小鼠共刺激分子B7-1的分子克隆、测序与真核表达载体的构建

目的：克隆小鼠共刺激分子B7－1基因，测序并构建其真核表达载体。方法：从小鼠脾组织中提取总RNA，用RT－PCR方法将B7－1的DNA扩增出，克隆到真核表达载体pcDNA3中，测定其cDNA序列。结果：测序结果表明我们克隆的B7－1基因序列与GenBank中序列有1个碱基不同，所编码的氨基酸发生突变。结论：已成功构建小鼠B7－1的真核表达载体，为进一步应用B7－1进行肿瘤基因治疗打下基础。     

转化生长因子-β1 shRNA表达载体的构建与鉴定

目的构建转化生长因子（TGF）-β1短发卡RNA（shRNA）表达载体,为肿瘤生物学研究奠定方法基础。方法根据TGF-β1的mRNA序列,运用Ambion公司的Target Finder软件筛选TGF-β1shRNA的候选点,在BglⅡ和HindⅢ位点克隆到表达载体pSUPER gfp-neo上。重组的shRNA pSUPER gfp-neo在大肠杆菌DH5a上筛选和鉴定。分别用酶联免疫吸附法（ELISA）测定和免疫荧光筛选最佳TGF-β1shRNA靶点序列。结果 ELISA和免疫荧光染色结果显示,shRNA-a、shRNA-b和shRNA-c均在不同程度上降低了靶细胞TGF-β1蛋白质表达,以shRNA-b所引起的下降最为显著（P〈0.05）。结论构建的TGF-β1shRNA在肿瘤细胞中产生较好的TGF-β1沉默效果,为肿瘤生物学研究提供了一种方法。     

人类成熟型TGF-β_1真核表达载体的构建及表达

目的：构建人类成熟型TGF-β1的真核表达载体,转染成纤维细胞进行表达,为其在基因治疗中的应用提供实验依据。方法：TRIzol法抽提人新鲜胎盘组织的总RNA,RT-PCR法扩增人成熟型TGF-β1基因,构建真核重组载体pIRES2-EGFP-hTGF-β1,并采用脂质体介导法转染成纤维细胞。结果：从人新鲜胎盘组织中成功提取得到含有hTGF-β1基因的总RNA。重组载体pIRES2-EGFP-hTGF-β1转染成纤维细胞后,经荧光显微镜观察可见绿色荧光。结论：成功构建了人成熟型TGF-β1基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-hTGF-β1,转染成纤维细胞株后hTGF-β1获得成功表达。     

人KiSS-1基因克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆转移抑制基因KiSS-1的不含信号肽的表达序列,构建人KiSS-1基因的真核表达载体.方法:从人正常胰腺组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达质粒pcDNA3/KiSS-1.结果:经PCR、酶切鉴定和基因序列测定,证实重组入载体pcDNA3的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列.结论:重组质粒pcDNA3/KiSS-1的成功构建,为该基因相应蛋白质的表达和其抗体的制备研究提供基础.     

转化生长因子β1在慢性鼻窦炎的表达

目的 探讨转化生长因子β1在慢性鼻窦炎组织中的表达情况.方法 采用逆转录-聚合酶链反应方法和免疫组化方法检测56例慢性鼻窦炎患者鼻窦黏膜组织中转化生长因子β1的mRNA和蛋白表达情况.结果 转化生长因子β1在慢性鼻窦炎组织表达较下鼻甲黏膜组织增高.无论在mRNA水平还是蛋白水平的相对表达量均随着慢性鼻窦炎的病程发展显著增加,呈正相关.结论 转化生长因子β1的表达增高,可能是促进慢性鼻窦炎发展和复发的一个重要因素.     

真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建

目的：构建含MAGE—1基因的重组真核表达质粒。方法：用RT—PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列，克隆至pGEM—T载体，测序证实基因碱基序列无误后，再克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，构建了pcDNA3.1—MAGE—1重组质粒。结果与结论：RT—PCR获得长度为927bp的阳性产物，经T载体和pcDNA3.1( )真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后。证实真核表达质粒pcDNA3．1—MAGE—1构建成功。     

