人血清抗体对恶性疟原虫配子体抗原Pfs48/45决定簇的应答及其与配子体携带者传染性的关系

已证明,恶性疟原虫配子表面抗原Pfs48/45为传播性阻断抗体的靶子,应用单抗也明确其存在抗原决定簇。本研究目的是证实在高疟区人群自然产生的抗体对这些重要决定簇的应答性,并确定不同村和年龄组人群及血片阳性率有否差异。作者用竞争性ELISA调查了巴布亚新几内亚三个村的疟疾流行病学和感染性以及抗体和配子体携带者间的可能联系。结果发现有1/3以上的人     

恶性疟原虫同步配子体及无配子体产生株中早期配子体抗原Pfg27和Pfs16的表达

疟原虫有性期某些抗原诱导产生的抗体能阻断疟疾的传播。在恶性疟原虫,这些抗原包括配子体合成的Pfs230、Pfs48/45、Pfg27及配子形成和受精后产生的Pfs25。 本文作者对恶性疟原虫I—V期同步配子体及配子成熟过程中Pfg27和Pfg16的表达及其在体外不能产生配子体的“无性”株中的表达进行了研究。高度同步的恶性疟原虫     

恶性疟原虫传播阻断抗原Pfs25和Pfs48/45基因编码序列的体外扩增

目的：体外扩增编码恶性疟原虫传播阻断抗原Pfs和Pfs48／45的基因序列,为进一步对其进行克隆和体外高效表达创造条件。方法：特定寡核苷酸引物的设计、合成与纯化;恶性疟原虫FCC1／HN株体外培养;利用碱裂解法从培养的恶性疟原虫FCC1／HN株提取染色体DNA;PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分析。结果：从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中特异扩增出编码Pfs25和Pfs48／45基因序列,其片段大小分别为657bp和1,359bp。而用间日疟原虫基因组DNA为模板作对照,无扩增条带出现。结论：体外扩增编码恶性疟原虫传播阻断抗原Pfs25和Pfs48／45基因序列与预期长度相符合,从而,为该基因的克隆、测序和表达奠定基础。     

用Pfs25DNA免疫小鼠诱发潜在的疟原虫传播阻断抗体

已证实恶性疟原虫的几种抗原可以作为传播阻断疫苗的候选疫苗,如Pfs230、Pfs48/45、Pfg27和Pfs25、Pfs28。作者将编码Pfs25、Pfs27基因重组,分别作为单一免疫基因、共免疫基因及融合的杂合基因,评价它们作为传播阻断疫苗的潜力。 DNA载体为VR1012与VR1020,它们均含有多聚腺苷酸末端序列、一个原核生物     

恶性疟原虫传播阻断抗原的化学拼接与克隆

采用缺口填补法将恶性疟原虫有性期Pfs230和Pfs48／45抗原中的2个T细胞表位，3个B细胞表位以及人白介素-Ⅰ中的一个T细胞激活位点按预设方案，拼接成复合多价基因PfSI。复合基因全长147bP，编码43肽复合抗原，经分离、纯化后，插入质粒pcDNA3的多克隆位点，构建重组载体pcDNA3／PfSI。再将重组载体转化大肠杆菌JM109，用氨苄青霉素和PCR扩增法筛选阳性克隆，最后用限制性内切酶对阳性克隆进行鉴定。复合基因PfSI拼接、克隆的成功为在体外高效表达恶性疟原虫传播阻断抗原创造了条件。     

疟疾患者对阻断传播候选疫苗的恶性疟有性期抗原的初次抗体反应

在巴布亚新几内亚(PNG)高疟区疟疾病人血清中已发现有抗230和48/45kD的恶性疟配子体/配子表面抗原的抗体。这些抗原的单克隆抗体能够阻断疟原虫从人体传播到媒介蚊。本文报告了用间接荧光抗体试验(IFA)和竞争性酶联免疫吸附试验(cELISA)观     

