抗人DR5单克隆抗体mDRA-6对HL-60细胞的诱导凋亡作用

目的 观察抗死亡受体5(DR5)单克隆抗体nDRA-6对HL-60细胞的凋亡作用.方法 制备抗人DR5单克隆抗体mDRA-6;荧光显微镜下观察mDRA-6作用后HL-60细胞的形态变化;MTT法测定不同浓度mDRA-6在不同作用时间对HL-60细胞存活的影响;通过FITC-Annexin V及PI标记细胞,以流式细胞仪检测mDRA-6对HL-60细胞凋亡率的影响;琼脂糖凝胶电泳检测mDRA-6对HL-60细胞DNA片段化的影响.结果 mDRA-6导致HL-60细胞染色质浓缩、断裂,细胞出芽,凋亡小体形成;mDRA-6对HL-60细胞具有明显的杀伤作用,24ng/mL mDRA-6作用HL-60细胞10 h,细胞死亡率达21.2%;1μg/mL的mDRA-6作用8 h,可使HL-60细胞死亡44.1%;Annexin V及PI双染显示,10μg/mL mDRA-6作用2 h,HL-60细胞的凋亡率达48.1%;20μg/mLmDRA-6作用HL-60细胞3 h,DNA琼脂糖凝胶电泳显示明显的"梯形"条带.结论 抗DR5单克隆抗体mDRA-6具有诱导HL-60细胞凋亡作用.     

抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)诱导Jurkat细胞凋亡活性研究

目的：观察抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的死亡受体5（DR5）单克隆抗体——mDRA-6对Jut-kat细胞的凋亡作用。方法：DR5蛋白免疫BALB／c小鼠，融合筛选抗DR5杂交瘤细胞，制备抗人DR5单抗——mDRA-6；光镜下观察mDRA-6作用下Jurkat细胞形态变化；MTT方法计算mDRA-6不同浓度、不同作用时间对Jurkat细胞凋亡率影响。结果：mDRA-6致Jurkat细胞染色质边集、断裂，细胞出芽，凋亡小体形成；MTT法显示mDRA-6具有明显的Jurkat细胞杀伤作用，0.1μg／ml的mDRA-6即可使Jurkat细胞存活率降至77．2％；25．6μg／ml的mDRA-6作用8小时，可使Jurkat细胞存活率降至28．4％；Annexin v及PI双染显示1μg／ml的mDRA-6作用10小时，Jurkat细胞凋亡率达81．82％。结论：抗DR5单抗——mDRA-6具有高效诱导Jurkat细胞凋亡的活性。     

抗DR5单克隆抗体-mDRA-6对白血病细胞的凋亡诱导作用

目的:观察抗死亡受体5(DR5)单克隆抗体(mAb)-mDRA-6对白血病细胞的凋亡作用。方法:DR5蛋白免疫BALB/c小鼠,融合筛选抗DR5杂交瘤细胞,制备抗人DR5mAb-mDRA-6;荧光显微镜下观察mDRA-6作用下白血病细胞Jurkat、HL-60、K562的形态变化;MTT法测定不同浓度的mDRA-6对Jurkat、HL-60、K562细胞存活率的影响;通过FITC-Annexin V及PI标记细胞,以流式细胞术检测mDRA-6对Jurkat、HL-60、K562细胞凋亡率的影响。结果:mDRA-6导致Jurkat、HL-60细胞染色质浓缩、断裂,细胞出芽,凋亡小体形成;mDRA-6对Jurkat、HL-60细胞具有明显的杀伤作用,但对K562的杀伤作用较弱,25mg/L的mDRA-6作用12h,Jurkat、HL-60、K562细胞死亡率分别为88.76%,59.76%,5.18%。Annexin V及PI双染显示1mg/L的mDRA-6作用10h,Jurkat细胞凋亡率为86.06%,10mg/L的mDRA-6作用10h,HL-60细胞凋亡率为48.11%,但10mg/L的mDRA-6作用K562细胞10h,细胞凋亡不明显。结论:抗DR5mAb mDRA-6能够诱导白血病细胞凋亡,不同的白血病细胞株对mDRA-6的敏感性不同。     

