泛耐药铜绿假单胞菌群体行为与群体密度感应系统基因的相关性分析

目的:探讨泛耐药铜绿假单胞菌(PA)群体行为与群体感应系统(QS)基因的相关性.方法:检测PA群体行为包括弹性蛋白酶、绿脓菌素和生物被膜(BF)等和QS基因表达量,分别在泛耐药PA组和全敏感PA组观察PA群体行为与QS基因表达量的相关性.结果:收集泛耐药PA和全敏感PA各5例病例,各10株PA.泛耐药PA组弹性蛋白酶和绿脓菌素与LasI呈正相关关系(P<0.05),BF与RhlR呈正相关关系(P<0.05);全敏感PA组群体行为与QS基因无相关关系(P>0.05).泛耐药PA组与全敏感PA组第1天收集RhlI和第14天收集LasI、LasR表达量差异有统计学意义(P<0.05),弹性蛋白酶、BF和LasI、LasR治疗前后表达量变化差异有统计学意义(P<0.05).1株泛耐药PA发生氨基酸突变.结论:泛耐药PA群体行为与QS基因相关,且弹性蛋白酶、BF和LasI,LasR表达过高,提示QS基因在PA耐药机制中起重要作用.     

铜绿假单胞菌LasⅠ基因反义核酸载体的构建及生物学作用研究

目的 构建LasⅠ基因反义核酸原核表达载体pUCP18/lasⅠantisense,转化入铜绿假单胞菌并分析其生物学作用.方法 PCR扩增LasⅠ基因序列,反向克隆法构建LasⅠ基因的反义核酸原核表达载体pUCP18/lasⅠantisense,并转化铜绿假单胞菌.通过检测转化菌的LasB和LasR基因表达,测定外毒素的活性和绿脓菌素的表达等指标,分析pUCP18/lasⅠantisense的生物学作用.结果 成功构建pUCP18/lasⅠantisense并转化铜绿假单胞菌,且有效表达,转化菌的毒力因子弹性蛋白酶、外毒素和绿脓菌素表达水平均降低.结论 pUCP18/lasⅠantisense可以降低铜绿假单胞菌毒力因子表达,提示LasⅠ基因可作为医院内铜绿假单胞菌感染治疗的一个新的靶点.     

铜绿假单胞菌LasI基因反义核酸载体的构建及生物学作用研究

目的构建LasI基因反义核酸原核表达载体pUCP18／lasI^antisenae转化入铜绿假单胞菌并分析其生物学作用。方法PCR扩增LasI基因序列，反向克隆法构建LasI基因的反义核酸原核表达载体pUCP18／lasI^antisenae，并转化铜绿假单胞菌。通过检测转化菌的LasB和LasR基因表达，测定外毒素的活性和绿脓菌素的表达等指标，分析pucP18／lasI^antisenae的生物学作用。结果成功构建pUCP18／lasI^antisenae并转化铜绿假单胞菌，且有效表达，转化菌的毒力因子弹性蛋白酶、外毒素和绿脓菌素表达水平均降低。结论pUCP18／las I^antisenae可以降低铜绿假单胞菌毒力因子表达，提示LasI基因可作为医院内铜绿假单胞菌感染治疗的一个新的靶点。     

黄芪对铜绿假单胞菌毒力因子调控表达及菌体运动的影响

[目的] 观察黄芪对铜绿假单胞菌相关毒力因子表达及菌体运动的影响,探讨黄芪对铜绿假单胞菌的作用机制。[方法] 不同浓度黄芪与对数生长期铜绿假单胞菌共培养,弹性蛋白-刚果红降解实验检测细菌分泌的弹性蛋白酶活性,紫外分光光度法测定绿脓菌素分泌量,结晶紫染色法观察生物被膜形成量,在含黄芪琼脂平板中检测菌体集群运动与泳动能力。[结果] 黄芪在终浓度25、12.5、6.25 g/L条件下对弹性蛋白酶、绿脓菌素表达有显着抑制,并能抑制生物被膜形成。在低于12.5 g/L时对细菌增殖无显着影响。细菌在12.5 g/L条件下泳动能力与集群运动均受到显着影响。[结论] 黄芪对铜绿假单胞菌增殖和毒力因子表达的抑制程度不一致,提示黄芪抑菌可能通过多种途径发挥抑菌功能,并可能在低浓度下便对密度感应系统造成显着抑制。     

