放射诱导HSV-TK基因肺癌靶向性表达的研究

目的:构建由Egr-1启动子驱动HSV-TK基因表达的重组质粒,通过放射诱导调控HSV-TK基因的肿瘤靶向表达,以提高肺癌基因治疗的选择性和有效性。方法:利用基因重组方法构建tgEgr-HyTK表达载体;脂质体介导转染肺癌A549、SHG44细胞系,给以不同剂量γ射线照射,观察照射前后各时相点肺癌细胞HSV-TK表达情况;以及不同浓度前药GCV作用下肺癌细胞相对存活率的变化。结果:γ射线可诱导HSV-TK基因在被转染肺癌细胞表达显著增强,呈剂量依赖性;照射后3h HSV-TK基因表达增强,于第8小时达峰值,第36小时恢复至照射前水平。经放射诱导后,tgEgr-HyTK转染肺癌细胞对GCV的敏感性明显升高(P<0.05);进一步发现,HSV-TK/GCV系统对放射线有较明显的增敏作用。放射和HSV-TK/GCV在肿瘤杀伤作用上存在明显协同效应。结论:利用Egr-1启动子调控HSV-TK基因的肿瘤靶向性表达,是一种高效、特异的肺癌基因治疗新策略。     

电离辐射诱导启动子Egr-1调控的基因放射治疗

基因放射治疗是利用电离辐射诱导目的基因表达进行肿瘤治疗,它是将可经射线诱导表达并对肿瘤具有杀伤作用的基因转入肿瘤细胞,然后对肿瘤实施放射治疗,诱导基因表达,通过射线和基因的双重作用杀伤肿瘤。Egr-1启动子在射线照射下能强烈诱导下游基因表达,是目前研究最多的电离辐射诱导启动子,放射基因治疗中所用的治疗基因主要有：TNF-α基因、CD基因、HSVtk基因等。全文对Egr-1启动子以及Egr-1调控的放射基因治疗的研究现状、目前存在问题与前景进行综述。     

人FAS启动子驱动的HSV—TK重组腺病毒靶向杀伤SKBR3乳腺癌细胞的研究

目的：构建脂肪酸合成酶（FAS）启动子驱动下的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）重组腺病毒，研究其对乳腺癌细胞SKBR3的靶向杀伤作用。方法：以AdEasy^TM腺病毒系统为载体，构建FAS启动子驱动下的HSV—TK重组腺病毒载体Ad—FAS—TK，将线性化的Ad—FAS—TK在AD-293细胞中包装，经过大量扩增和纯化，得到重组腺病毒。M1Tr法检测重组腺病毒Ad—FAS—TK与前体药物更昔洛韦（GCV）对SKBR3细胞的靶向杀伤作用。TUNEL法检测细胞凋亡。结果：成功构建FAS启动子驱动下的HSV—TK重组腺病毒载体Ad—FAS—TK，经包装、扩增和纯化得到约10^10pfu／ml的重组腺病毒。MTT法和TUNEL检测结果显示，FAS启动子驱动下的HSV—TK重组腺病毒与GCV能够诱导SKBR3细胞凋亡，产生靶向细胞毒作用。结论：FAS启动子驱动下的HSV—TK重组腺病毒联合GCV对SKBR3细胞具有靶向杀伤作用，FAS启动子可以作为肿瘤靶向基因治疗的工具。     

pEgr-P16重组质粒的构建及其在EC9706细胞中的辐射诱导表达

目的：构建pEgr-P16重组质粒并检测其在人食管癌细胞系EC9706中的辐射诱导表达。方法：人P16cDNA基因连接到Egr-1启动子的下游构建成pEgr-P16重组质粒，利用脂质体介导转染人EC9706细胞，用Western blot方法检测不同剂量γ射线照射后被转染细胞中P16的表达。结果：酶切鉴定证实pEgr-P16重组质粒构建正确。被pEgr-P16重组质粒转染的人食管癌EC9706细胞经不同剂量γ射线照射后，P16基因表达均高于未照射组。结论：γ射线可诱导pEgr-P16重组质粒在人EC9706细胞中表达增强。     

