒上清,采取系列稀释法测定慢病毒滴度。然后转染hDCs,通过荧光显微镜观察细胞转染情况,利用荧光实时定量PCR和Westernblot检测干扰组、阴性对照组、空白对照组SOCS1的表达情况。结果将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功。荧光实时定量PCR及Westernblot检测显示慢病毒重组质粒感染hDCs后,与空白对照组及阴性对照组比较,siRNA组mRNA和SOCS1蛋白的表达量显著降低,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论构建的pRNA-Lenti-SOCS1-EGFP慢病毒载体可有效地抑制hDCs的SOCS1的表达,为进一步研究DCs增强抗肿瘤免疫应答效应奠定基础。     

粒-巨噬细胞集落刺激因子与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体构建

目的：构建粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与绿色荧光蛋白（GFP）融合基因慢病毒载体。 方法： 采用RT-PCR方法获得GM-CSF全外显子片段, 使之克隆到带GFP慢病毒表达载体质粒 FUGW中，经限制性酶切、PCR扩增和测序鉴定重组载体。在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMV.△8.9、包膜基因VSVG、目的基因FUGW-GM-CSF导入病毒包装细胞293T，荧光显微镜检测基因的表达，包装成病毒后，收集病毒上清，浓缩，鉴定。用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测转染FUGW-GM-CSF细胞上清液 GM-CSF表达水平，电子显微镜观察293T细胞中的慢病毒。 结果： 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RT-PCR获得的GM-CSF/PCR产物与GenBank中的数据完全吻合; GM-CSF准确克隆入FUGW的多克隆位点。慢病毒的3种质粒可高效转染入293T细胞，荧光显微镜下观察可见大量绿色荧光。转染 FUGW-GM-CSF包装细胞上清液 GM-CSF酶联反应阳性。电子显微镜下见慢病毒颗粒位于293T细胞胞浆的内质网中。 结论： 成功构建了GM-CSF与GFP融合基因慢病毒载体，为诱导DC提供了适合的稳定转染的载体。     

稳定转染增强型绿色荧光蛋白大鼠骨髓间充质干细胞系的建立

背景：利用间充质干细胞或含有治疗因子的干细胞进行有选择性的杀伤肿瘤细胞是一种有前途的治疗方法。 目的：建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。 方法：通过脂质体介导慢病毒质粒pVector-EGFP、pHelper、Envelope 共转染293T细胞完成载体病毒构建,以实时荧光定量PCR检测慢病毒滴度;取对数生长期的SD大鼠骨髓间充质干细胞,以复感染指数MOI值0,5,10,15,20加入携带报告基因增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体稀释液,72 h后观察各组增强型绿色荧光蛋白的表达效率及阳性转染率。 结果与结论：携带增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体系统转染293T细胞能够正确表达,滴度为1×10⁸ TU/mL。包装好的病毒颗粒转染大鼠骨髓间充质干细胞二三天后,各孔均有增强型绿色荧光蛋白的表达。MOI值从0增至10,细胞的阳性表达率逐渐提高(P < 0.05),MOI值为10的组能获得>70%的转染率,但MOI值从10增至20,转染率变化不明显。说明以MOI值为10的滴度将慢病毒载体可将外源基因高效转入大鼠骨髓间充质干细胞内,建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。     

BDNF重组腺病毒的构建及在大鼠骨髓间质干细胞的表达

目的:利用大肠杆菌细菌内同源重组构建带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的脑源性神经营养因子前体(proBDNF)和脑源性神经营养因子(BDNF)重组腺病毒并在大鼠骨髓间质干细胞(rMSC)高效表达。方法:采用两步亚克隆的方法将proBDNF和BDNF构建入带有EGFP表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移载体pAdTrack-proBDNF和pAdTrack-BDNF,采用化学转化法在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,得到重组腺病毒载体pAd-proBDNF和pAd-BDNF;转染293细胞,包装成重组病毒颗粒;将重组病毒上清感染rMSC,用荧光显微镜下观察和Western-blotting鉴定重组病毒在rMSC表达;用Ad-proBDNF和Ad-BDNF感染的rMSC在体外诱导向神经样细胞分化;用Ad-proBDNF和Ad-BDNF的感染的rMSC接种于裸鼠肌肉内,两周后荧光显微镜下直接观察。结果:成功地构建了proBDNF和BDNF重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒,重组病毒能在体外培养的rMSC高效表达并不影响其分化潜能,体内移植实验表明Ad-proBDNF和Ad-BDNF感染的rMSC能在体内表达。结论:重组腺病毒具有较高的介导proBDNF和BDNF基因表达于rMSC的效率,带有报告基因EGFP的Ad-proBDNF和Ad-BDNF感染的rMSC可以用于体内移植实验。     

SPARC基因RNAi慢病毒载体的构建及其在SKM-1细胞中的表达

目的:构建SPARC基因RNAi慢病毒载体获得稳定产毒的细胞,并观察其对人MDS细胞株SKM-1细胞的转染效率及其对SPARC基因的抑制效率。方法:针对已经筛选确定的SPARC基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生GC-shSPARC慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。用GC-shSPARC、pHelper1.0和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度,并将获得的重组慢病毒GC-shSPARC转染SKM-1细胞,通过荧光显微镜检测转染后GFP表达情况,测定转染效率;RT-PCR和Western blot分别验证转染后SKM-1细胞SPARC mRNA及蛋白的表达。结果:经测序证实,构建出了SPARC shRNA的慢病毒载体GC-sh SPARC。包装、浓缩病毒悬液的滴度为1×109TU/mL。荧光显微镜下能直接观察到转染组细胞的GFP表达,转染效率为70%,RT-PCR、Western blot技术分别检测到GC-shSPARC慢病毒转染SKM-1细胞SPARC mRNA、SPARC蛋白表达水平较空白组明显降低(P<0.05)。结论:成功构建SPARC基因RNAi慢病毒载体,其能高效干扰SKM-1细胞SPARC基因的表达。     