亚胺培南和阿米卡星双耐药铜绿假单胞菌的特性分析

目的通过分析亚胺培南(IPM)和阿米卡星(AMK)同时耐药的铜绿假单胞菌的特性,为探讨耐药机制、评估菌株临床危害提供实验数据。方法针对临床分离的25株铜绿假单胞菌,采用Etest试纸条法测定IPM、AMK的最小抑菌浓度(MIC);通过RT-qPCR检测外排泵MexY和膜孔蛋白OprD表达水平;通过结晶紫染色测定生物膜形成能力;采用氯仿萃取法测定绿脓菌素产生量。结果依据25株铜绿假单胞菌对IPM和AMK的敏感度不同将其分为GroupⅠ(5株,IPM敏感或中介、AMK敏感)、GroupⅡ(8株,IPM耐药、AMK敏感或中介)、GroupⅢ(12株,IPM、AMK均耐药)三组,其中对AMK耐药的菌株同时对IPM耐药。GroupⅢ菌株在生物膜形成能力和绿脓菌素产量上明显强于GroupⅠ和GroupⅡ菌株,差异有统计学意义(P0.05)。与参考菌株ATCC27853比较,GroupⅢ菌株的外排泵mexY表达显著上调4～12倍、膜孔蛋白oprD表达显著下调70%～80%,差异有统计学意义(P0.05)。结论AMK耐药的铜绿假单胞菌极可能对IPM耐药;生物膜形成能力、mexY和oprD的表达变化可能参与了铜绿假单胞菌对IPM和AMK的同时耐药。     

铜绿假单胞菌抗菌物质对白色念珠菌的

目的 观察铜绿假单胞菌抗菌物质对白色念珠菌的体外抑菌活性.方法 用交叉条带实验方法测定铜绿假单胞菌对18株白色念珠菌等的体外抑制活性.结果 铜绿假单胞菌抗菌物质对白色念珠菌体外抑菌活性良好,第6和8株铜绿假单胞菌对白色念珠菌的抑制率均达到了100%,铜绿假单胞菌产生色素的菌株抗真菌活性显著优于不产色素的菌株.铜绿假单胞菌抑制白色念珠菌的生长,主要是铜绿假单胞菌产生的绿脓素.结论 铜绿假单胞菌产生的抗菌物质对白色念珠菌具有较强的抗真菌活性.     

穿心莲内酯对铜绿假单胞菌毒力因子的影响

目的观察穿心莲内酯对铜绿假单胞菌密度域值感应系统(QS系统)调控的毒力因子的影响。方法分别测定穿心莲内酯对铜绿假单胞菌生长曲线、绿脓菌素、胞外蛋白水解酶活性的影响,同时检测穿心莲内酯对QS系统双突变株PAOJP2蛋白水解酶活性的作用。结果穿心莲内酯组与对照组铜绿假单胞菌生长未表现出明显差异。12.5mg/ml穿心莲内酯能明显抑制绿脓菌素的分泌和胞外蛋白水解酶活性。穿心莲内酯对PAOJP2胞外蛋白水解酶无明显影响。结论穿心莲内酯可能通过抑制铜绿假单胞菌毒力因子产生而实现抗感染作用。     

铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因的扩增与克隆

目的PCR扩增及克隆铜绿假单胞菌的弹性蛋白酶基因.方法从铜绿假单胞菌培养物中提取染色体DNA,PCR扩增弹性蛋白酶基因成熟蛋白编码区,A-T克隆于pMD 18-T载体中,对重组质粒进行酶切与测序鉴定.结果从高GC含量的铜绿假单胞菌染色体DNA中扩增到弹性蛋白酶基因并进行了克隆与鉴定.结论本研究成功克隆到铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,为实现活性弹性蛋白酶的高效表达奠定了基础.     

