miR-206通过调节ERα水平影响乳腺癌细胞MCF-7对他莫昔芬敏感度的初步研究

目的 探讨乳腺癌细胞株MCF-7中miR-206能否调节ERα表达水平并影响乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感度。方法 将miR-206 mimic、miR-206 inhibitor及相应阴性对照（miR-206 mimic NC、miR-206 inhibitor NC）分别转染乳腺癌MCF-7细胞,RT-PCR法检测转染后各组乳腺癌细胞中miR-206和ERα mRNA的表达量,用5 μg/ml他莫昔芬处理MCF-7细胞后,MTT法检测不同转染组细胞增殖情况。结果 miR-206 mimic组中乳腺癌细胞miR-206表达升高,ERα mRNA表达降低; miR-206 inhibitor组中乳腺癌细胞miR-206表达降低,ERα mRNA表达升高。他莫昔芬作用24 h后,miR-206 mimic组与阴性对照组（miR-206 mimic NC）的乳腺癌细胞增殖抑制差异无统计学意义（t=-1.169, P=0.276）;miR-206 inhibitor组的乳腺癌细胞增殖抑制明显强于阴性对照组（miR-206 inhibitor NC）（t=-3.054, P=0.016）。结论 下调miR-206表达可以增加ERα阳性乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感度。     

miR-206对三阴性乳腺癌细胞的增殖抑制作用及初步机制研究

目的 探讨miR-206对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的影响及其作用机制。方法 转染miR-206 mimic和miR-NC至乳腺癌细胞株MDA-MB-231中,应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测miR-206相对表达水平;应用MTT法、克隆形成实验检测miR-206对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测miR-206对细胞周期的影响;Western blotting进一步验证miR-206对周期相关蛋白CyclinD2的影响。结果 qRT-PCR检测结果显示,miR-206 mimic转染至MDA-MB-231乳腺癌细胞48h后miR-206的相对表达水平为10.2±1.5。MTT法检测结果显示,miR-206 mimic转染至MDA-MB-231乳腺癌细胞6、24、48、72、96h后的增殖抑制率分别为（0±0.01）％、（0.12±0.03）％、（0.21±0.08）％、（0.28±0.11）％ 和（0.39±0.16）％;克隆形成实验结果显示,miR-206 mimic和miR-NC转染至MDA-MB-231乳腺癌细胞2周后的克隆数目分别为106±35和843±143,差异具有统计学意义（P＜0.01）。流式细胞术检测结果显示,miR-206 mimic转染至MDA-MB-231乳腺癌细胞48h后,明显地阻滞细胞周期于G1期;Western blotting检测显示miR-206表达下调了细胞周期蛋白CyclinD2的表达。结论 miR-206明显抑制了三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的增殖,其机制可能与下调细胞周期蛋白CyclinD2的表达有关,这将成为乳腺癌临床治疗一个新的靶点。     

miR-155在非小细胞肺癌组织和细胞中的表达及对细胞增殖、迁移、侵袭的影响

目的:探讨miR-155在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及其对NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭的影响机制。方法:通过生物信息学网站预测miR-155的可能靶基因,双荧光素酶报告基因实验进行验证;采用qRT-PCR测定NSCLC组织及细胞中miR-155和ZIC3的表达;通过LipofectamineTM2000试剂盒向A549细胞中分别转染miR-155 mimic和mimic NC,共转染miR-155 mimic+pMIR-ZIC3;Western blot检测转染miR-155 mimic对ZIC3蛋白表达的影响;MTT法、划痕实验及Transwell侵袭实验分别检测miR-155对A549细胞增殖、迁移及侵袭的影响。结果:生物信息学网站预测显示ZIC3-3' UTR与miR-155存在结合位点,双荧光素酶报告基因实验验证ZIC3是miR-155的靶基因,ZIC3表达受miR-155的负向调控。NSCLC组织及细胞中miR-155显著低表达,ZIC3显著高表达（P＜0.05）;过表达miR-155抑制了ZIC3蛋白的表达水平（P＜0.05）。转染miR-155 mimic显著抑制NSCLC细胞的增殖、迁移及侵袭能力（P＜0.01）;共转染miR-155 mimic+pMIR-ZIC3逆转了miR-155 mimic对NSCLC细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用（P＜0.05）。结论:NSCLC中miR-155显著低表达,其过表达可抑制NSCLC细胞的增殖、迁移及侵袭;miR-155可能通过靶向负调控ZIC3影响NSCLC细胞的生物学行为。     

