二羟环氧苯并芘恶性转化细胞的microRNA表达谱

目的 检测二羟环氧苯并芘(BPDE)恶性转化细胞的microRNA(miRNA)表达谱,寻找恶性转化细胞与对照细胞差异表达的miRNA.方法 以溶剂二甲亚砜助溶的终浓度为2.0 μmol/L的BPDE培养液培养人支气管上皮细胞株16HBE,获得BPDE恶性转化的细胞模型为实验组,同时,以含二甲亚砜的培养液培养正常16HBE作为对照组.通过微阵列技术检测实验组与对照组327个人类miRNA,并选择差异表达明显的miR-10a和miR-320用反转录荧光定量PCR方法对微阵列结果加以验证.结果 获得2组细胞327个miRNA表达谱,发现差异表达miRNA 55个,其中46个表达上调,9个表达下调,并得到反转录荧光定量PCR的验证.结论 获得BPDE恶性转化细胞与正常16HBE细胞差异表达的miRNA,为进一步寻找BPDE恶性转化细胞特征性miRNA提供了研究基础.     

苯并(a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘诱发人支气管上皮细胞恶性转化

以不同浓度的苯并 (a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘 (BPDE)多次处理人支气管上皮细胞 16HBE ,并观察转化细胞的恶性特征。发现BPDE可诱导 16HBE细胞恶性转化 ,形成转化灶。转化灶细胞失去接触抑制 ,排列紊乱 ,无方向性 ,交叉重叠生长。转化的细胞可在软琼脂上生长 ,各浓度处理组细胞集落形成率均显著高于对照组 ,有良好的剂量—反应关系。经BPDE处理的细胞在裸鼠体内成瘤 ,病理学诊断为鳞状细胞癌。本实验以反式BPDE成功地诱发了人支气管上皮细胞恶性转化 ,为后期进一步研究其致癌的分子机制、寻找致癌相关基因提供了理想的生物学材料。     

基因芯片筛选BPDE转化16HBE相关基因

目的 采用基因芯片技术筛选二羟环氧苯并芘（BPDE）转化的人支气管上皮细胞（16HBE）相关基因，探讨该技术在分子毒理学研究中的应用。方法 将实验组（BPDE-16HBE）和对照组（16HBE）的mRNA逆转录合成cDNA掺入荧光分子为探针，杂交于H40S基因芯片。分析2组基因的差异表达。结果 在4096种人类基因中。BPDE转化的16HBE和正常16HBE问存在差异表达的基因有143条，其中高表达52条，低表达41条。结论 基因芯片技术在筛选BPDE转化的16HBE相关基因改变上，具有高通量、高敏感、快速等特点，在毒物的分子致癌机制研究中意义萤大．     

二羟环氧苯并芘诱导转化与翻译延长因子的关系

目的探讨真核翻译延长因子1α1(eTEF1α1)基因在反式二羟环氧苯并芘致癌机制中所起的作用。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增真核翻译延长因子1α1基因全长,插入pcDNATM3.1 D irectional TOPO表达载体,以脂质体转染介导的技术和G418细胞筛选法转染人支气管上皮细胞,构建转基因稳定表达的细胞株。用半定量RT-PCR方法分析转基因表达产物,对转基因细胞株,进行双层软琼脂试验以确定基因的恶性特性。结果成功扩增出eTEF1α1基因全长,构建出稳定表达真核翻译延长因子1α1基因的细胞株。稳定转染eTEF1α1基因的细胞株,能在双层软琼脂中形成克隆。结论真核翻译延长因子1α1基因与反式二羟环氧苯并芘的恶性转化有关。     

二羟环氧苯并芘对人支气管上皮细胞N-Ras基因表达的影响

目的 探讨环境致癌物苯并(a)芘代谢物二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞N-Ras基因表达的影响.方法利用RT-PCR和Western blot方法,分别检测N-Ras基因在经BPDE恶性转化细胞中mRNA和蛋白表达水平的变化.利用免疫细胞化学方法检测N-Ras基因在经BPDE恶性转化细胞中定位和蛋白表达量的变化.结果 RT-PCR和Western blot实验表明,BPDE恶性转化细胞N-Ras基因的mRNA和蛋白水平分别是正常细胞的3.616和1.600倍.免疫细胞化学实验显示,在BPDE恶性转化细胞和正常细胞中,N-Ras基因在细胞膜和细胞浆中均有表达,且两者相比,前者中的N-Ras蛋白表达明显强于后者.结论 N-Ras基因可能在BPDE的致癌机制中起着重要作用.     

