四川资阳地区猪链球菌2型检测及其特性比较研究

目的对从四川省资阳及附近猪链球菌2型感染疫区采集的病料进行病原菌分离和特性比较研究。方法首先利用病原菌分离技术、多重定性PCR检测和荧光定量PCR检测技术进行病原菌的分离和鉴定;然后选取5株主要疫点代表菌株与1株国外参考菌株进行细菌药敏试验和实验动物腹腔接种感染试验;此外还对猪链球菌2型分离株基因组中的溶原性噬菌体进行了初步研究。结果(1)从采集的病料中分离到11株猪链球菌2型菌,都具有胞外因子(EF)和溶菌酶释放蛋白(MRP)两个特征性毒力因子;(2)6株试验菌株对氨苄青霉素、先锋必素、头胞克肟、乙酰螺旋霉素、万古霉素、复方新诺明和利福平等7种抗生素高度敏感。与国外参考菌株相比,资阳分离株具有链霉素抗性;(3)试验菌株对BALB/c鼠均具有一定的毒力,但毒力程度上有差异。资阳分离株449-1和国外参考株6#对鼠具有相同的强致死性(3/3死亡),资阳458分离株致死性较弱(0/3死亡),其它菌株具有中等强度的致死性。利用449-1、458和6#分离株进行家兔感染实验,各菌株均可引起家兔感染发病,死亡率分别是1/2、2/2和2/2;(4)国内首次获得了猪链球菌2型流行菌株匿藏着溶原性噬菌体的证据,该噬菌体与细菌毒力和适应性的关系有待深入研究。结论通过对资阳及附近地区猪链球菌2型分离株与国外分离株特性的比较研究,明确了流行菌株间在毒力和药物敏感性上存在着差异,细菌毒力差异表现为对动物种属的嗜性,并筛选出了猪链球菌病防治的可选择性药物。为进一步研究猪链球菌2型菌株的致病机理以及猪链球菌病的防治奠定了基础。     

2006-2017年四川省临床分离猪链球菌2型的病原学特征

目的 了解四川省2006-2017年临床分离猪链球菌2型的病原学特征。方法 对2006-2017年四川省临床分离的28株猪链球菌2型进行毒力基因检测、药物敏感性分析、脉冲场凝胶电泳分析(PFGE)。结果 28株猪链球菌2型分为2种毒力基因型,1株为cps2J+/mrp-/sly+/gapdh+/ef+型别,其余均为cps2J+/mrp+/sly+/gapdh+/ef+型别;药敏检测结果显示,28株猪链球菌对第三代、第四代头孢菌素类、碳青霉烯类、青霉素、左氧氟沙星、利奈唑胺、万古霉素、氯霉素、达托霉素均敏感,对四环素均耐药。28株猪链球菌中,仅2株对克林霉素、阿奇霉素、红霉素耐药,其余均敏感。PFGE分析结果显示,28株猪链球菌呈现6种PFGE图谱,相似性为76%,其中23株是完全相同的图谱,占82.14%;2006-2007年分离的19株菌呈现完全相同的PFGE图谱,2010年后分离的9株呈现出6种PFGE图谱。结论 2006-2017年四川省临床分离猪链球菌2型流行株的毒力基因型主要为高致病性cps2J+/mrp+/sly+/gapdh+/ef+型别,对β-内酰胺类药物敏感,2006、2007年不同市区临床分离的猪链球菌2型为统一来源,2010年后分离的菌株PFGE图谱相似度较低。     