慢病毒载体Pax6-EGFP构建及转染人骨髓间充质干细胞

BACKGROUND:Pax6 gene plays an important role in eye development and differentiation, and to study how it regulates the differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), gaining the BMSCs stably over-expressing Pax6 is crucial, which is also the basis of stem cell replacement therapy. OBJECTIVE:To construct a lentivirus vector containing Pax6 and detect the expression of Pax6 in transfected human BMSCs. METHODS:Pax6 gene was extracted using PCR. After its connection with lentivirus vector pHIV-EGFP, it was then packaged by 293T cells. The human BMSCs were transfected with recombinant lentivirus Pax6-EGFP as well as lentivirus vector pHIV-EGFP, which was considered negative control group. The cellular morphology was observed by a fluorescence microscope, and the mRNA expression of Pax6 was detected by real-time PCR. RESULTS AND CONCLUSION:The recombinant lentivirus Pax6-EGFP was constructed successfully with a titer of 3×109 pfu/L. After the transfection, both the green fluorescent protein and Pax6 gene were expressed detected using fluorescence microscope and real-time PCR, showing that the method of lentiviral transfection is a safe and effective way to modify BMSCs.     

AdMax系统构建腺病毒载体介导SCL基因转染Cajal样间质细胞及其表达

目的 构建含有人干细胞白血病(stem cell leukemia,SCL)基因的重组腺病毒载体,并观察其对豚鼠膀胱Cajal样间质细胞的转染及其介导SCL基因的表达.方法 采用PCR方法从含人SCL基因质粒中扩增SCL基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-EGFP/SCL,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC315-SCL经HEK293细胞扩增,纯化后测定病毒滴度.通过观察绿色荧光蛋白的表达评估重组腺病毒对Cajal样间质细胞的转染率,RT-PCR法分析转染Cajal样间质细胞后SCL mRNA的表达.结果 PCR结果和Western blot法检测证实pDC315-SCL重组腺病毒载体构建成功,滴度达到1×1010 PFU/ml,对膀胱Cajal样间质细胞的转染率高达98%,RT-PCR法检测转染Cajal样间质细胞后SCL mRNA有表达.结论 成功构建pDC315-SCL重组腺病毒载体对Cajal样间质细胞有很强的转染能力,可介导SCL基因在Cajal样间质细胞的表达.     

大鼠β防御素2基因慢病毒载体的构建及功能检测

目的 构建大鼠β防御素2（rBD2）基因慢病毒表达载体,并转染培养细胞检测其表达,为rBD2研究及大鼠体内实验奠定基础.方法 提取大鼠上皮细胞总RNA,PCR扩增获得rBD2基因,双酶切PCR产物和慢病毒载体Lentivirus[含H1启动子和绿色荧光蛋白（GFP）],连接构成rBD2基因慢病毒表达载体LV-rBD2,行测序鉴定.用慢病毒包装系统对LV-rBD2进行慢病毒颗粒包装并梯度稀释法测定病毒滴度,病毒液感染培养细胞,RT-PCR和Western Blot检测rBD2表达.结果 凝胶电泳和测序结果表明rBD2基因克隆到慢病毒载体中,序列正确.完成慢病毒颗粒包装,调整病毒滴度至1×105ifu/μl.RT-PCR和Western-Blot显示rBD2基因获得表达.结论 rBD2基因慢病毒表达载体LV-rBD2被成功构建,能转染细胞并获得有效表达.     

大鼠ZnT1基因siRNA慢病毒载体构建及筛选

目的:构建并筛选针对SD大鼠锌离子转运体1(ZnT1)的siRNA慢病毒载体。并检测其在大鼠神经元中的作用。方法:设计并合成针对ZnT1基因的3条(A,B,C)siRNA序列与1条阴性对照序列,将以上序列退火与pFU-GW-iRNA质粒相连接,通过测序鉴定后,分别与慢病毒包装质粒共感染293T细胞,检测收获病毒滴度后感染体外培养的SD大鼠脑皮层神经细胞,设置感染复数(MOI)分别为1,3,6,8,于转染后72 h计算转染效率。在最佳MOI值下,设置未经病毒感染组(CON组)、阴性对照病毒感染组(NC组)和慢病毒阳性干扰组(ZnT1-siR-NA-A组,ZnT1-siRNA-B组,ZnT1-siRNA-C组),72 h后利用Western blot技术检测ZnT1的表达情况,确定对ZnT1蛋白的最有效的干扰序列与抑制效率。结果:测序证实目的干扰序列已被准确克隆到pFU-GW-iRNA质粒,收获的慢病毒颗粒滴度为8×108TU/ml,其在MOI=6时对神经细胞的转染效率最高(93%),并保持神经细胞良好的生存状态。转染后ZnT1的表达被不同程度的抑制,A,B,C三种干扰序列对ZnT1的抑制率分别为47.74%±1.40%,81.19%±1.36%,94.10%±2.41%。结论:成功构建了ZnT1-siRNA慢病毒载体,其在MOI=6时对神经细胞具有最佳的转染效率,并有效沉默神经细胞中ZnT1蛋白的表达。