抗人DR4、DR5单克隆抗体诱导神经胶质瘤细胞凋亡的实验研究

目的：探讨抗死亡受体DR4、DR5单克隆抗体（mAb）FMU1．4、FMU1．5对3株神经胶质瘤细胞株U343（敏感株）、U138（部分敏感株）、U373（耐受株）的杀伤作用及机制。方法：采用流式细胞术、RT—PCR、免疫细胞化学法、MTT比色法、电泳、DNA倍体分析和Westem blot等方法。结果：DR5在U343高表达；DR4在U373低表达。U343对FMU1．5敏感并呈剂量依赖性、对FMU1．4部分敏感；U138对FMU1．5部分敏感，对FMU1．4耐受；U373对两种抗体耐受。结论：FMU1．4、FMU1．5能不同程度地诱导三株细胞凋亡，其机制与DR4、0115、细胞色素C和FLIP的表达有关。     

FasL、抗人DR5单克隆抗体诱导肿瘤细胞凋亡的研究

目的：探讨FasL、Anti-DR5 mAb对肿瘤细胞Hela、BGC823、MCF-7、1．342、H9101、D6的杀伤作用及机制。方法：采用RT-PCR、MTY比色法、电泳、DNA倍体分析、Western blot等方法。结果：H9101、Hela细胞株DR5 mRNA水平有表达，D6细胞无表达；H9101、1．342细胞株Fas mRNA水平有表达，D6细胞无表达。H9101、1．342细胞株对FasL、Anti-DR5 mAb敏感并呈剂量依赖性；MCF-7、BGC823细胞株对FasL敏感，对Anti-DR5 mAb相对敏感。Hela对FasL相对敏感，对Anti-DR5 mAb敏感；D6对两种凋亡诱导剂耐受。结论：FasL、Anti-DR5 mAb能不同程度地诱导肿瘤细胞凋亡，其机制与Fas、DR5、Caspase-8、Bcl-2的表达有关。     

DR5在TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡中的作用

目的：研究DR5在介导TRAIL凋亡信号中的作用。方法：用含人DR5细胞外全长结构域重组DR5免疫BALB／C小鼠，制备抗DR5单克隆抗体；流式细胞仪检测Jurkat细胞表面DR5表达水平；采用TRAIL凋亡检测试剂盒，检测Jurkat细胞凋亡率及抗DR5单克隆抗体对TRAIL诱导细胞凋亡的阻断率。结果：DR5在Jurkat细胞表面的表达率为94．83％，TRAIL和抗TRAIL单克隆抗体能够诱导Jurkat细胞凋亡，呈现明显的剂量相关性，TRAIL浓度在50-100ng/ml时，杀伤率达90％以上。预先用抗DR5单克隆抗体与Jurkat细胞作用后，TRAIL对Jurkat细胞的杀伤功能几乎完全被mAb所阻断，其平均阻断率达90．49％。结论：DR5在TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡中起着十分关键的作用。     

JNK信号传导通路在抗人DR5单克隆抗体mDRA-6诱导白血病细胞凋亡中的作用

目的:探讨JNK信号传导通路在抗人DR5单克隆抗体mDRA-6诱导白血病细胞Jurkat和U937凋亡过程中的作用.方法:MTT法检测mDRA-6对Jurkat和U937细胞的生长抑制作用;以Caspase抑制剂Z-VAD-FMK和JNK抑制剂SP600125进行干预,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术定量分析Jurkat和U937细胞凋亡;利用免疫印迹技术检测mDRA-6作用下凋亡细胞的JNK蛋白的表达情况.结果:mDRA-6对Jurkat和U937细胞具有明显的生长抑制作用;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测显示,10 μg/ml的mDRA-6作用Jurkat和U937细胞3小时,其凋亡率分别为62.62%和35.65%,JNK抑制剂干预后细胞凋亡明显增加;免疫印迹技术检测显示,mDRA-6作用细胞5分钟后JNK即呈现活性片段表达,并随作用时间的延长其活性增强,而Caspase全抑制剂干预后,5、15分钟JNK磷酸化增强,但随后随时间递减.结论:mDRA-6抑制Jurkat和U937细胞生长并诱导其凋亡,其凋亡过程中有JNK的激活并发挥抗凋亡作用.     