恶性疟原虫有性期候选疫苗的极小变异性

恶性疟原虫有性期(合子和动合子)的25KDa 的表面蛋白 Pfs25是阻断疟原虫由人向蚊媒传播的抗体靶位,因而 Pfs25被认为是阻断疟原虫传播的首选疫苗。为了观察Pfs25是否存在着自然变异,作者最近分离     

恶性疟原虫合子/动合子、表面蛋白Pfs25特异性传播阻断抗体亦影响子孢子的发育

已知Pfs25表达于刚形成的配子的表面,并持续存在于合子和动合子期,其与抵御蚊中肠的消化,动合子的运动,穿透围食膜及识别中肠表皮细胞受体等功能有关。由于Pfs25特异性单抗系传播阻断性抗体,因此该蛋白被认为是传播阻断疫苗的主要候选抗原。本文目的在于探讨Pfs25是否存在于卵囊期,如果存在,其特异性抗体是否影响卵囊的发育。3～5日龄斯氏按蚊或冈比亚按蚊感染恶性疟原虫配子体(NF54)后,于第3,6,8天     

恶性疟原虫有性期特异抗原Pfs48/45基因的克隆与部分序列分析

目的：构建恶性疟原虫海南FCC1／HN分离株有性期特异抗原Pfs48／45，为研制恶性疟原虫传播阻断疫苗提供抗原。方法：根据Pfs48／45基因编码区序列设计引物，用PCR扩增DNA，并进行序列分析，双酶切后，定向克隆入pcDNA3载体，转化大肠杆菌TG1，随机取出氨苄青霉素抗性菌落进行PCR扩增，用碱裂解法抽提阳性的重组子DNA，双酶切鉴定。结果：特异扩增了编码Pfs48／45全基因序列（1363bp）；用5端寡核苷酸引物测定了450个碱基，结果表明FCC1／HN分离株Pfs48／455端基因序列与NF54株相应基因基本一致，仅在第307（T→C）和372（T→C）位碱基存在置换；第372位碱基置换产生新的酶切位点TaqI，进一步用TaqI消化PCR扩增产物，产生两个大小分别为984bp和379bp的酶切片段，测序和酶切结果均证实扩增的目的基因确为fs48/45 基因; 将纯化的目的基因片段正向插入pcDNA 3 质粒的BamHI 和EcoRI 位点。结论: 我国海南FCC1/ HN 分离株Pfs48/45 抗原基因序列与NF54 株相应基因高度同源; 成功构建重组质粒pcDNA 3-Pfs48/45     

疟原虫配子、合子和动合子的表面抗原分析

前言目前世界上对抗疟疫苗的研究集中于疟原虫裂殖子、子孢子和配子的疫苗,已有许多报告证实抗配子抗体可在脊椎动物宿主(鸡、鼠和猴)体内和人体内产生,当此抗体在血餐中进入蚊胃时,与雌、雄配子的表面反应,使其不能受精,阻断了蚊媒传播。这一反应的免疫原是细胞外配子和合子,传播阻断免疫的主要靶抗原是配子。但循环在免疫宿主内的配子体并不受抗配子抗体影响,在蚊体内受精的合子照常转变为动合子;若在受精前加免疫血清,疟原虫即不能继续发育,表明传播阻断免疫是在蚊胃中通过阻止配子受精而起作用。从免疫血清与蚊胃阶段原虫     

以两次吸血观察血餐中阻断传播型抗体对蚊体内伯氏疟原虫发育的影响

抗疟原虫有性体免疫可以抑制配子体在蚊媒体内的发育,阻断传播型(T-B)免疫的靶抗原包括交配前和后两种抗原,前者表达于大小配子体表面,后者,如Pfs25,Pbs21,Pgs25和Prs25等20—30kDa蛋白抗原,则分布于配子、合子和动合子表面。用Pbs21免疫小鼠,可以明显减少甚至完全阻断伯氏     