miR-542-3p在反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘诱导致癌中的作用

目的 探讨反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(anti-BPDE)诱导恶变的人支气管上皮细胞(16HBE-T)中miR-542-3p在细胞恶性转化中的作用.方法 运用实时荧光定量PCR法验证miR-542-3p成熟体在16HBE-T和非转化对照细胞(16HBE-N)中的表达水平.瞬时转染化学合成的miR-542-3p模拟物上调16HBE-T的miR-542-3p成熟体表达水平,检测miR-542-3p表达水平改变对16HBE-T细胞的增殖能力、细胞周期、细胞凋亡、软琼脂克隆形成率及细胞迁移能力的影响.结果 转染前16HBE-T中miR-542-3p成熟体表达水平是16HBE-N的(39.08±6.95)%(t=15.18,P＜0.05).瞬时转染化学合成的miR-542-3p模拟物上调16HBE-T的miR-542-3p成熟体表达水平后,16HBE-T中miR-542-3p成熟体表达水平是转染前的(5.23±0.55)倍(t=17.37,P＜0.05).miR-542-3p模拟物组(mimic组)与16HBE-T组(100%)相比,增殖率下降到(62.06±5.61)%(t=-17.28,P＜0.05),G0/G1期比例上升到(74.76±4.86)%(t=4.53,P＜0.05),克隆形成率降低为(5.87±0.67)%(t=-6.66,P＜0.05).mimic组生长细胞覆盖区面积比(0.31±0.08)明显降低(t=-6.78,P＜0.05),凋亡无改变.结论 miR-542-3p表达水平升高会降低anti-BPDE恶性转化细胞的增殖能力和恶性程度,推断miR-542-3p是类抑癌基因,在anti-BPDE诱导致癌过程中低表达的miR-542-3p可能是促成恶性转化的重要因素.

Abstract：

Objective To explore the effect of miR-542-3p in malignant transformation of human bronchial epithelial cells (16HBE) induced by anti-benzo(a) pyrene-7,8-diol-9, 10-epoxide (anti-BPDE).Methods The relative expression level of mature miR-542-3p in transformed cells (16HBE-T) and untransformed control cells (16HBE-N) was measured by real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR). miRNA mimic was transiently transfected into 16HBE-T to change the expression level of miR-542-3p,and then the influenced changes of cell proliferation,cell cycle, apoptosis, and soft agar colony formation rate and the migration of transfected cells were analyzed. Results Before transfection, the expression level of mature miR-542-3p in 16HBE-T was lower (39. 08 ± 6. 95 ) % than it in 16HBE-N ( t =15. 18,P＜ 0.05). In comparison with the 16HBE-T group, the expression level of miR-542-3p in miR-542-3p mimic-transfected group was ( 5.23 ± 0. 55 ) fold ( t = 17. 37, P ＜ 0. 05 ) after transfection. Cell proliferation of mimic-transfected group was decreased to ( 62. 06 ± 5. 61 ) % ( t = - 17. 28, P ＜ 0. 05 ),percentage of cells in G0/G1 phase up to ( 74. 76 ± 4. 86 ) % ( t = 4. 53, P ＜ 0. 05 ), rate of colony formation degrade to(5.87 ± 0. 67 ) % ( t = - 6. 66, P ＜ 0. 05 ), coverage areas ratio decreased to (0. 31 ± 0. 08 ) ( t =-6. 78 ,P ＜0. 05 ). There was no change with apoptosis. Conclusion Our studies showed that miR-542-3p played the role as a tumor suppressor, which led to a significant decrease in the proliferation capacity and degree of malignancy. These findings suggest aberrantly down-regulated miR-542-3p may be one critical factor that contributes to malignant transformation of 16HBE induced by anti-BPDE.     