抗人DR5抗体mDRA- 6细胞毒作用机制分析

目的:探讨鼠抗人DR5单克隆抗体(mAb)mDRA-6对Jurkat细胞的细胞毒作用及其机制。方法:以流式细胞术测定mAbmDRA-6对Jurkat细胞的细胞毒作用和细胞凋亡作用,以及caspase8、9的抑制剂对mAbmDRA-6诱导的Jurkat细胞凋亡的影响。在荧光显微镜下,观察mAbmDRA-6对Jurkat细胞形态的影响。以琼脂糖凝胶电泳检测Jurkat细胞中的DNA片段化。结果:mAbmDRA-6对Jurkat细胞具有显著的细胞毒作用,并呈剂量和时间依赖性。经mAbmDRA-6处理后,Jurkat细胞可出现典型的细胞凋亡的形态特征:细胞膜皱缩,出泡,染色质浓缩,形成凋亡小体等。经mAbmDRA-6处理后,Jurkat细胞膜表面高表达丝氨酸磷脂,并可导致Jurkat细胞中的DNA片段化。caspase8的抑制剂可明显抑制mAbmDRA-6诱导的Jurkat细胞凋亡,caspase9的抑制剂的影响很小。结论:mAbmDRA-6可通过死亡受体信号传导途径诱导Jurakt细胞凋亡,对Jurkat细胞产生细胞毒作用,其在以TRAIL/DR5系统进行的肿瘤治疗和探讨DR5功能结构域方面具有广阔的应用前景。     

抗人DR5单克隆抗体诱导HL-60细胞凋亡机制

探讨抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)诱导白血病细胞系HL-60细胞凋亡的可能机制。MTT法检测mDRA-6对HL-60细胞的生长增殖的影响,以及Caspase 8、10、3抑制剂对mDRA-6抑制HL-60细胞生长增殖的影响;琼脂糖凝胶电泳检测HL-60细胞DNA片断化降解;Western blot检测mDRA-6对HL-60细胞Caspase 8、10、3的激活改变。结果发现,mDRA-6呈时间、浓度依赖性地抑制HL-60细胞的生长增殖,10 mg/L的mDRA-6作用HL-60细胞6 h、8 h和10h,细胞增殖抑制率分别为23.96%、44.10%和50.28%;琼脂糖凝胶电泳显示,10 mg/L的mDRA-6作用6 h,HL-60细胞呈现凋亡细胞特有的DNA梯形条带;Western blot检测结果发现,mDRA-6作用HL 60细胞不同时间,Caspase 8均只有酶原条带出现,无激活片段产生,而Caspase 10和Caspase 3显示明显裂解片段产生,并随mDRA-6作用时间延长而增多;预先使用15μmol/L的Caspase 10及Caspase 3抑制剂孵育细胞1 h,能够使mDRA-6对HL-60细胞的生长抑制率分别降低64.15%(t=10.13、P<0.01)和53.69(t=8.93、P<0.01)%,而预先使用15μmol/L的Caspase 8抑制剂孵育细胞1 h,mDRA-6对HL-60细胞的生长抑制率仅降低4.40%(t=0.52、P>0.05)。以上实验结果提示,mDRA-6通过激活Caspase 10启动凋亡信号分子,诱导白血病HL-60细胞凋亡。     

抗人DR5单克隆抗体的制备及其生物活性分析

死亡受体5（Death receptor 5，DR5）为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF—related apoptosis inducing ligand，TRAIL）的特异性、高亲和力受体之一，分为膜结合型与可溶型（Soluble DR5，sDR5）。前者与TRAIL结合后可向细胞内传导凋亡信号，而sDR5因缺乏跨膜区域，虽然可与TRAIL相结合，但不能向细胞内传导凋亡信号。     

诱导细胞凋亡的抗hDR5单抗的研究

目的 研制能诱导肿瘤细胞凋亡的抗人DR5单克隆抗体（McAb）。方法 以可溶性人死亡受体（death receptor，DR）5胞外段免疫小鼠，采用杂交瘤技术制备抗人DR5的McAb；MTT方法筛选分泌有细胞毒活性McAb的杂交瘤细胞；亲和层析方法纯化McAb；夹心ELISA法测定McAb亚型；Western blot和斑点ELISA法检测McAb的抗原表位类型；间接ELISA法检测McAb的特异性；流式细胞仪检测FITC-annexinⅤ／PI双色标记的Jurkat细胞的凋亡率；DNA琼脂糖凝胶电泳测定凋亡细胞的DNA片段化。结果 获得1株杂交瘤细胞，其分泌的McAb命名为mDRA-6，为IgG1；其抗原表位类型为构象表位；其特异性识别hDR5，与hFas、hDR4等无交叉反应。mDRA-6对Jurkat细胞具有细胞毒作用；经McAb mDRA-6处理后，Jurkat细胞膜表面高表达丝氨酸磷脂，并导致Jurkat细胞中的DNA片段化。结论 mDRA-6是一个具有诱导细胞凋亡活性的新的抗人DR5功能性抗体，在以TRAIL／DR5系统进行肿瘤治疗和探讨DR5的功能结构域研究方面具有广泛应用前景。     