胰岛素样生长因子-1与血小板源生长因子-AA以及肿瘤生长因子β1基因克隆及其在腺病毒载体中的表达

目的 从正常的人体成骨细胞中克隆IGF-1、PDGF—AA和TGFβ1三因子的编码蛋白基因,构建上述因子基因的高效表达重组腺病毒,旨在为基因治疗研究提供有效的工具。方法 培养正常人体成骨细胞,提取细胞总RNA,RT—PCR方法获得IGF-1、PDGF-AA和TGFβ1的编码基因。将这些片段克隆到高效表达腺病毒载体Adeno—X,并经过HEK293细胞的包装,获得成熟的重组腺病毒。Western印迹法检测上述三因子的表达。利用成熟重组腺病毒感染成骨细胞,检测细胞增殖和碱性磷酸酶(ALP)活性的改变。结果 重组T载体、重组腺病毒DNA和成熟的重组腺病毒体中均可得到IGF-1、PDGF-AA和TGFβ1基因的PCR片段。Western印迹检测到上述3种因子蛋白质的表达。当携带上述3种因子的重组腺病毒感染成骨细胞后,细胞增殖明显增强,ALP活性明显提高。结论 本实验构建的IGF-1、PDGF—AA和TGFβ1因子的高效表达重组腺病毒可以在人体细胞中表达出具有生物活性的蛋白质,获得了较好的基因工具。     

转化生长因子β1在食管鳞癌组织中的表达及临床意义

目的通过检测食管鳞癌组织标本及癌旁正常组织标本中转化生长因子β1（TGF-β1）的水平,探讨TGF-β1与食管鳞癌发生发展之间的关系。方法收集2009年9月～2011年10月沈阳医学院奉天医院胸外科39例食管鳞癌组织标本及癌旁正常组织标本,用逆转录聚合酶链反应的方法对标本进行检测,比较食管鳞癌组织及癌旁正常组织TGF-β1信使RNA（TGF-β1mRNA）的表达水平。结果食管鳞癌组织中TGF-β1mRNA水平（0.76±0.09）显著高于癌旁正常组织（0.23±0.05）;而随着病理分期Ⅰ~Ⅲ期TGF-β1mRNA水平逐渐增高（Ⅰ期：0.52±0.06;Ⅱ期：0.73±0.03;Ⅲ期：0.92±0.05）。有淋巴结转移组的TGF-β1mRNA水平（0.91±0.06）显著高于无淋巴结转移组（0.55±0.08）。随着肿瘤细胞局部浸润深度增加,TGF-β1mRNA水平逐渐增高（T1：0.53±0.03;T2：0.69±0.05;T3：0.93±0.03）。结论 TGF-β1水平的增高与食管鳞癌的发生发展关系密切。     

正反义人PIN1基因克隆及真核表达载体的构建

目的 克隆正、反义人PIN1基因（hPIN1）及构建hPIN1基因正、反义真核表达载体.方法 应用RT-PCR技术从人骨肉瘤细胞系MG-63细胞总RNA中成功扩增出990bp包含hPIN1基因编码区的cDNA序列,按正、反方向加上BamHⅠ及 HindⅢ双酶切位点后形成正、反义hPIN1基因,然后连入含BamHⅠ及 HindⅢ双酶切位点的pIRES2-EGFP表达质粒上,构建正、反义hPIN1基因的重组真核表达质粒phPIN1.结果 扩增的cDNA经测秩序与基因文库完全一致;BamHⅠ及HindⅢ双酶切后,正、反义表达质粒形成5.3 ＋0.99kb 两条带,与理论计算值完全一致.结论 成功克隆正、反义人PIN1基因及构建hPIN1基因的正、反义真核表达载体.     

红景天治疗大鼠心肌肥厚及对转化生长因子β_1表达影响

目的:观察红景天对大鼠压力超负荷型心肌肥厚的作用,探讨其对转化生长因子(TGF-β1)表达的影响。方法:通过不完全结扎大鼠腹主动脉法构建大鼠心肌肥厚模型,将SD大鼠随机分为4组每组10只。给药组动物术前1周始灌胃给予相应剂量红景天(150mg.kg-1.d-1或300mg.kg-1.d-1)直至术后4周。给药第5周末,测定各组大鼠血压和心脏质量指数(HMI);观察心肌组织结构;检测左室心肌组织中TGF-β1 mRNA表达。结果:红景天给药组动物的血压、HMI、光镜下的心肌细胞肥大程度和左室心肌组织中TGF-β1 mRNA表达较单纯手术组均有显著下降(P<0.01或P<0.05)。结论:红景天可有效的缓解压力超负荷诱导的大鼠心肌肥厚,通过降低左室心肌TGF-β1表达,影响TGF-β信号转导产生作用。     