放射诱导抑瘤素M靶向肿瘤表达治疗肺癌实验研究

目的利用放射敏感性调控序列诱导抑瘤素M(OSM)靶向肺癌表达，探索肺癌治疗新方法。方法利用基因重组构建放射可调控的OSM表达载体pEO，转染肺腺癌A549细胞，观察γ线照射后细胞OSM表达及其对细胞相对存活分数和存活曲线的影响。利用肺癌移植瘤观察不同处理的抑瘤效应。结果γ线可诱导OSM在pEO转染肺癌细胞表达显著上调，呈剂量依赖性。pEO转染肺癌细胞株对辐射敏感性增强，增殖活性显著受抑。6Gy照射联合pEO转染可显著抑制移植瘤生长，并可使30％的移植瘤完全消退。结论由辐射敏感性启动子驱动的OSM肿瘤靶向性表达，可望为肺癌治疗提供一条新途径。     

缺氧/辐射双敏感性启动子调控HSV-TK表达对肺癌移植瘤的作用

背景与目的放射-基因治疗是近年来国际上肿瘤治疗的新策略,由于实体瘤常处于缺氧状态而对放射敏感性低,放射-基因治疗尚未达理想疗效。本研究拟构建缺氧/辐射双敏感性启动子,增强缺氧条件下放射诱导的HSV-TK表达水平,提高肺癌放射-基因治疗效果。方法利用基因重组构建HRE-Egr启动子及其调控的HSV-TK表达载体;脂质体介导重组质粒转染肺癌A549细胞,分为对照组、放射组(6Gy)、缺氧组(1%氧浓度)和放射合并缺氧组,Northernblot法检测转染细胞中HSV-TK表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测放射、缺氧和GCV处理后的细胞存活率。建立BALB/c裸鼠肺癌移植瘤模型,检测放射合并质粒转染后移植瘤体积变化并计算抑瘤率。结果对照组细胞仅可检测到HyTK的低水平表达(21U),放射组和缺氧组HyTK基因表达水平均显著升高(分别为227U和94U),放射合并缺氧组(769U)显著高于放射组。在缺氧条件下,放射合并GCV处理后细胞存活率为(7.2±1.8)%,显著低于常氧组的(32.7±4.6)%。放射联合GCV可明显抑制HRE-Egr启动子转染肺癌移植瘤,抑瘤率达91.2%。结论HRE-Egr启动子具有辐射/缺氧双重敏感性,并使放射后的HSV-TK表达水平在缺氧下得到显著增强。放射联合HRE-Egr启动子可显著抑制肺癌移植瘤的生长。     

辐照后辐射敏感启动子CArG调控HSVtk基因对肺癌细胞的杀伤效应

放射-基因治疗是将放射敏感性调控序列与治疗基因相耦联，在肿瘤受照射时诱导治疗基因仅在肿瘤内表达，以提高治疗效率。是肿瘤治疗的一种新策略。Egr-1属即刻早期应答基因家族成员之一，是编码533个氨基酸的核酸蛋白转录因子，含6个高度保守的CC（A／T）。GG结构域，又称为cA以元件。据报道CArG元件比天然的Egr-1基因射线应答性更强。本研究为了构建包含CArG元件和增强的绿色荧光蛋白（EGFP）或HSVtk基因的载体，观察射线照射时CArG元件诱导EGFP在SPCA1和A549肺癌细胞株中的表达变化；将pDNA．CArG．HSVtk质粒短暂结逝SPCA1和AS49细胞株，照射后加入GCV，     