抗人DR5单抗与阿霉素联合对人肝癌细胞SMMC-7721协同杀伤效应

目的：探讨mDRA-6对肝癌细胞系SMMC-7721致凋亡作用，及阿霉素与mDRA-6联合协同杀伤效应与机制。方法：常规培养肝癌细胞SMMC-7721，流式细胞术检测细胞表面DR5的表达率。Hoechst33258染色观察SMMC-7721细胞形态变化；MTT法检测细胞毒性作用；流式细胞术定量分析凋亡细胞率。结果：（1）mDRA-6能够诱导SMMC-7721细胞凋亡，在1.89μg／ml浓度下可杀伤36％的细胞，增加mDRA-6浓度，凋亡作用无明显增加；（2）SMMC-7721细胞对阿霉素敏感，存在浓度依赖性；（3）阿霉紊与mDRA-6联合对SMMC-7721细胞具有协同杀伤作用，2μg／ml的mDRA-6与40ng/ml的阿霉素联合杀伤印％SMMC-7721，Hoechst 33258染色和AnnexinV／PI染色证实杀伤作用是通过细胞凋亡实现的。结论：mDRA-6能够诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡，阿霉素与mDRA-6联合具有协同作用。     

抗人DR5单克隆抗体对白血病U937细胞凋亡的作用

目的：研究鼠抗人DR5单克隆抗体（mDRA-6）对白血病细胞U937的凋亡诱导作用。方法：光镜下观察mDRA。6作用后U937细胞的形态变化；流式细胞术检测15937细胞表面DR5表达率；MTT法检测mDRA-6对U937细胞生长的影响；AnnexinV—FITC／PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡率；琼脂糖凝胶电泳检测U937细胞DNA的片段化降解；JC-1单染流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位改变。结果：mDRA-6作用U937细胞后呈现典型的细胞凋亡特征；MTT法检测显示mDRA-6作用U937细胞24小时死亡率为61．09％，并呈时间、浓度依赖性；流式细胞仪检测显示10mg/L的mDRA-6作用4小时，U937细胞凋亡率为79．12％；琼脂糖凝胶电泳显示DNA呈现明显梯状带型；mDRA-6作用U937细胞后线粒体膜电位明显下降。结论：mDRA-6能够诱导白血病U937细胞凋亡，是具有诱导细胞凋亡活性的功能性抗体。     

柚皮素增强抗人DR5单抗对人肝癌细胞系HepG2的凋亡作用

探讨柚皮素增强抗人DR5单克隆抗体对人肝癌细胞系HepG2的凋亡作用及可能机制。MTT法检测柚皮素及抗人DR5单抗对人肝癌细胞系HepG2的生长抑制作用;Annexin V/PI双染分析细胞凋亡;蛋白免疫印记检测Caspase 8的表达;流式细胞术检测HepG2细胞表面DR5的表达。结果显示,10 mg/L的mDRA-6作用于HepG2细胞12 h后细胞增殖抑制率为39%;10 mg/L的mDRA-6分别与200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L柚皮素共同作用于HepG2细胞后细胞增殖抑制率分别增加至58%、79%、85%;Annexin V/PI双染及流式细胞术检测结果表明,2 mg/L的mDRA-6作用细胞12 h后细胞凋亡率为16%,2 mg/L的mDRA-6和400μmol/L柚皮素共同作用于HepG2细胞12 h后细胞凋亡率增加为63%;mDRA-6和柚皮素共同作用于HepG2细胞后,蛋白免疫印记结果显示Caspase 8的激活片段明显显现,流式细胞术检测HepG2细胞表面DR5的表达,其基础表达率为49%,400μmol/L柚皮素作用于HepG2细胞12后,HepG2细胞表面DR5的表达率增加为81%。实验显示柚皮素可增强抗人DR5单克隆抗体对人肝癌细胞系HepG2的凋亡作用,其可能机制为柚皮素诱导HepG2细胞表面DR5受体表达上调所致。