转化生长因子β2真核表达载体pcDNA3.1(+)/TGF-β2的构建及其在骨髓基质细胞的表达

目的：构建人转化生长因子β2的真核表达载体pcDNA3.1( )/TGF-β2,检测其转染骨髓基质细胞后的表达。方法：用PCR方法从人胎盘cDNA文库DNA中扩增TGF-β2全长cDNA,该基因片段两端设计了Nhe I和Xho I限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将TGF-β2的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3.1( )上,酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术,将所构建的载体导入从骨髓中分离培养的基质细胞中,体外单层培养。分别于转染后24h和4周利用RT-PCR和Western-Blotting方法检测目的基因的表达情况。结果：经琼脂糖凝胶电泳及测序证实,PCR获得的片段与GenBank中登记的TGF-β2 cDNA序列完全相同。pcDNA3.1( )/TGF-β2酶切片段的长度与理论大小相符。转染后不同时期的骨髓基质细胞在mRNA和蛋白质水平均可检测到TGF-β2的表达。结论：pcDNA3.1( )/TGF-β2真核表达载体构建成功,在骨髓基质细胞内可获得短暂和长期表达。     

CRMP-1 真核表达载体的构建

 目的构建人坍塌反应调节蛋白1（CRMP-1）CRMP-1基因表达载体,以研究CRMP-1 蛋白在目的细胞中的生物学功能。方法
从购买的人胚肾细胞株293T 中提取总RNA,经过RT-PCR 方法扩增含人CRMP-1基因的全长cDNA,将CRMP-1基因开放阅
读框（ORF）cDNA 序列,克隆到真核表达载体p3x-FLAG-myc-CMV-24 中,构建真核表达质粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24。
以酶切和CRMP-1基因序列测定方法鉴定重组质粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24 的正确性。结果酶切鉴定和CRMP-1基因序列测定均证实
重组质粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24 构建正确。结论成功构建人CRMP-1基因真核表达载体。     

RT-PCR检测人烧伤愈合中TGF-β_1的表达

目的　通过对烧伤愈合不同阶段人皮肤组织中转化生长因子 β1(TGF β1)mRNA表达变化的研究 ,阐明TGF β1对促进愈合的调节作用。方法　取人深Ⅱ度烧伤后 5d、7d、12d手术切除的烧伤区皮肤组织 ,采用RT PCR后电泳扫描求积方法 ,检测各时相烧伤皮肤组织TGFβ1mRNA表达量的变化。结果　人深Ⅱ度烧伤皮肤TGFβ1mRNA在伤后 7d出现表达高峰 ,5d与 12d也有表达增强。结论　TGFβ1对烧伤患者创伤愈合有促进作用。     

转化生长因子-β及其受体在人类肾细胞癌中的表达

目的 探讨转化生长因子（TGF）-β及其受体（TGF-β）的表达与肾细胞癌（RCC）的关系。方法 采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及表达丰度定量法检测肾细胞癌组织和正常对照组中TGF-β1～3、TGF-βRⅠ～Ⅲ的mRNA表达。结果 RCC组TGF-β1～3表达水平均明显高于正常对照组（P〈0．005）,而TGF-β1更为显著;RCC组的TGF-βRⅡ表达水平明显低于正常对照组（P〈0．005）;而TGF-βRⅠ、Ⅲ的表达水平略高于正常对照组,但差异无显著性（P〉0．05）。结论 RCC组织中TGF-β的表达较正常肾组织高,而TβRⅡ的表达则明显低于正常肾组织,由此降低癌细胞对TGF-β的敏感性,减弱TGF-β抑制肾癌细胞增殖的作用,对TGF-β、TβRⅡ表达水平的检测有助于RCC的诊断和预后判断;TβRⅡ、Ⅲ的表达水平可能与RCC无明显关系。     

人MCHR1真核表达载体的构建

目的 构建人MCHR1真核表达载体.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),酶切和测序鉴定.结果 酶切和测序鉴定正确,表明pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体构建成功.结论 pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体成功构建,为进一步研究MCHR1的功能提供了良好的实验基础.     