ICU泛耐药铜绿假单胞的调查分析

目的分析ICU泛耐药铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa,PAE）,为控制该菌所致的医院感染提供依据。方法对2010年1月-2012年12月间我院住院患者送检标本进行泛耐药铜绿假单胞菌的分离鉴定及分析。结果各类临床标本分离到的478株铜绿假单胞菌分析,ICU分离84株,占17.57%,而全院107株泛耐药铜绿假单胞菌当中ICU29株,占27.10%,显著高于非泛耐药菌株的比例;从标本类型的分布来看,主要来自于下呼吸道的痰标本。结论 ICU在我院成了泛耐药铜绿假单胞菌的集中区域,并且有增加的趋势;呼吸系统是泛耐药铜绿假单胞菌的易感部位。     

原白头翁素对铜绿假单胞菌群体感应系统调控的毒力因子表达量的影响

目的 研究原白头翁素对铜绿假单胞菌（PA）的生长及群体感应系统（QS系统）调控的毒力因子表达的影响。方法 测定原白头翁素对PA的最低抑菌浓度和生长曲线,以40 μmol/L的呋喃酮C-30作为阳性对照,测定原白头翁素（40、80 μmol/L）对铜绿假单胞菌标准株PAO1生长曲线的影响以及QS系统调控的毒力因子中胞外3种毒力因子（绿脓菌素、蛋白水解酶和弹性蛋白酶）表达量的影响。结果 在实验所采用的浓度下,原白头翁素对铜绿假单胞菌的生长未表现出明显的抑制作用,但对PAO1的3种毒力因子均有抑制作用,并呈现出剂量相关性。结论 原白头翁素抗感染的机制可能是作用于铜绿假单胞菌的QS系统,抑制毒力因子表达,从而降低该菌的毒力。     

临床分离铜绿假单胞菌密度感应缺陷株致病性分析

目的以临床分离的铜绿假单胞菌(PA)为研究对象,从临床角度探讨密度感应(QS)在PA感染发病机制中的作用,为临床控制PA感染提供新的思路。方法采用刚果红弹性蛋白酶解实验对临床分离的84例PA株进行QS缺陷筛选,检测QS缺陷株的弹性蛋白酶表达、绿脓菌素分泌、生物被膜形成及泳动能力。结果在84例临床分离PA株中筛选出4例QS缺陷株(C39,C84,C104,C117),检出率为4.76%。PCR检测显示:C84的rhl Ⅰ、rhl R基因缺失。序列检测发现:C39 rhl Ⅰ基因序列多个位点碱基突变,其中第184、249位碱基突变导致编码蛋白62、83位氨基酸由丝氨酸和天冬氨酸变成甘氨酸和谷氨酸;C39 rhl R基因序列多个位点碱基突变,其中第146位移码突变,147位替换突变,导致编码蛋白第48位以后氨基酸改变;C84 las R基因序列多个位点碱基突变,导致编码蛋白66、136、138和172位氨基酸分别由精氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和丝氨酸变成赖氨酸、丝氨酸、缬氨酸和天冬酰胺;C104和C117 rhl Ⅰ基因序列多个位点碱基突变,其中第184、249位碱基突变导致编码蛋白第62、83位氨基酸由丝氨酸和天冬氨酸变成甘氨酸和谷氨酸。致病因子检测显示:C39、C84、C104、C117弹性蛋白酶表达水平低于野生株(PAO1),与QS缺陷株(PAOJP2)相近;C39、C84绿脓菌素分泌明显低于PAO1,与PAOJP2相近,C104、C117绿脓菌素分泌正常;C39、C84、C104、C117的生物被膜起始能力及泳动能力均低于PAO1。结论 QS系统在PA感染过程中发挥了非常重要的作用,干扰QS是控制PA感染非常有希望的新方法。     