猪链球菌2型和9型菌株的多重PCR检测

目的建立一种快速、特异且敏感的检测方法。方法以猪链球菌2型和9型的荚膜多糖抗原编码基因簇中的cps2J和cps9H基因、猪链球菌2型的主要毒力因子编码基因epf和mrp为靶基因设计了四对引物,建立了检测猪链球菌的多重PCR反应体系。用编码cps2J和cps9H基因的引物可对猪链球菌2型和9型进行分型,用编码epf和mrp基因的引物可鉴定猪链球菌2型的主要毒力相关基因。用该多重PCR反应体系对10株猪链球菌分离株进行了鉴定,并以其它几株阴性对照菌株进行对照,检测了该反应体系的特异性。以新鲜培养的猪链球菌2型菌株进行倍比稀释后进行菌落计数,并将之作为模板,对该多重PCR反应体系检测的敏感性进行了鉴定。结果10株猪链球菌分离株中有5株是9型菌株,另有5株是2型菌株,2型菌株有2种基因型:3株cps2+mrp+epf+型,2株cps2+mrp-epf-型。同时还表明该多重PCR反应体系有高度的特异性和敏感性,当模板含量在10cfu时仍能检出目的菌株。结论该多重PCR反体系是一种检测和鉴定猪链球菌2型的快速、特异且敏感的方法。     

猪链球菌2型福建分离株的主要毒力基因分析

目的为了解福建地区猪链球菌2型菌株毒力因子分布情况。方法选取谷氨酸脱氢酶(gdh)、荚膜多糖(cps)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(ef)、溶血素(sly)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(fbps)及毒力相关序列orf2等7个猪链球菌2型主要毒力基因,分别设计了7对引物,采用PCR方法,对本室分离保存的猪链球菌2型福建分离株的毒力基因进行分析。结果从屠宰生猪体内分离的4个猪链球菌2型菌株和SS2PFJ07株基因型为gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/fb-ps+/orf2+,另1株从生猪体内分离的分离菌株基因型为gdh+/cps2J+/mrp+/ef+/sly+/fbps+/orf2+。结论福建地区生猪中猪链球菌2型至少有两种毒力基因型。     

从正常屠宰猪扁桃体中分离到致病性猪链球菌2型

目的从江苏省某屠宰场采集的40份屠宰猪的扁桃体中分离到一株细菌,通过玻片凝集试验、培养特性、菌体形态、菌落形态、染色特性、生化试验、PCR检测试验,确定为猪链球菌2型,编码为HA0610。进一步研究发现,该菌株含有已知的8种主要毒力因子基因,动物试验显示对猪和兔均有较强的致病性。结果表明,在正常猪扁桃体中可携带对猪有高度致病性的猪链球菌2型。     

3个猪链球菌2型四川分离株4个毒力因子基因序列测定与分析

目的设计了特异性引物对3个致病性猪链球菌2型(Ss2)四川分离株4个主要毒力因子基因mrp、epf、sly和orf2分别进行了扩增,序列测定与分析结果表明3个Ss2四川分离株均存在4个毒力因子基因mrp、epf、sly和orf2,其核苷酸序列与1998年江苏分离株9801及国外参考菌株的同源性均大于99.5%,提示3个四川分离菌株与1998年江苏流行的高毒力菌株可能具有共同的来源。     

表观健康猪群携带猪链球菌情况流行病学调查

目的了解我国不同地区表观健康猪群携带猪链球菌的情况。方法从我国20个不同地区屠宰场采集248份扁桃体,进行增菌培养后用PCR方法进行猪链球菌种型鉴定并用血清凝集试验复检,最后用多位点序列分型(Multilocus se-quence typing,MLST)系统研究各菌株之间的遗传关系。结果从248份扁桃体中共检出14株猪链球菌(检出率为5.65%),其中3株为猪链球菌2型,2株为猪链球菌7型,1株为猪链球菌9型,8株未定血清型;对6株定型菌株进行毒力因子(mrp、epf、sly、orf2、fbps、gapdh)检测发现5种毒力基因型:A1Cps2+mrp-epf+sly+orf2+fbps+gapdh+、A2Cps2+mrp-epf+sly-orf2-fbps+gapdh-、A3Cps7+mrp+epf-sly-orf2-fbps-gapdh+、A4Cps9+mrp-epf-sly-orf2-fbps+gapdh+、A5Cps7+mrp-epf-sly-orf2+fbps+gapdh+,A1和A2型的分离株为弱毒株,其他型菌株的毒力无法确定;经MLST分析,3株猪链球菌2型属于ST1,1株猪链球菌7型属于ST29,1株猪链球菌9型(CQ15)属于一个国际上未报道过的新ST型,该型被猪链球菌MLST数据库(http://ssuis.mlst.net)收录并编号为ST128。结论不同地区表观健康猪群平均带菌率为5.65%,分离到的猪链球菌2型均为弱毒株。     