miR-145通过靶向AP4对非小细胞肺癌A549细胞迁移侵袭的影响

 目的 探讨miR-145对非小细胞肺癌迁移与侵袭能力的影响及其可能的作用机制。方法 qRTPCR法检测非小细胞肺癌组织中miR-145和激活增强子结合蛋白4（activating enhancer binding protein4, AP4）mRNA的表达。A549细胞转染miR-145 mimic或者AP4 siRNA后，划痕实验与Transwell小室法分别检测A549细胞的迁移与侵袭能力，qRT-PCR法与免疫印迹法（Western blot）检测A549细胞中AP4 mRNA与蛋白表达水平；双荧光素酶报告基因法检测AP4 mRNA与miR-145的关系。结果 与癌旁正常组织相比，非小细胞肺癌组织中miR-145表达明显降低（P<0.05），而AP4 mRNA和蛋白表达均明显升高（均P<0.05）；与对照组相比，转染miR-145 mimic后，A549细胞中miR-145表达明显升高（P<0.05），AP4 mRNA和蛋白水平明显降低（P<0.05）；A549细胞的迁移数与侵袭能力均显著下降（均P<0.05）；双荧光素酶报告基因法验证AP4 mRNA是miR-145的靶基因。A549细胞转染AP4siRNA后，A549细胞的迁移数与侵袭数显著下降（均P<0.05）。结论 上调miR-145能抑制A549细胞的迁移与侵袭能力，可能与其抑制靶基因AP4表达有关。     

c-Myc在人胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的:探讨c-Myc在人胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:免疫组化和qRT-PCR检测胃癌组织及其癌旁组织中c-Myc的表达;qRT-PCR和Western blot检测人胃黏膜细胞GES-1和人胃癌细胞HGC-27、AGS、SGC-7901中c-Myc的表达;HGC-27细胞转染siRNA-NC和siRNA-c-Myc。48 h后,CCK-8检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭;Western blot检测细胞低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）、CXC亚家族受体4（cysteine X cysteine receptor 4,CXCR4）和基质细胞衍生因子（stromal cell derived factor-1,SDF-1）蛋白表达。结果:与癌旁组织相比,胃癌组织中c-Myc mRNA表达和免疫组化评分升高（P＜0.05）。与GES-1组相比,HGC-27组、SGC-7901组和AGS组中c-Myc mRNA和蛋白表达均升高（P＜0.05）。与siRNA-NC组相比,siRNA-c-Myc组细胞在24 h、48 h和72 h增殖能力减弱（P＜0.05）,G0/G1期细胞比例升高（P＜0.05）,G2/M和S期细胞比例降低（P＜0.05）,迁移细胞数和侵袭细胞数减少（P＜0.05）,HIF-1α、CXCR4和SDF-1蛋白表达降低（P＜0.05）。结论:敲低c-Myc可抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞周期阻滞,该作用可能是通过抑制HIF-1α/CXCR4通路实现的。     

miR-155对乳腺癌细胞增殖、凋亡及耐药蛋白表达的调控作用研究

目的 探讨microRNA-155（miR-155）对乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡及乳腺癌耐药相关蛋白表达的调控作用。方法 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测MCF-7细胞和人乳腺正常上皮细胞中miR-155的表达水平。将MCF-7细胞分为4组：对照组、空转染组、抑制（转染miR-155 inhibitor）组和过表达（转染miR-155 mimics）组,采用qRT-PCR检测转染24、48、72及96 h后各组的转染效果,噻唑蓝（MTT）法检测各组转染24、48、72及96 h的增殖能力,采用流式细胞仪PI／Annexin V双染色法检测各组转染24、48 h后的凋亡率,Western blotting法检测各组转染48 h后乳腺癌耐药蛋白（BCRP）、P-糖蛋白（P-gp）及多药耐药相关蛋白1（MRP1）的表达水平。结果 乳腺癌MCF-7细胞中的miR 155水平高于人乳腺正常上皮细胞（P＜0.05）,且转染miR-155 inhibitor或mimics可呈时间依赖的方式降低或升高MCF-7细胞的miR-155水平（P＜0.05）。与对照组相比,抑制组转染后的细胞增殖率及BCRP、P-gp和MRP1的表达水平均降低,凋亡率升高（P＜0.05）;而过表达组的细胞增殖率及BCRP、P gp和MRP1的表达水平均升高,凋亡率降低（P＜0.05）。结论 MCF-7细胞中miR-155呈高表达,下调miR-155表达可抑制其增殖及耐药相关蛋白的表达,同时诱导凋亡。     