人caspase-1真核表达载体的构建及表达

目的构建人caspase-1真核表达载体,观察其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法分离人外周血淋巴细胞,LPS刺激提取细胞总RNA,RT-PCR方法分别扩增caspase-1两片段S1、S2,利用重叠延伸PCR方法（SOE）获得caspase-1全长序列,将其克隆入pIRES2-EGFP载体,进行菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染HepG2肝癌细胞,倒置相差荧光显微镜下观察其表达情况,RT-PCR分析caspase-1的表达水平。结果份外周淋巴细胞中经RT-PCR分别扩增出365bp和883bp片段,纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一1234bp的条带,与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES2-EGFP经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后连接,菌落PCR鉴定获得数个阳性克隆,质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ限制性酶谱分析酶解出1234bp条带,DNA序列分析证实重组载体中的DNA序列与GenBank中人caspase-1序列完全一致。将该载体转染至HepG2细胞中,经RT-PCR证实,与转染pIRES2-EGFP空载体的对照组细胞相比,caspase-1水平明显升高。结论本研究成功构建人caspase-1表达载体pIRES2-EGFP-caspase-1,该载体能够在人肝癌细胞中高效表达外源基因。     

人可溶性4-1BB蛋白分子表达载体的构建

4-1BB分子是近年来发现的一种共刺激分子,属肿瘤坏死因子受体/神经生长因子受体(TNFR/NGFR)超家属成员,表达于活化的T淋巴细胞表面,以CD8+T细胞为主。4-1BB分子与其配体(4-1BBL)相互作用,其生物学功能主要是促进T细胞活化、增殖和分泌细胞因子,如可使CD8+T细胞产生IL-2和IFN-γ,还能使CD4+T细胞产生IL-2及IL-4,和增强细胞毒性T细胞(CTL)的功能,提供独立于CD28以外的共刺激信号,在调节机体免疫应答中有重要作用[1,2]。为此,我们构建了人可溶性4-1BB蛋白分子(hs4-1BB)的表达载体,为其进一步转化毕氏酵母获得hs4-1BB重组蛋白和研究其生物学功能奠定了基础。     

人谷氧还蛋白1基因克隆及真核表达载体的构建

目的 从ECV304细胞中克隆谷氧还蛋白1(glutaredoxin1,Grx1)的cDNA序列并构建真核表达载体pcD-NA3.1( )-Grxl.方法 利用Trizol一步法从ECV304细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术从中获得Grx1的cD-NA,将质粒pcDNA3.1( )进行双酶切、CIP处理并回收纯化,与纯化后的Grx1cDNA连接构成重组表达载体pcD-NA3.1( )-Grx1,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆鉴定并进行测序分析.结果 经RT-PCR和测序鉴定,成功地克隆了人Grx1cDNA.结论 从ECV304细胞中获得Grx1的cDNA,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1( )-Grx1,对Grx1在体外表达、进一步研究其在氧化应激中的作用及其作用机制具有重要意义.     

转化生长因子β1在宫颈癌中的表达

转化生长因子β1(Ttransforming growth factor β1,TGFβ1)是一种具有广泛生物学作用的同源二聚体多肽.它可在细胞增殖、细胞外基质沉积、血管生成及免疫反应等生理病理过程中起作用[1].其在肿瘤发生和恶性转化过程中的作用尤其受到有关学者的重视.国内外文献已报道,多种肿瘤TGFβ1表达均强于其起源组织,而宫颈癌中TGFβ1的表达特点在国内还未见相关报道.本研究对72例宫颈癌进行TGFβ1免疫组织化学染色,以探讨TGFβ1在宫颈癌组织中的表达特点及其意义.     

pcDNA3．1^＋-HIF-1α载体的构建和初步表达鉴定

目的 克隆和构建带人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因真核表达载体pcDNA3-1^ -HIF-1α。方法 以大肠癌细胞株HT29的总RNA为模板，进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，获得HIF-1α的cDNA，克隆入T载体，测序证实后克隆入真核表达载体pcDNA3．1^ ，酶切鉴定重组子。将构建好的pcDNA3．1^ -HIF-1α用脂质体法转入HEK293细胞，RT-PCR鉴定重组质粒的表达。结果 扩增出HIF-1αcDNA全长，测序结果与Genbank记载完全一致，成功克隆入真核表达载体pcDNA3．1^ ；建立了稳定的细胞株HEK293／pcDNA3．1^ -HIF-1α。结论 成功克隆和构建带人HIF-1α基因真核表达载体pcDNA3．1^ -HIF-1α并证明其能在真核细胞内表达。