猪链球菌2型的分子流行病学研究

目的　了解猪链球菌 2型高发地区 (疫区 )与少发地区 (非疫区 )猪群的带菌率及其毒力因子MRP与EF的分布情况 ,探讨猪链球菌 2型的发生及其流行规律。方法　分别从不同地区采集正常屠宰猪或活体采集成年猪扁桃体 ,经接种马丁汤培养基增菌培养后 ,用PCR方法进行 2型猪链球菌的检测 ,同时检测各 2型菌的主要毒力因子溶菌酶释放蛋白 (MRP)与细胞外蛋白因子 (EF)基因 (mrp和epf)。 结果　除少数猪群外正常猪群中猪链球菌 2型的带菌率普遍较高 ,为 31 6 %～77% ,平均为 4 0 9% ,且疫区 (39% )与非疫区 (42 % )差异不明显。但毒力因子mrp和epf的阳性率疫区与非疫区存在明显差异 ,非疫区的 2型菌株除极少数表现为mrp+ epf-(5 % )或mrp-epf+ (5 % )外 ,绝大多数 (90 % )都表现为对猪无毒力的mrp-epf-表现型 ,无一株表现为mrp+ epf+ ;来自疫区的所有 16株 2型菌株均为对猪有强毒力的mrp+ epf+ 表现型。结论　正常猪群中 2型猪链球菌的带菌率与猪群是否暴发流行该病可能并无直接关系 ,但疫区猪群mrp+ epf+ 表现型菌株检出比率较高 ,提示携带mrp+ epf+ 表现型菌株的猪可能是本病的主要潜在传染源     

福建猪群猪链球菌2型血清学调查与分析

为了解福建省猪群猪链球菌2型的感染情况,应用猪链球菌2型抗体检测试剂盒测定1033份采自福建省9个地区65家猪场的血清样品和304份临床血清样品。结果显示,福建各地区猪链球菌2型血清抗体猪场阳性率为50%～100%,阳性猪场数占被检猪场总数的78.46%(51/65);抗体阳性猪群中个体阳性率为7.14%～100%,平均阳性率为34.82%(297/853),阳性率≥50%的猪场数占检出阳性场总数的37.25%(19/51)。所有被检样品的平均阳性率达到25.65%(343/1337)。这些结果说明显示本省大多数猪场存在猪链球菌2型菌株污染,相当比例的猪群存在猪链球菌2型隐性感染,具有发生2型猪链球菌病的风险。     

浙江省首例14型猪链球菌人源分离株鉴定及分子特征分析

目的 对浙江省首例14型猪链球菌菌株进行综合鉴定与分子分型特征研究。方法 对目标菌株进行镜检、生化、血清学玻片凝集试验、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI TOF MS)鉴定,同时利用聚合酶链(PCR)技术检测该菌株链球菌属(tuf)、猪链球菌种(16S rRNA)、猪链球菌血清型基因以及毒力基因,另采用脉冲场凝胶电泳技术(pulsed-fieId gel electrophoresis, PFGE)、多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)以及最小核心基因组群(minimum core genome groups, MCG群)方法分别对菌株进行分子分型检测。结果 传统细菌学方法和质谱鉴定技术以及核酸检测均将这株人源分离株鉴定为14型猪链球菌;25种毒力基因检测,除salKR与89K PAI基因检测为阴性,其它均为阳性;分子分型检测该菌株为高致病性ST1及MCG Group1型,PFGE检测结果表明此菌株同浙江省主要流行毒力株在同一主分支,相似性达94.95%。结论 本次检出14型人源猪链球菌强毒力株,属高致病基因型ST1/MCG G...     