miR-129-5p通过HMGB1 调控乳腺癌MCF-7 细胞对紫杉醇的敏感性

目的：探讨miR-129-5p 通过调控高迁移率族蛋白B1 基因（high mobility group box 1,HMGB1）影响乳腺癌MCF-7 细胞对紫杉醇（paclitaxel,PTX）的敏感性。方法：采用脂质体转染技术将miR-129-5p mimics、HMGB1 小干扰RNA（si-HMGB1）分别转染入MCF-7 细胞,用PTX刺激培养细胞后,用实时荧光定量PCR检测转染后MCF-7 细胞miR-129-5p 和HMGB1 mRNA的表达,Western blotting 检测转染后MCF-7 细胞HMGB1 蛋白的表达,CCK-8 增殖实验检测转染后PTX对MCF-7 细胞增殖的影响,流式细胞术检测转染后对PTX诱导MCF-7 细胞凋亡的影响。结果：转染miR-129-5p mimics 后,MCF-7 细胞中miR-129-5p 的表达水平明显高于阴性对照组细胞（P<0.01）;过表达miR-129-5p 后可明显增强PTX抑制MCF-7 细胞的增殖和诱导细胞凋亡的能力（均P<0.05）,并显著抑制HMGB1 mRNA和蛋白的表达（均P<0.05）。转染si-HMGB1 后,显著降低MCF-7 细胞HMGB1 mRNA 和蛋白的表达（均P<0.05）;干扰HMGB1 表达进一步促进PTX抑制MCF-7 细胞的增殖并诱导细胞凋亡（均P<0.05）。结论：miR-129-5p 通过下调HMGB1 的表达增强乳腺癌MCF-7 细胞对PTX的敏感性。     

miR-198靶向MAPK1调控宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡和侵袭

目的 探究miR-198对宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭的作用及其机制。方法 用miR-198 mimic转染HeLa细胞,qRT-PCR检测miR-198和丝裂原活化蛋白激酶1 （Mitogen-activated protein kinase1, MAPK1）的mRNA水平;荧光素酶实验检测miR-198和MAPK1的靶向关系;用pcDNA3.0-MAPK1（pc-MAPK1）和miR-198 mimic转染细胞,CCK-8检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell法检测细胞侵袭能力,Western blot检测蛋白的表达。结果 miR-198 mimic转染细胞后,miR-198表达水平明显升高,MAPK1 mRNA表达水平明显降低;荧光素酶报告实验表明miR-198序列上存在MAPK1结合位点;miR-198过表达能显著降低宫颈癌细胞增殖倍数、诱导细胞凋亡,同时还能明显降低HeLa细胞侵袭能力;此外,miR-198 mimic能显著抑制MAPK1下游基因核糖体S6激酶2（Ribosomal S6 kinase 2, RSK2）、c-Myc和c-fos的蛋白表达;pc-MAPK1能明显减弱miR-198 mimic对HeLa细胞增殖、凋亡、侵袭及对MAPK1下游蛋白表达的调控作用。结论 miR-198过表达能通过靶向MAPK1抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力并诱导细胞凋亡。     

miR-7抑制喉鳞癌Hep-2细胞增殖及迁移的研究

目的 探讨上调microRNA-7（miR-7）表达对喉鳞癌Hep-2细胞增殖与迁移的作用及可能机制。方法 通过脂质体转染miR-7模拟物（miR-7 mimics）及随机序列（miR-Scramble）,将喉鳞癌Hep-2细胞分成miR-7组、Scramble组和空白对照（Mock）组,实时定量PCR（qPCR）检测转染48 h后各组细胞中miR-7表达,CCK-8法检测转染48 h后的各组细胞的增殖抑制情况,Transwell试验观察转染24 h后细胞迁移能力,qPCR及Western blotting检测PI3K（p110）、AKT及pAKT 的mRNA和蛋白表达情况。结果 miR-7组Hep-2细胞转染miR-7 mimics后miR-7表达水平明显上调,与其余两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）;与Scramble组和Mock组相比, miR-7组Hep-2细胞的增殖抑制率升高,迁移能力降低,且PI3K、AKT及pAKT 的mRNA和蛋白水平均降低（P＜0.05）。结论 上调喉鳞癌Hep-2细胞中miR-7表达能够抑制肿瘤细胞的增殖与迁移,其机制可能与抑制PI3K／Akt信号通路有关。     