人Egr-1启动子调控的自杀基因真核表达载体的构建及其在鼻咽癌细胞株中的放射诱导表达

[目的]构建由人Egr-1放射诱导性启动子调控的自杀基因靶向性真核表达载体,并转染人鼻咽癌细胞株CNE,比较射线诱导前后自杀基因在鼻咽癌细胞中的表达情况。[方法1根据Genebank数据库提供的人Egr—1启动子基因序列,设计-对引物克隆人Egr-1启动子,采用PCR、酶切、连接等分子生物学技术,构建pcDNA3．1（＋）-Egr-1-CD重组质粒表达载体,并利用脂质体转染方法转染人CNE细胞株,经G418筛选后获得阳性细胞克隆。RT—PCR分析鉴定0、5、10、15、20Gy放射剂量进行6MVX线照射对CD基因表达的影响。f结果1经PCR、酶切、测序等证实了pcDNA3．1（＋）-Egr．1．CD重组靶向性质粒表达载体构建成功,G418筛选所得到的CNE细胞阳性克隆经不同放射剂量的诱导后,RT—PCR结果显示体外放射线照射可显著提高CNE细胞中CDmRNA的表达水平,在10Gy及15Gy组CDmRNA的表达水平明显增高,尤以15Gy组CDmRNA的表达水平最高,在20Gy组CDmRNA的表达水平反而下降。[结论]pcDNA3．1（＋）-Egr-1-CD重组质粒表达载体构建成功,并成功转染人鼻咽癌细胞株．建立了基因表达与放射的剂量效应关系．为后续的临床应用研究奠定基础．     

放射诱导的一氧化氮同步放大基因电路的构建及鉴定

背景与目的 正反馈基因电路（genecircuits）对基因表达有放大作用，目的 基因在细胞内的同步化表达可进一步增强基因治疗效果。本研究旨在构建由放射诱导的一氧化氮（nitric oxide，NO）同步放大基因电路，以探索提高目的基因表达水平、延长表达时间的新途径，从而进一步完善肿瘤放射基因治疗模式。方法 将具有放射诱导性的c-fos启动子与诱导性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）串联，构建c-fos启动子驱动的iNOS和绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）双顺反子表达载体pros-iNOS／GFP；用脂质体介导该载体转染肺腺癌A549细胞，予以一定剂量照射，观察照射后不同时相点细胞荧光强度，检测iNOS蛋白表达水平。结果转染载体pros-iNOS／GFP的细胞照射后细胞荧光强度、iNOS表达水平均较对照组明显增加，其中以照射后16h增加最为明显。结论成功构建了放射诱导的NO同步放大基因电路，大大提高了放射诱导的目的基因的表达水平，为进一步提高肿瘤放射基因治疗的疗效奠定了理论基础。     

辐射诱导Egr-1调控腺病毒介导Smad 7基因对Lewis肺癌生物学行为影响的在体研究

目的研究射线诱导下Egr-1基因启动子调控腺病毒介导的Smad 7基因在C57BL/6J小鼠Lewis肺癌原发病灶内表达后，对原发灶及远处肺转移发生的影响。方法将Egr-1基因启动子的辐射敏感元件和Smad 7 cDNA包装到复制缺陷型腺病毒内，制备成AD．Egr-Smad 7。接种Lewis肺癌细胞于小鼠右后肢外侧，建立荷瘤小鼠模型，肿瘤直径达0．8～1．0cm时进行实验。小鼠被随机分人空白对照、生理盐水（NS）XCN、AD．Egr-Smad 7对照、单纯照射、NS＋照射、AD．Egr-Smad 7＋照射组（6只／组），分别进行如下研究：（1）隔日记录肿瘤长径及短径，观察肿瘤生长曲线、生长延迟时间及小鼠生存时间；（2）观察肿瘤照射2周时肺转移发生情况；（3）观察肿瘤生长至照射时4倍体积时肺转移发生情况。结果放射线诱导Egr-1基因启动子调控腺病毒介导的Smad7基因在C57BL小鼠Lewis肺癌原发病灶内表达后，有抑制原发肿瘤生长及延长小鼠生存时间的作用（P〈0．05），对肿瘤远处肺转移的发生无明显影响（P〉0．05）。结论放射线诱导AD．Egr-Smad7无促进小鼠Lewis肺癌肿瘤局部病灶发展及远处脏器转移的危险性，并且有抑制原发肿瘤生长及延长生存时间的作用。将AD．Egr-Smad7用于阻断TGF-β信号传导通路，靶向性基因治疗放射性肺纤维化具有一定的安全性。     