鱼腥草素钠增强妥布霉素抗铜绿假单胞菌生物被膜作用及抗菌协同作用

目的：研究鱼腥草素钠增强妥布霉素抗铜绿假单胞菌生物被膜的作用。方法：微量倍比稀释法测定鱼腥草素钠、妥布霉素对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度（MIC）,棋盘稀释法测定两者联合抗菌作用,结晶紫染色法测定单药及联合用药对铜绿假单胞菌生物被膜的最小抑膜浓度（SMIC）,扫描电镜下观察药物对铜绿假单胞菌生物被膜形态的影响,采用倾注平板法进行菌落数计数。结果：鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌的MIC为512μg/mL,妥布霉素对铜绿假单胞菌的MIC为4μg/mL,两药联合后MIC分别为64μg/mL和1μg/mL,分级抑菌浓度指数（FIC）为0.375,提示两药协同作用明显。妥布霉素对铜绿假单胞菌生物被膜SMIC50黏附期为8μg/mL,早期生物被膜阶段为16μg/mL,成熟期生物被膜阶段为32μg/mL,两药联合后铜绿假单胞菌生物被膜SMIC50黏附期为8μg/mL,早期为0.5μg/mL,成熟期为8μg/mL,鱼腥草素钠对妥布霉素抗铜绿假单胞菌生物被膜有增强作用。结论：鱼腥草素钠与妥布霉素抗菌协同作用明显,鱼腥草素钠对妥布霉素抗铜绿假单胞菌生物被膜有增强作用。     

低浓度乙醇对铜绿假单胞菌生长及相关毒力因子影响的研究

目的：研究低浓度乙醇对铜绿假单胞菌磷脂酶C基因（PLCH）表达的影响。方法：观察不同浓度乙醇对铜绿假单胞菌生长曲线影响,荧光定量实时PCR检测不同乙醇浓度培养的铜绿假单胞菌PA01的PLCH表达量变化。、结果：工程株PA01在0．1％、0．5％、1％乙醇浓度下,其生长曲线与对照基本一致,在孵育18h都达到最高生长密度;在2％～5％的乙醇浓度下,细菌生长极其缓慢,6％以上的乙醇浓度下几乎不生长．．与对照相比,在0．1％、0．5％和1％乙醇诱导下．PLCH的表达量的分别比对照组上升了44倍、30倍和8倍．在2％乙醇浓度下,PLCH表达量略为下降。结论：低浓度乙醇有助于铜绿假单胞菌相关毒力因子表达上调,增加生存力．在感控消毒中,保持足够的酒精浓度对清除铜绿假单胞菌至关重要。     

铜绿假单胞菌的临床感染分布及耐药现状分析

目的：了解铜绿假单胞菌（PAE）的临床感染分布及耐药现状,为预防和控制医院感染及合理用药提供依据。方法：采用常规方法对本院细菌室收集的临床标本进行菌株鉴定及药敏试验。结果：2009年1月-2012年12月间共分离出98株铜绿假单胞菌,标本来源以痰为主占73．5％（72／98）,科室分布以内科系统（含重症监护病房）最多,占71.4％（70／98）。对磺胺甲恶唑／甲氧苄啶、头孢曲松、左氧氟沙星、庆大霉素、环丙沙星、妥布霉素等多种抗生素的耐药率均较高,分别为90．8％、66．3％、52．0％、51．0％、50．0％、44．9％。结论：铜绿假单胞菌是医院内感染的主要病原菌之一,随着分离率和耐药性的上升,应做好医院感染控制和抗菌药物分级管理工作,加强细菌培养及药物敏感试验,根据结果合理选用抗菌药物,减少或防止耐药菌株的产生或播散。     

苦参泡腾片体外抗菌作用的实验观察

目的：检测苦参泡腾片对常见病原菌的体外抗菌作用。方法：用试管法对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌和白色念珠菌进行抑菌试验。用试管法和平皿划线培养法进行杀菌试验。结果：苦参总碱对上述病原菌的抑菌浓度／杀菌浓度分别为：3．12／6．25（g／L）,3．12／12．5（g／L）,1．56／6．25（g／L）,6．25／12．5（g／L）,3．12／6．25（g／L）。结论：苦参总碱对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌和白色念珠菌都具有抗菌作用。     