miR-124 在乳腺癌中的表达及其作用机制研究

目的:探讨m iR- 124 表达与乳腺癌发生、发展的相关性及机制。方法:运用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测乳腺癌细胞系以及52例患者乳腺癌癌组织和对应的癌旁正常组织样本中miR-124 的表达水平。在乳腺癌细胞株MDA-MB-231和T-47D 中过表达miR-124 后,测定细胞增殖活性以及侵袭转移能力。构建荧光素酶报告载体pMIR- 特异性蛋白1（specificityprotein 1,SP1）的3'UTR,利用荧光素酶活性检测鉴定miR-124 的预测靶基因SP1。qRT-PCR和Westernblot法分别检测SP1 的mRNA 和蛋白质的表达水平。结果:miR-124 在乳腺癌细胞系和癌组织中表达量下调,差异具有统计学意义（P < 0.01）,并与肿瘤的转移、分期、分级和预后相关。在乳腺癌细胞株MDA-MB-231 和T-47D 中过表达miR-124 后抑制乳腺癌细胞系的增殖、侵袭以及迁移（P < 0.01）。 转染miR-124 模拟物显著抑制荧光素酶的活性（P < 0.05）。 转染miR-124 模拟物显著下调MDA-MB-231 和T-47D 细胞中SP1 的mRNA（P < 0.05）和蛋白质的表达水平。结论:miR-124 在乳腺癌癌组织中低表达,miR-124 低表达与乳腺癌不良预后有关,且miR-124 可通过调控转录因子SP1 抑制乳腺癌癌细胞的增殖、侵袭和转移。miR-124 表达异常减少可能是乳腺癌发生、发展的重要因素。      

下调 ZNF139表达对子宫内膜癌细胞 RL95-2增殖和凋亡的影响及其机制

目的：观察 ZNF139表达下调后子宫内膜癌细胞增殖及凋亡变化,并探讨其作用机制。方法：West-ern blot 及 qRT - PCR 检测子宫内膜癌细胞株中 ZNF139蛋白及 mRNA 表达,采用小干扰 RNA（siRNA）转染RL95-2细胞,对 ZNF139表达进行沉默,MTT 检测细胞增殖,流式细胞术检测凋亡,Western blot 及 qRT -PCR 检测凋亡相关基因水平。结果：各细胞株中 ZNF139蛋白及 mRNA 均有表达,RL95-2细胞中表达最高（F =9.345,P ﹤0.05;F =12.269,P ﹤0.01）。MTT 显示,在72h 及96h,siZNF139转染后 RL95-2细胞增殖能力下降（F =12.452,P ﹤0.05;F =14.378,P ﹤0.05）;流式细胞术显示,siZNF139转染后 RL95-2细胞凋亡率升高（F =27.084,P ﹤0.01）;Western blot 显示,在 siZNF139组,凋亡相关基因 MMP -7、p - Akt1及 PI3KCA 蛋白及 mRNA 表达水平低于 MOCK 组及 siNC 组（F =16.342,P ﹤0.05;F =14.651,P ﹤0.05;F =11.269,P ﹤0.05;F =12.342,P ﹤0.05;F =16.173,P ﹤0.05;F =9.672,P ﹤0.05）,Akt 蛋白及 mRNA 水平高于 MOCK 组及 siNC 组（F =15.136,P ﹤0.05;F =11.758,P ﹤0.05）。结论：下调 ZNF139表达可通过调控 MMP -7表达及 PI3K/ Akt 信号通路抑制子宫内膜癌细胞增殖,促进其凋亡,ZNF139可作为子宫内膜癌靶向治疗的靶向候选基因。     

shRNA-CXCR4对人乳腺癌细胞增殖活性的影响

背景与目的：CXCR4足趋化细胞因子SDF—l（基质细胞衍生因子-1）的受体：CXCR4／SDF-1轴在肿瘤侵袭，转移中具有重要作用．阻断CXCR4／SDF-1轴，有可能成为一个新的肿瘤治疗标靶，本研究拟探讨shR-NA—CXCR4对人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA—MB-231，MDA．MB435s细胞增殖活性的影响。方法：通过质粒shRNA—CXCR4沉默CXCR4基因后．RT—PCR，Weslernblot检测3株人乳腺癌细胞的CXCR4mRNA及其蛋白的表达；MTT．流式细胞仪检洲它们的增殖结果：质粒shRNA—CXCR4作用于3株人乳腺癌细胞后能明显抑制其CXCR4基因的tuRNA（MDA—MB-23l：实验组CXCR4／GAPDH为0．152．空白组和阴性对照组分圳为0．40及0．45．MDA-MB-435s：实验组为0．198，空白对照组和阴性对朋组分别为0．690及0．775，MCF-7：实验组为0．089，空白对照组和阴性对照组分别为0．327及0．313）及蛋白表达水平（MDA—MB-231：实验组CXCR4／β-actin为0．153，空白组和阴性对照组分圳为0．829及0．878，MDA—MB-435s：实验组为0．173，空白对照组和阴性对照组分别为0．877及0．906，MCF-7：实验组为0．177，空白对照组和阴性对照组分别为0．911及0．874）（P〈0．05）；MTT显示能明显抑制3株人乳腺癌细胞的增殖（P〈0．05）；流式细胞仪显示3株人乳腺癌细胞S期细胞数量明显减少（P〈0．05），将更多的细胞阻滞在G0／G1朗（P〈0．05）结论：shRNA—CXCR4作用于CXCR4基因后能明显抑制人乳腺癌细咆生长和增殖一可能是治疗乳腺癌的一个潜在治疗耙点。     