人MUC4启动子驱动的HSV—TK重组腺病毒靶向杀伤SGC-7901胃癌细胞的实验研究

目的：构建人粘蛋白（MUC4）启动子驱动下的单纯疱疹胸苷激酶基因（HSV-TK）重组腺病毒,研究其对SGC一7901胃癌细胞的靶向杀伤作用。方法：克隆MUC4启动子区625bp活性序列,构建重组荧光素酶报告基因载体pGL3MUC4,检测其在sGD790l胃癌细胞及NIH3T3成纤维细胞中的转录活性。以AdEasy。”腺病毒系统为载体,构建Muc4启动子驱动下的HsV—TK重组腺病毒rAdeno—MUC4一TK,感染SGC7901及NIH3T3,经更昔洛韦（GCV）处理,MTT法检测细胞活力,TUNEL法检测细胞凋亡。结果：成功扩增出大小为625bp的MUC4启动子序列。pGL3一MUC4在SGC一790l细胞中具有强转录活性,转录活性高于强启动子SV406．6倍,而NIH3T3成纤维细胞系中几乎无转录活性。构建重组腺病毒rAdeno—MUC4一TK,MTT法和TUNEI。检测结果显示,其与GCV联合能够诱导SGC-7901细胞凋亡,产生靶向细胞毒作用。结论：人MUC4启动子驱动下的HSV—TK重组腺病毒联合GCV对SGC一7901胃癌细胞具有靶向杀伤作用,MUC4启动子可以作为胃癌靶向基因治疗的工具。     

hTERT启动子驱动的HSV-TK基因对人胰腺癌细胞patu8988的杀伤作用

[目的]探讨hTERT启动子驱动的HSV-TK基因对人胰腺癌细胞patu8988的杀伤作用。[方法]应用分子生物学方法构建hTERT启动子调控下的TK基因真核表达载体。经同源重组产生重组腺病毒PSG-TP-TK。同法制备PSU-CMV-TK。利用重组腺病毒PSG-TP-TK和PSU-CMV-TK感染人胰腺癌细胞株patu8988和正常人原代成纤维细胞．加入GCV。用MTT和流式细胞仪检测PSG-TP-TK对各种细胞的杀伤作用;应用RT—PCR检测转染腺病毒后肿瘤细胞和正常细胞中TK基国的表达情况。[结果]PSG-TP-TK对端粒酶阳性的人胰腺癌细胞有明显的杀伤作用．而对端粒酶阴性的正常细胞则无杀伤作用（P〈0．05）。hTERT启动子诱导人胰腺癌细胞株patu8988凋亡的效能与CMV启动子相似。两者差异无显著性（P〉0．05）。PSU-CMV-TK转染后．在patu8988细胞和正常人原代成纤维细胞中均可检测到TK基因;而PSG-TP-TK转染后只有patu8988细胞中有TK基因表达．正常人原代成纤维中则无。[结论]hTERT启动子驱动HSV-TK基因治疗是一种新的胰腺癌靶向治疗方法．具有更高的靶向性和高效性。     

寡核苷酸Dbait乏氧放射双表达对人宫颈癌细胞的乏氧放射增敏效应

基因-放疗是将放射敏感性调控序列与治疗基因和药物相耦联,在肿瘤放疗同时诱导目的基因和药物在肿瘤内高效表达,从而提高肿瘤放射敏感性,它是近年来肿瘤放疗新策略^\[1\]。早期生长反应-1(early growth response-1,Egr-1)启动子在电离辐射诱导下能增强下游基因表达,并可提高放疗效果;乏氧反应元件(hypoxia response elements,HRE)在乏氧条件下可增强下游基因表达水平。笔者利用HRE和Egr-1构建乏氧放射双敏感嵌合性启动子HRE/Egr-1诱导寡核苷酸药物Dbait表达,并观察该重组质粒在乏氧条件下对人宫颈癌Hela细胞的乏氧放射增敏效应。     