154例深静脉置管相关的院内感染分析

目的分析临床深静脉导管（DVC）培养的病原学特征和耐药性。方法回顾性分析瑞金医院2010年全年送检的深静脉导管的病原学及其耐药性。结果991份送检导管病原学阳性154例（15．54％）,检出病原菌176株,其中G^＋菌、G^-菌和真菌各占41．47％、36．36％和22．17％;五种常见病原菌分别是表皮葡萄球菌（20．45％）、鲍曼不动杆菌（15．34％）、金黄色葡萄球菌（11．93％）、白色假丝酵母菌（11．36％）和铜绿假单胞菌（6．25％）。金黄色葡萄球菌中MRSA占94．12％,凝固酶阴性葡萄球菌中MRSen占69．44％;鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌普遍存在多重耐药现象,鲍曼不动杆菌（26．92％）和铜绿假单胞菌（9．09％）甚至出现全耐药。结论深静脉导管感染为院内感染,检出的病原菌多为耐药菌,无菌置管、加强导管的护理和加强病原学监测是控制DVC感染的关键。     

三种生物碱体外抑菌活性的测定

目的：研究甜菜碱、苦参碱、氧化苦参碱对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的体外抑菌活性。方法：采用试管二倍稀释法进行体外抑菌试验,测定苦参碱和氧化苦参碱对上述4种病原菌的最小抑菌浓度（MIC）。结果：体外实验结果表明,对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌四种病原菌标准菌株的MIC：甜菜碱分别是6.25、3.125、6.252、5 mg/mL;苦参碱分别是12.5、25、252、5 mg/mL;氧化苦参碱均大于50 mg/mL。结论：三种生物碱在体外对受试菌具有不同程度的抑菌作用,其中甜菜碱对上述四种病原菌的体外抑菌效果较苦参碱和氧化苦参碱要好。     

儿童重症监护病房革兰阴性菌的分布与耐药性分析

目的了解儿童重症监护病房(ICU)革兰阴性菌对临床常用抗菌药物的耐药性变化,指导临床合理选用抗菌药物。方法采用纸片扩散法对2007年1月至12月本院ICU分离出的革兰阴性菌进行药物敏感性检测,按照CLSI2006年版标准判断结果。结果共分离出262株革兰阴性菌,其中以肺炎克雷伯菌(27.1%)、大肠埃希菌(23.3%)、铜绿假单胞菌(20.2%)、鲍曼不动杆菌(11.1%)为主。肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌超广谱β内酰胺酶(ESBL)(+)分别占87.3%和73.8%。肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和鲍曼不动杆菌对亚胺培南最敏感(100%)。铜绿假单胞菌对环丙沙星有较高的敏感。结论亚胺培南对革兰阴性菌具有较好的抗菌活性,根据病原菌的种类及药物敏感性结果合理使用抗菌药物,是有效控制患儿感染和减少耐药菌株产生的重要手段。     

某三级甲等医院铜绿假单胞菌感染的科室分布及耐药性分析

【目的】分析某三级甲等医院铜绿假单胞菌感染的科室分布特点及耐药性,为临床合理应用抗感染药物提供参考。【方法】对2009年1月-12月分离得到的合格菌株用法国生物梅里埃公司API鉴定系统进行菌株鉴定,同时用K-B纸片扩散法进行药敏实验。【结果】共检测出680株铜绿假单胞菌:其中呼吸科210株,构成比为30.9%I;CU分离到164株,构成比为24.1%;心内科108株,构成比为15.9%;普外63株,构成比为9.2%;其它135株,构成比为19.9%。药敏结果显示铜绿假单胞菌对阿米卡星、庆大霉素、头孢他啉及复方新诺明的耐药率分别达46.0%、67.6%、59.8%和70.7%,呈高水平耐药。【结论】铜绿假单胞菌在我院以呼吸系统感染为主,加强抗感染药物合理应用及控制耐药菌株的产生和传播都有助于减少医院感染的发生。