miR-1287通过干扰GPX4的表达调控乳腺癌细胞的增殖

目的:探讨miRNA-1287（miR-1287）通过靶向结合并负向调控谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）表达在乳腺癌增殖中的作用及相关分子机制。方法:收集2018年01月至2019年01月期间来我院就诊的50位乳腺癌患者肿瘤标本及癌旁标本;运用实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）,检测乳腺癌患者肿瘤标本及癌旁标本miR-1287、GPX4 mRNA的表达水平;运用Western blot检测乳腺癌患者肿瘤标本及癌旁标本GPX4蛋白表达水平;运用Starbase 2.0软件预测miR-1287与GPX4 mRNA的结合位点;构建野生型位点（wt）和突变型位点（mut）GPX4荧光素酶报告基因质粒,探索miR-1287能否靶向结合并影响GPX4的表达;通过MTT实验检测miR-1287对乳腺癌细胞增殖能力的影响;通过谷胱甘肽（GSH）试剂盒检测乳腺癌细胞GSH水平,运用活性氧（ROS）试剂盒检测乳腺癌细胞活性氧水平。结果:乳腺癌患者肿瘤标本中miR-1287水平显著低于癌旁组织;而乳腺癌患者肿瘤标本中GPX4 mRNA及蛋白表达水平明显高于癌旁组织,其表达水平与miR-1287水平呈负相关关系;Starbase 2.0软件分析结果提示,miR-1287可以直接靶向结合GPX4 mRNA序列中的潜在位点;荧光素酶报告基因实验结果发现,miR-1287 mimic显著降低GPX4（wt）荧光素酶活性,对GPX4（mut）荧光素酶活性无明显影响;过表达miR-1287明显降低乳腺癌细胞GSH水平,增加ROS水平并显著抑制乳腺癌细胞增殖能力,而铁死亡抑制剂Fer-1预处理可以逆转miR-1287对乳腺癌细胞的上述作用,提示miR-1287通过促进铁死亡来执行其抑癌功能。结论:miR-1287通过抑制GPX4表达,进而促进肿瘤细胞铁死亡过程,最终抑制乳腺癌细胞增殖能力。     

SDF-1 and CXCR4 are up-regulated by VEGF and contribute to glioma cell invasion

Glioma cells produce vascular endothelial growth factor (VEGF) to induce vascularization and thereby supply the malignant tissue with oxygen and nutrients. However, little is known about the direct effects of VEGF on tumor cells. In this study, we investigate the ability of VEGF to promote proliferation and invasion of human glioma cells (U251n). Since the chemokine and its receptor, SDF-1/CXCR4, promote glioma cell proliferation and are up-regulated in human glioblastomas, we also tested the effects of VEGF on SDF-1 and CXCR4 mRNA expression. Using cell culture, the effect of VEGF on proliferation of U251n cells was measured using ELISA to detect incorporated BrdU as a marker of DNA syntheses. The effects of VEGF and SDF-1 on U251n cell invasion and proliferation were measured using inhibitors to VEGF receptor1 and receptor2, DC101 and MF1, respectively, and a CXCR4 antagonist (AMD3100). SDF-1 and CXCR4 mRNA expression in U251n and U87MG cells were measured using quantitative PCR. VEGF antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide (AS-VEGF) was also used to down-regulate VEGF expression in U251n cells. VEGF significantly increased U251n cell proliferation and invasion in a dose-dependent manner. These effects were blocked by the VEGF receptor inhibitors, DC101/MF1. The CXCR4 antagonist AMD3100 blocked U251n increased invasion, but not proliferation. CXCR4 and SDF-1 mRNA were up-regulated when U251n and U87MG cells were treated with VEGF. Eight micrometer VEGF antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide (AS-VEGF) down-regulated CXCR4 and SDF-1 mRNA levels in U251n cells. VEGF has a direct effect on U251n glioma cell proliferation and invasion. VEGF up-regulates SDF-1 and CXCR4 mRNA expression, and contributes to U251n cell invasion.