cDNA代表性差异分析法筛选二羟环氧苯并芘致癌相关基因片段

目的采用cDNA代表性差异分析法,分离二羟环氧苯并芘诱导恶性转化的细胞与对照组细胞之间的差异表达基因。方法先从细胞中提取mRNA并合成双链cDNA,双链DNA以Sau3AI内切酶消化,连接接头并经PCR扩增。以BPDE诱导恶变细胞的cDNA为“检测子”、以对照组细胞cDNA为“驱赶子”进行消减杂交。结果经3轮消减杂交后分离出5个cDNA片段,在琼脂糖凝胶上清晰显示210bp以下的5条条带,这些片段分别与总RNA作Northern印迹杂交证实它们均来自BPDE诱变的细胞。结论cDNA代表性差异分析法是筛选化学致癌相关基因的有效、灵敏的方法。     

miR-17-5p与反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘诱导转化的人支气管上皮细胞生物学特性的关系研究

目的探讨miR-17-5p对反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(anti-BPDE)诱导转化的人支气管上皮细胞(16HBE-T)的生物学特性方面的影响。方法运用逆转录定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-17-5p成熟体在16HBE-T和非转化对照细胞(16HBE-N)的相对表达水平。通过瞬时转染miRNA模拟物及抑制剂,改变16HBE-T中miR-17-5p的表达,分析转染后16HBE-T的增殖能力、细胞周期、细胞凋亡和软琼脂集落形成率等。结果转染前,16HBE-T中miR-17-5p表达水平是16HBE-N的2.35倍;转染后,转染miR-17-5p抑制剂组和转染miR-17-5p模拟物组中的miR-17-5p表达水平分别是16HBE-T的0.45和1.71倍。与抑制剂阴性对照组相比,转染了miR-17-5p抑制剂的试验组出现增殖能力下降、细胞周期阻滞和凋亡上升、克隆形成率下降。相反,转染了miR-17-5p模拟物的试验组与模拟物阴性对照组相比出现了增殖能力上调、凋亡减少,克隆形成率升高。结论 anti-BPDE恶性转化细胞中miR-17-5p成熟体表达水平改变能够影响16HBE-T的增殖能力、细胞周期和凋亡、克隆形成率,推断miR-17-5p在anti-BPDE致癌过程中发挥类癌基因作用。     

反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘诱导恶变细胞中miR-494和miR-22的功能及PTEN的表达

目的分析反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(anti-BPDE)诱导转化人支气管上皮细胞第30代(16HBE-T30)及其前期第15代细胞(16HBE-T15)miR-494及miR-22的表达水平,探讨其在化学致癌过程中的作用及对靶基因PTEN抑癌基因的调控。方法以16HBE-T30和16HBE-T15细胞为实验组,溶剂处理组分别为其相应的对照组细胞(16HBE-N30和16HBE-N15),用茎环结构逆转录引物定量RT-PCR检测四组细胞miR-494及miR-22成熟体表达水平。运用定量RT-PCR和Western blotting分别检测四组细胞PTEN mRNA和蛋白表达水平。运用miRNA前体及抑制剂对miNRA表达进行调控后,再检测PTEN的表达改变,并进行报告基因信号改变、细胞凋亡、软琼脂集落形成率等分析。结果 16HBE-T30中miR-494和miR-22表达水平分别是16HBE-N30的12.6和2.3倍,而16HBE-T15中miR-494、miR-22表达水平较16HBE-N15下降。16HBE-T30中PTEN蛋白表达量低于16HBE-N30。与前体阴性对照组相比,上调的miR-494和miR-22分别将PTEN蛋白的表达量降低至0.8和0.5倍,而降低的miR-494和miR-22分别将PTEN蛋白的表达量上调至1.3和1.5倍。在16HBE-T30细胞中,miR-494和miR-22表达下调均增强caspase-3/7活力,miR-494和miR-22表达上调则减弱其活力。miR-494和miR-22下调能够降低转化细胞的恶性程度。结论 anti-BPDE恶性转化细胞中miR-494和miR-22在转录后水平反向调控靶基因PTEN的表达,这两种miRNA在anti-BPDE致癌过程中发挥类癌基因作用。     