疟疾传播阻断免疫的靶抗原

应用凝集和荧光抗体等方法研究免疫血清与雌雄配子和合子及动合子(蚊胃期)的作用,提示阻断传播的免疫靶抗原可能在虫体表面。因此,表面抗原的鉴定和定性对研究传播阻断免疫很重要,作者从三个方面进行     

用多肽-蛋白偶联方法制备抗恶性疟原虫抗体

目的介绍一种多肽-蛋白偶联的流程,并用多肽-蛋白偶联产物制备抗疟原虫抗体。方法用化学连接剂Sulfo-EMCS在作为载体蛋白的铜绿假单胞菌重组去毒外毒素(rEPA)上加马来酰亚胺基团,用间接Ellman反应测定载体蛋白上所加的马来酰亚胺基团数量。用马来酰亚胺修饰的载体蛋白滴定Pfs48/45-158多肽[含恶性疟原虫表面蛋白48/45(Pfs48/45)第158～173氨基酸序列,其N末端带有一个半胱氨酸残基],绘制滴定曲线并用线性回归进行曲线拟合,根据滴定曲线确定理论滴定终点,计算多肽与载体蛋白的偶联比(每摩尔载体蛋白所能结合的多肽的摩尔数)。用过量的Pfs48/45-158多肽与马来酰亚胺修饰的rEPA进行反应,规模制备Pfs48/45-158-rEPA多肽-蛋白偶联物,偶联物用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。用所制备的Pfs48/45-158-rEPA偶联物免疫BALA/c小鼠,制备免疫血清。用ELISA测定免疫小鼠血清抗Pfs48/45-158多肽的抗体效价,用免疫荧光试验(IFA)测定免疫血清识别疟原虫的能力。结果通过化学连接剂在每摩尔rEPA上添加约6.94摩尔的马来酰亚胺基团。制备了偶联比约为7.33的Pfs48/45-158-rEPA多肽-蛋白偶联物。偶联物免疫小鼠激发出抗Pfs48/45-158多肽的高抗体应答,免疫血清抗Pfs48/45-158多肽的效价为12 500 ELISA单位(即吸光度A405值为1时的血清稀释度倒数),同时免疫血清可识别疟原虫。结论多肽-蛋白偶联是一种可用于制备抗疟原虫抗体的便捷方法,间接Ellman检测、滴定反应和SDS-PAGE分析构成了多肽-蛋白偶联物制备的质控方法,可更好地保证多肽-蛋白偶联物的质量和稳定性。     

疟疾疫苗研究进展

目前,由于疟原虫抗药性的迅速蔓延,特别是多重抗药性恶性疟的不断扩散,给疟疾的治疗带来了较大困难,研制有效的疟疾疫苗迫在眉睫。本文对近年来抗红前期原虫疫苗RTS、S/AS02、ME-TRAP、Pfs25及其靶抗原,抗红内期原虫疫苗MSP及其靶抗原,传播阻断疫苗及其靶抗原的研究进展进行了综述,旨在为疟疾疫苗的研究提供参考。     

恶性疟原虫海南株Pfs40基因原核表达载体的构建和序列分析

目的 构建恶性疟原虫海南（FCC1/HN）株膜相关钙结合蛋白（Pfs40）基因编码区的原核表达载体,测定Pfs40基因编码区的序列,了解该虫株与其它虫株Pfs40基因序列的差异。方法 根据Pfs40基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增Pfs40基因编码区;EcoRV酶切鉴定PCR产物;将Pfs40基因插入原核表达载体PET28a,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,于卡那阳性LB培养平板上筛选阳性克隆,酶切,PCR扩增鉴定;用双脱氧链末端终止法进行测序,应用软件对Pfs40核苷酸及推测氨基酸序列进行分析。结果 PCR扩增获得1032bp的Pfs40基因,EcoRV酶切表明扩增产物正确;重组质粒经双酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子;恶性疟原虫FCC1/HN株与7G89株Pfs40基因核苷酸序列同源性为99.5%,编码氨基酸序列同源性为99.1%。Pfs40理论蛋白质有5个钙结合区EF-hand结构;4个明显的抗原表位区段。结论 从恶性疟原虫基因的DNA中获取Pfs40基因,并成功构建恶性疟原虫FCC1/HN株Pfs40基因编码区的原核表达载体;FCC1/HN株与7G8株Pfs40基因有高度的同源性。     