徐州市7株猪链球菌病原学分析及分子分型研究

目的 对2020-2022年徐州市3起人感染猪链球菌疫情中分离到的7株猪链球菌进行鉴定和分型,了解本地区猪链球菌的病原学特征和流行特点。方法 采集与病例相关猪的鼻拭子和外环境等标本进行猪链球菌分离,采用飞行质谱和VITEK-2 Compact等微生物鉴定系统进行鉴定,对分离到的猪链球菌进行血清型、毒力基因的检测,并通过多位点序列分型(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)等方法进行分子分型和溯源分析。结果 6株猪链球菌为血清2型,其中2021年人源(1株)与猪源(3株)猪链球菌荚膜多糖基因(cps2J)、溶菌酶释放蛋白基因(mrp)、细胞外蛋白因子基因(ef)和溶血素基因(sly)检测均为阳性,多位点序列分型结果为ST7型,PFGE同源性为100%,推断人可能因宰杀带菌猪时通过破损的伤口而感染;2020年和2022年临床分离株mrp基因缺失,多位点序列分型结果为ST1型。2022年外环境分离菌株不携带4种所检测的毒力基因,非数据库中已知ST型别。结论 本地区分离到的猪链球菌株携带多种毒力基因,致病菌株主要为血清2型,ST1和ST7型。     

广东省布鲁氏菌分离株的分子特征分析

目的了解广东省布鲁氏菌分离株的分子特征。方法应用传统分型鉴定方法和PCR扩增布鲁氏菌属特异性基因BCSP31,对广东省历年布鲁氏菌分离株作鉴定分型,进一步采用脉冲场电泳技术(PFGE)进行分子分型,分析比较菌株分子指纹图谱的相似性,以探讨不同年份和地域菌株之间的相关性。结果1965年广东省布鲁氏菌分离株以羊种和猪种为主,1985年的分离株均为猪种3型,2006和2007年的分离株均为羊种3型;PFGE电泳图谱经聚类分析结果显示,历年布鲁氏菌分离株分成三大簇(Clusters):1965年羊种、1965年猪种与1985年猪种3型、2006年和2007年羊种3型。近两年珠三角地区布鲁氏菌病的流行优势菌型为羊种3型,且同源性达100%,但与1965年羊种分离株的同源性只有77.7%。结论近两年我省布鲁氏菌的优势菌型为羊种3型,各地区分离株之间的遗传关系高度相关,与20年前的分离株同源性差。PFGE可作为传统生物分型的补充手段,可在种的水平对布鲁氏菌分离株分型。     

猪链球菌2型的Real-time PCR定量检测研究

目的 建立了基于TaqMan探针的Real-time PCR方法，实时、定量检测猪链球菌2型。针对GenBank公布的猪链球菌2型的csp2J基因序列设计一对引物和TaqMan探针，建立了Real-time PCR检测方法，制作标准曲线，定量检测猪链球菌2型。通过对6种细菌（9株菌株）的DNA进行扩增。结果所有4株猪链球菌2型均可产生扩增曲线，其他5株非猪链球菌2型均不产生扩增曲线。细菌纯培养物的检测敏感度为6～8CFU／PCR反应体系，相关系数均为0．99（r^2=0．99），整个试验可在1．5h内完成。建立的方法可用于猪链球菌2型的快速、定量检测。     

广东省猪链球菌2型菌株毒力基因及分子分型分析

目的 掌握广东地区猪链球菌2型菌株毒力因子及分子分型情况,为诊断、治疗和制定防控措施提供科学依据。方法 选取荚膜多糖(cps2J)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、溶血素(sly)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、胞外因子(ef)等5个猪链球菌2 型主要毒力基因,分别设计引物对分离自病人、病猪的22株猪链球菌2 型菌株进行PCR检测,并对菌株进行MLST分型分析。结果 22株菌分为5种毒力基因型,其中cps2J+/mrp+/sly+/gdh+/ef+型别为病人及病猪菌株所共有,cps2J+/mrp+/sly-/gdh-/ef+、cps2J+/mrp+/sly-/gdh+/ef+为病人菌株所特有,cps2J+/mrp-/sly+/gdh+/ef+、cps2J+/mrp-/sly-/gdh+/ef-为病猪菌株所特有;MLST分型结果显示,22株分为ST1、ST7和ST28三个型别,其中ST1、ST7型为病人和病猪菌株所共有,均同属于ST1克隆复合物,ST28型为病猪所特有。结论 广东地区病人、病猪的猪链球菌2 型菌株毒力基因型及MLST分子分型均呈现多样化,且部分型别为两者所共有,为阐明猪传染给人提供了直接的证据。