HSV-TK/GCV体系对前列腺癌PC-3m细胞杀伤作用的实验研究

目的：探讨HSV－TK／GCV体系对前列腺癌PC-3m细胞的杀伤作用。方法：应用逆转录病毒载体将HSV－TK基因转染PC－3m细胞，经RT－PCR鉴定后，MTT、流式细胞仪、电镜等方法检测丙氧鸟苷（GCV）对转染后PC－3m细胞的杀伤作用，同时以未转染PC－3m细胞为对照。结果：GCV对正常PC－3m细胞毒性较低，而对转染后PC－3m细胞有较强的细胞毒作用，但旁观者效应不明显。结论：HSV－TK／GCV体系对前列腺癌细胞具有明显杀伤作用，有必要进一步研究。     

腺病毒介导HSV-TK/GCV系统联合放射治疗口腔鳞癌的研究

目的 探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV－TK）／丙氧鸟苷（GCV）自杀基因系统对放射治疗的增敏作用。方法 口腔鳞癌细胞（Tca8113细胞系）经HSV－TK／GCV系统治疗后给予放射治疗，采用LQ和单击多靶（SHMT）模型分析细胞存活曲线参数。结果 细胞存活曲线分析显示：单纯放射治疗组其α为0.1074,β为0.0158,D0为2.2576,Dq为3.5413；与单纯放射治疗组比较，HSV－TK／GCV治疗组α（0.2127)和α：β（9.496)值大，D0（1.4526)和Dq(2.2257)值小，其放射增敏率（SER）为1.55。结论 HSV－TK／GCV系统具有放射增敏作用，可提高放射治疗对口腔鳞癌的治疗疗效。     

靶向治疗肺癌双自杀基因HSV-TK/CD真核表达载体的构建

背景与目的：本研究构建CEA启动子和CMV增强子调控表达的HSV-TK和CD基因双顺反子真核表达载体CMVE—pCEA—TK—IRES—CD。方法：根据特异性引物PCR扩增获得CEA启动子（pCEA），巨细胞病毒的早期基因增强子（CMVE）序列，用基因重组的方法替换载体PIRES-EGFP通用启动子pCMV，得到重组质粒CMVE-PCEA-IRES-EGFP，转染重组质粒到表达CEA的肺癌细胞株中进行绿色荧光蛋白检测，确定启动子能有效启动报告基因在CEA阳性的肺癌细胞中的表达。用PCR扩增得到目的基因HSV—TK和CD，将目的基因HSV-TK和CD亚克隆到载体CMVE-pCEA-IRES-EGFP上，得到自杀基因HSV-TK／CD双表达载体CMVE-pCEA-TK-IRES-CD。结果：经酶切、PCR及DNA测序鉴定，双自杀基因真核表达载体CMVE-pCEA-TK-IRES-CD已成功构建，嵌合启动子CMVE-pCEA调控下能启动下游报告基因在CEA阳性的肺癌细胞株的表达。结论：成功构建了嵌合启动子CMVE-pCEA启动的双自杀基因HSV—TK／CD真核表达载体，为下一步研究双自杀基因对于CEA阳性表达的肺癌的治疗奠定了基础。     

应用RV-HSV-TK基因转染胰腺癌细胞及转染阳性的细胞对GCV敏感性研究

由缺陷型逆转录病毒介导的TK基因系统（RV－HSV－TK）是众多肿瘤生物治疗方法中一个技术较为成熟的方案，本实验采用该系统在体外成功地转染了人胰腺癌细胞株SW1990并能够稳定传代培养，转染了TK基因的SW1990细胞（SW±K），其生长曲线与未转染的SW1990细胞无差异。10－4～102μg／ml的GCV对SWtk有明显的毒性作用（IC50＝2．5μg／ml），杀伤效应与时间成正比，作用48小时以后开始出现毒性作用。将SW1990细胞与包装细胞共孵育48小时以上，再加入10μg／ml的GCV作用120小时，约有50％的SW1990细胞被杀死。结果表明：采用RV－HSV－TK系统转染胰腺癌细胞，有较高的转染效率，转染了TK基因的胰腺癌细胞对GCV敏感。     