错配修复基因在氯化镉致16HBE细胞转化中作用

目的探讨氯化镉诱发人支气管上皮(16HBE)细胞系恶性转化过程中错配修复基因hMSH2和hMLH1的mRNA和蛋白动态变化情况。方法用反转录一聚合酶链反应(PT-PCR)和免疫组织化学(SP法)检测16HBE细胞、氯化镉恶性转化16HBE细胞系不同阶段(第5,15,35代细胞及成瘤细胞)hMSH2基因和hMLH1基因的mRNA和蛋白的表达情况。结果随着转化代数的增加,hMSH2基因mRNA和蛋白的表达逐渐降低,至第35代细胞后表达明显下降(P<0.01);而hMLHl基因的mRNA和蛋白表达水平在氯化镉恶性转化16HBE细胞过程中无明显变化差异(P>0.05)。结论错配修复基因hMSH2表达水平的下调可能是镉化物分子致癌的重要机制。     

烹调油烟冷凝物诱导人胚肺细胞恶性转化研究

为探讨和评价烹调油烟对人体潜在的致癌危险性,运用人胚肺二倍体细胞转化系统,检测烹调油烟冷凝物对细胞的转化作用以及转化细胞的生物学特性。结果:各剂量的烹调油烟冷凝物均可诱导细胞产生典型转化灶,剂量反应关系明显(r=0.9739),表现出恶性细胞特征。提示烹调油烟对人体具有潜在致癌危险性。     

NiCl2诱导人支气管上皮细胞系恶性转化的研究

目的 建立NiCl2诱导永生化人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化的模型，为下一步关于镍化合物致癌的分子机制的研究提供相应的恶性转化细胞。方法 通过克隆形成率实验确定NiCl2诱导16HBE细胞转化浓度后，对16HBE细胞进行分阶段多次染毒，每隔20d染毒1次，每次染毒24h。染毒12次后，通过软琼脂集落形成试验和裸鼠体内致瘤试验鉴定细胞恶性转化程度。结果 经NiCl2多次处理，16HBE细胞至75代时，细胞生长速度加快，排列紊乱，失去接触抑制，出现复层生长，并可在软琼脂上生长，且呈剂量一反应关系，但在第75代之前的细胞则不能在软琼脂上生长。转化细胞在裸鼠体内成瘤，病理组织学证实为低分化鳞状细胞癌。结论NiCl2具有使16HBE细胞发生恶性转化的能力。     

三氧化二镍诱导人肺成纤维细胞恶性转化的实验研究

在体外用不同浓度的Ni₂O₃多次处理人肺成纤维细胞(HLF),并进行转化细胞的恶性鉴定——刀豆凝集素A(ConA)试验和软琼脂细胞培养试验.发现Ni₂O₃可诱导HLF细胞恶性转化,转化细胞生长速度加快,排列紊乱,失去接触抑制,呈交叉重叠生长,在实验浓度范围内,转化率呈剂量-反应关系.转化细胞可被低浓度ConA凝集,并在软琼脂内生长.提示Ni₂O₃有较强的诱导人肺成纤维细胞恶性转化的能力,具有致癌性.     

硫酸镍对永生化人支气管上皮细胞系的恶性转化研究

目的 建立硫酸镍(NiSO4)对永生化人支气管上皮细胞系(16HBE)的恶性转化模型，为下一步关于镍化合物致癌的分子机制的研究提供相应的恶性转化细胞。方法 通过克隆形成率实验确定NiSO4对16HBE细胞转化浓度后，对16HBE细胞进行分阶段多次染毒：每隔20d染毒一次，每次染毒24h。染毒12次后，通过软琼脂集落形成实验和棵鼠体内致瘤实验鉴定细胞恶性转化程度。结果 经NiSO4多次处理16HBE细胞至75代时，细胞生长速度加快，排列紊乱，失去接触抑制，出现复层生长，并可在软琼脂上生长，且呈剂量反应关系，但在第75代之前的细胞则不能在软琼脂上生长。转化细胞在裸鼠体内形成瘤，病理组织学证实为低分化鳞状细胞瘤。结论 NiSO4具有使16HBE细胞发生恶性转化的能力。     