单克隆抗体M26-32靶抗原基因片断融合蛋白的表达和特性分析

用温度诱导方法获得了 M2 6 - 32靶抗原基因片断表达的融合蛋白。 Western- blot分析显示 ,该融合蛋白能与单克隆抗体 M2 6 - 32反应 ,证实了获得的基因序列是单克隆抗体 M2 6 - 32的靶抗原基因片断。该融合蛋白能与抗间日疟原虫和抗恶性疟原虫血清反应 ,且抗该融合蛋白抗体和纯化融合蛋白的抗血清还能与间日疟原虫和恶性疟原虫的胞浆抗原反应 ,表明该靶抗原基因片断内含有间日疟原虫和恶性疟原虫的共同基因序列 ,且这一共同基因表达的蛋白存在于间日疟原虫和恶性疟原虫抗原之中     

恶性疟原虫27kDa有性期特异抗原的单一和多种HLA-DR分子限制性T细胞表位作图

CD4~+T淋巴细胞作为抗疟免疫的效应细胞在与靶抗原或靶肽结合时受MHCⅡ类分子的限制。疟疾疫苗中须含有能与多个MHCⅡ类分子结合的Th细胞表位才能诱导不同遗传背景的个体产生有效的体液和细胞免疫。抗恶性疟原虫配子体期特异性抗原Pfg27的单抗能有效地阻断恶性疟原虫在蚊体内的发育。作者利用从志愿者建立的16个Pfg27特异性CD4~+T淋巴细胞克隆鉴定出Pfg27有7个不同的T细胞表位,并分析了各表位的MHC限制类型。     

恶性疟原虫配子230-KDa表面蛋白亦是一种传播阻断抗体的靶子

本文报道用2种抗恶性疟原虫配子230-KDa 表面蛋白的单克隆抗体,能够在蚊体内阻断恶性疟原虫的传播,在体外则显示配子体和合子的溶胞作用。用 Ifediba 等改良的悬浮培养法获得成熟的恶性疟原虫配子体及配子;用分离所得     

单克隆抗体M26—32靶抗原基因片断融合蛋白的表达和特性 …

用温度诱导方法获得了Ｍ２６－３２靶抗原基因片断表达的融合蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析显示,该融合蛋白能与单克隆抗体Ｍ２６－３２反应,证实了获得的基因序列是单克隆抗体Ｍ２６－３２的靶抗原基因片断。该融合蛋白能与抗间日疟原虫和抗恶性疟原虫血清反应,且抗该融合蛋白抗体和纯化融合蛋白和抗血清还能与间日疟原虫和恶化疟原虫的疱浆抗原反应,表明该靶抗原基因片断内含有间日疟原虫和恶性疟原虫的共同基因序列,且     

泛种特异性抗疟原虫单克隆抗体M26-32的分子生物学特性研究 Ⅱ.靶抗原基因的筛选和序列分析

用泛种特异性抗疟原虫单克隆抗体Ｍ２６－３２作探针，筛选恶性疟原虫ｃＤＮＡ基因表达文库。结果获得一段含ＮＫＮＤ４个氨基酸靶抗原决定簇表位基因的４７２个碱基的基因序列。用该基因序列作探针与不同种的ＤＮＡ进行杂交，证实该基因序列为一段疟原虫基因序列。对该基因片段在染色体内的定位分析发现，该基因序列定位于恶性疟原虫的第７对染色体上，且存在于多种不同分离株（包括抗氯喹株）的恶性疟原虫的ＤＮＡ之中。通过ＧｅｎｅＢａｎｋ检索证实，该基因序列与已知的其它疟原虫基因序列不同，是一段新发现的，存在于不同种株疟原虫基因的单克隆抗体Ｍ２６－３２的靶抗原基因序列片段。