HSV_1-TK转染人肺腺癌细胞A549的实验研究

目的　体内外观察HSV1 TK/GCV对人肺腺癌细胞A5 49的杀伤效应。方法　构建含TK基因的逆转录病毒表达载体 ,电穿孔法转化肺癌细胞A5 49。MTT法检测转染细胞对GCV的药物敏感性 ,并观察旁观者效应 ;电镜、FCM、TUNEL法检测GCV诱导转染细胞凋亡变化 ;PCR和细胞原位杂交分别检测转染细胞TK基因整合和表达 ;活体内观察GCV对转染细胞、亲代细胞接种裸鼠皮下肿瘤治疗效果。结果　转基因细胞变得较不规则 ,多角型 ,易形成空泡。A5 49、A5 49 PLXSN、A5 49 TK三种细胞体外倍增时间分别为 ( 3 6.15± 3 .2 7)、( 4 0 .82± 3 .75 )和 ( 4 2 .0 6± 4.12 )小时 (P >0 .0 5 )。转染细胞对GCV的敏感性比亲代细胞提高 46倍 (P<0 .0 0 1)。旁观者效应在高细胞密度接种 ( 1× 10 4细胞 /孔 )较低细胞密度接种 ( 1× 10 3细胞 /孔 )明显。电镜发现转染细胞有凋亡小体、核呈半月征。FCM、TUNEL均能检测到转染细胞凋亡发生率明显高于对照细胞 (P<0 .0 0 1)。PCR及原位杂交表明转染细胞有TK基因整合和表达。体内实验表明GCV能明显抑制转染细胞接种的肿瘤 ,而亲代细胞接种的肿瘤未受抑制。结论　转TK基因细胞在体内外都获得了对GCV的敏感性。TK/GCV系统杀灭肿瘤可能与诱导细胞凋亡有关。GCV能在活体内抑制转TK基因细胞裸鼠移     

两种甲胎蛋白启动子调控下PNP基因载体的克隆和表达差异性分析

目的：分别构建甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)启动子AF0．3和AFP杂合启动子[HRF]AF调控的PNP基因表达载体，检测并分析两者的表达差异性。方法：将AF0．3和[HRE]AF启动子插入载体pcDNA3．0中，构建肝癌特异表达载体pAF0．3和p[HRE]AF；将PNP基因分别插入pAF0．3和p[HRE]AF中，构建两启动子调控的PNP基因表达载体；通过酶切、PCR及测序鉴定各重组体。用脂质体介导法将两重组体转染不同细胞株．RT-PCR检测PNP基因在各细胞株中表达，分析两者表达的特点。结果：两目的片段均正确插入相应载体，pAF0．3/PNP中的PNP基因在AFP阳性肝癌细胞中实现了靶向性表达，而p[HRE]AF/PNP中的PNP基因则在AFP阳性和阴性肝癌细胞中实现了靶向性表达。结论：两种PNP基因表达载体是肝癌基因治疗中新型、高效、特异性的治疗载体。两者的成功构建为利用PNP Mep-dR系统进行肝癌的靶向性基因治疗奠定了坚实的基础。     

脂质体/DNA复合物介导HSV-TK基因在膀胱癌细胞的表达和生物活性

目的：探讨脂质体／HSV－TK重组DNA对膀胱癌细胞的转导和细胞内的活性表达。方法：用脂质体／DNA复合物交HSV－TK基因逆转录病毒重组子（pLXSN-TK)导入膀胱癌细胞株BIU87。携带HSV－TK基因的BIU87细胞（BIU87－TK）由G418筛选获得。经过Southern杂交和细胞原位杂交检测后,观测ACV对BIU87－TK细胞存活的影响。结果：Southern印迹杂交证实HSV－TK基因存在于BIU87－TK细胞染色体中。细胞原位杂交检测HSV－TKmRNA的表达。外源DNA的导入以及HSV－TK和Neo 基因表达不会改变细胞生长特性。然而,在ACV作用下,转导HSV－TK基因的膀胱癌细胞的存活率受到影响,ACV可显著抑制癌细胞生长。结论：脂质体／TK重组DNA复合物可用于膀膛癌细胞的转基因治疗。