P53、MDM2、P21、P16在云锡矿粉诱导的人支气管上皮恶性转化细胞中的表达

[目的]研究P53通路相关蛋白在云锡矿粉诱导的细胞恶性转化过程中的变化情况。[方法]采用免疫荧光细胞化学染色技术分别检测正常人支气管上皮细胞株(BEAS-2B)、矿粉作用后第25代细胞(BEAS-MD-25)及软琼脂克隆形成细胞(BEAS-MD-C)中P53、MDM2、P21、P16的表达。[结果]P53、MDM2蛋白在BEAS-2B细胞中表达呈阴性,而在BEAS-MD-25及BEAS-MD-C细胞中均呈阳性;P21、P16蛋白在BEAS-2B细胞中表达呈阳性,随细胞转化进程表达不断下降;在BEAS-MD-25细胞中呈弱阳性;在BEAS-MD-C中呈阴性。[结论]转化细胞中P53、MDM2、P21、P16的表达异常,提示其P53通路已发生改变,第25代细胞P53蛋白的阳性表达,提示P53基因异常可能是细胞发生恶性转化的关键步骤之一。     

乙酸镍诱导16HBE细胞恶变过程中的K-ras和P15基因的改变及基因组不稳定性分析

目的：检测乙酸镍对K—ras基因和P15基因的改变及基因组不稳定性的影响，从而进一步探讨镍化合物致癌的分子机制。方法：采用聚合酶链反应一单链构象多态性分析方法探查乙酸镍在诱导16HBE细胞恶变过程中的K—ras基因Exonl和P15基因Exon2存在状况。采用随机扩增多态性技术对乙酸镍在诱导16HBE细胞恶变过程中的基因组不稳定性进行分析。结果：K—ras基因Exonl和P15基因Exon2未发生改变。本实验所选用的7条随机引物均能扩增出清晰、明显的条带，条带数在1-6条之间。7条引物中P4、P7二条引物扩增的片段在实验组和对照组之间无差异。其余5条引物均有差异，对于同一随机引物他们都具有特异的带型。结论：P15基因第2外显子和K—ras基因第1外显子(包括第12、13密码子)可能不是乙酸镍作用的靶部位。在乙酸镍诱发细胞恶性转化过程中，基因组变得逐渐不稳定。     

扶正解毒含药血清对硫酸镍诱导人支气管上皮细胞转化的抑制作用

目的观察中药复方扶正解毒含药血清(FJD)对硫酸镍(NiSO4)诱导培养人支气管上皮(16HBE)细胞恶性转化的抑制作用。方法NiSO4多次处理16HBE细胞,利用刀豆凝集素A(ConA)凝集实验和软琼脂集落形成实验进行转化细胞的恶性鉴定;同时添加不同剂量的FJD,观察其抗转化效应。结果NiSO4(400μmol/L)染毒8次(20代)时,细胞生长速度加快,排列紊乱,失去接触抑制,出现复层生长,可被ConA凝集,并可在软琼脂上生长。3种剂量FJD与NiSO4共处理组细胞转化率分别为0.82%、0.47%和0.19%,明显低于单用NiSO4组(4.13%),且呈剂量-效应关系(r=-0.884,P<0.01),细胞ConA凝集反应阴性,不能在软琼脂上生长。结论体外实验显示,FJD具有抑制NiSO4诱导16HBE细胞恶性转化的作用。     

甲基丙烯酸环氧丙酯致人支气管上皮细胞恶性转化过程中P16基因的甲基化状态

目的 分析甲基丙烯酸环氧丙酯(glycidyl methacrylate,GMA)致人支气管上皮16HBE细胞恶性转化过程中不同时点P16基因甲基化状态的差异,探讨GMA诱导16HBE细胞发生恶性转化相关DNA甲基化机制.方法 收获GMA转化早期(染毒结束)、转化前期(第10代)、转化后期(第30代)的16HBE细胞,采用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation-specific PCR,MSP)检测该基因组P16基因启动子区的甲基化状态,并与未转化的16HBE细胞及同期培养的DMSO溶剂对照细胞进行比较.结果 转化早期及转化前期,正常对照组及DMSO溶剂对照细胞中该基因启动子区均表现为非甲基化,而GMA组细胞中表现为不同程度的甲基化,阳性对照表现为甲基化;转化后期,正常对照组细胞中该基因启动子区表现为非甲基化,而DMSO溶剂对照组及GMA组细胞中均表现为部分甲基化,阳性对照表现为甲基化.结论 在GMA诱导16HBE细胞恶性转化早期及前期P16基因的甲基化状态具有特异性,故可将其作为GMA诱导16HBE细胞发生恶性转化的一个早期敏感指标.