结核分枝杆菌Rv2352c基因的克隆表达及其抗原活性鉴定

目的构建含结核分枝杆菌(M.tb)rv2352c基因原核表达载体,经转化E.coli以表达Rv2352c融合蛋白,并研究其抗原性。方法用PCR扩增M.tb rv2352c基因,克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv2352c重组质粒,阳性克隆测序验证正确后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导Rv2352c蛋白表达。经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE和结核患者血清Western blot进行鉴定。将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,制备抗Rv2352c抗血清,抗血清的效价测定采用酶联免疫吸附试验法(ELISA),取兔抗血清与纯化蛋白Rv2352c通过Western blot方法,检测抗体特异性。结果经酶切鉴定和测序分析证实rv2352c原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在45 kD处呈现单一蛋白条带。用重组蛋白Rv2352c免疫接种后可诱导出高滴度的特异性抗体。纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的蛋白,有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv2352c,制备和纯化的Rv2352c融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,为进一步研究结核病的潜在分子标志物奠定基础。     

结核分枝杆菌Rv0867c基因的克隆表达及其纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv0867c基因的原核表达质粒，获得结核分枝杆菌Rv0867c基因的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA，采用聚合酶链反应（PCR）技术扩增目的基因片段；通过克隆载体pUC19构建质粒载体pUC19-Rv0867c，经序列测定证实正确，双酶切后连接于表达载体pPRO-EXHT，转化入大肠杆菌DH5α中，再经IPTG诱导表达带His标签的Rv0867c融合蛋白；用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式。结果成功扩增出了结核分枝杆菌Rv0867c基因，构建了具有正确基因序列的表达载体pPRO-EXHT-Rv0867c，转化入大肠杆菌DH5α中，经诱导产生高水平的表达产物。经SDS分析，在80kD处出现新生蛋白带，凝胶薄层扫描检测表达量约占菌体蛋白的23．7％。该融合蛋白以包涵体的形式存在，用Ni^2＋-NTA纯化柱在变性条件下进行纯化。结论成功克隆了结核分枝杆菌Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物，为进一步研究Rv0867c基因蛋白的活性及其功能，以及结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv0867c基因的克隆表达及其纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv0867c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rv0867c基因的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增目的基因片段;通过克隆载体pUC19构建质粒载体pUC19-Rv0867c,经序列测定证实正确,双酶切后连接于表达载体pPRO-EXHT,转化入大肠杆菌DH5α中,再经IPTG诱导表达带His标签的Rv0867c融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式。结果成功扩增出了结核分枝杆菌Rv0867c基因,构建了具有正确基因序列的表达载体pPRO-EXHT-Rv0867c,转化入大肠杆菌DH5α中,经诱导产生高水平的表达产物。经SDS分析,在80 kD处出现新生蛋白带,凝胶薄层扫描检测表达量约占菌体蛋白的23.7%。该融合蛋白以包涵体的形式存在,用Ni²⁺-NTA纯化柱在变性条件下进行纯化。结论成功克隆了结核分枝杆菌Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究Rv0867c基因蛋白的活性及其功能,以及结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性和克隆表达

目的鉴定结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性,克隆表达该基因并获得其重组蛋白。方法设计Rv1512基因的特异性引物,并鉴定其特异性。构建pET30a（＋）：Rv1512重组质粒,阳性克隆转化入大肠杆菌BL21。经Ni＋-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE鉴定该蛋白及其纯度。结果结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性被证实;经测序分析证实Rv1512原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE结果显示在40 kD处呈现单一蛋白条带。结论结核分枝杆菌Rv1512基因具有较好的特异性;成功构建表达载体pET30a（＋）：Rv1512并获得重组蛋白,为辅助诊断结核分枝杆菌的感染奠定基础。     

结核分枝杆菌NrdF1、PE_PGRS35、Rv1985c和Rv1986的原核表达及检测牛结核病抗体之应用

目的 在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD2区域的NrdF1、PE_PGRS35、Rv1985c和Rv1986蛋白,并评价诊断牛结核病中的应用潜能。方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR 扩增nrdF1,pe_pgrs35,rv1985c 和 rv1986基因,并将其克隆到表达载体中,重组表达质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,镍柱亲和纯化重组蛋白,SDS-PAGE和Western blotting试验鉴定目的蛋白的表达及其反应原性。以纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过ELISA方法测定牛血清中特异性抗体,以之评价这些蛋白用于牛结核病抗体检测的价值。结果 成功表达了NrdF1、PE_PGRS35、Rv1985c和Rv1986蛋白,相对分子质量为42 ku、63 ku、46 ku和41 ku,对表达产物进行镍柱亲和纯化,获得了纯度较高的融合蛋白。重组蛋白均能与抗HIS单抗发生特异反应,表现出良好的反应原性。通过间接ELISA方法检测牛血清中特异性抗体,阳性检出率分别为7.35%、22.06%、16.18% 和16.18%。结论 结核分枝杆菌原核表达的NrdF1、PE_PGRS35、Rv1985c和Rv1986蛋白具有用作牛结核病血清学诊断试剂的潜能。     

结核分枝杆菌Rv2660c蛋白原核重组表达及其免疫活性研究

目的利用原核表达系统表达、纯化结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白Rv2660c,评价其在血清学方面用于结核病诊断的价值。方法合成Rv2660c全基因核酸序列,构建pET28a-Rv2660c融合表达载体,在原核系统内进行重组表达,亲和层析纯化重组Rv2660c蛋白,采用Western-Blot、ELISA实验分析重组蛋白的免疫反应。结果pET28a-Rv2660c在大肠杆菌内成功表达重组Rv2660c蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白分子量为10.2 KD,与预期一致,Western-Blot结果表明重组蛋白Rv2660c只能与活动性结核患者血清反应,出现一条杂交条带;ELISA结果发现重组Rv2660c蛋白与结核患者血清能产生较强的反应,结核病菌阳患者组、菌阴患者组、潜伏感染组以及健康对照组A450平均值分别为0.52、0.48、0.28和0.25。结论重组结核分枝杆菌Rv2660c蛋白具有一定的免疫原性,对活动性结核病的诊断具有一定的价值,但对结核分枝杆菌潜伏感染的诊断没有价值。     

结核分枝杆菌Rv1446c、Rv2145c、Rv2971、Rv0491基因的克隆表达研究

目的在大肠杆菌中高效表达结核分枝杆菌Rv1446c、Rv2145c、Rv2971、Rv0491的蛋白。方法通过聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增Rv1446c、Rv2145c、Rv2971、Rv0491基因,以质粒pET28a为表达载体,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)。以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,通过SDS-PAGE鉴定rRv1446c、rRv2145c、rRv2971、rRv0491在大肠杆菌中的表达。经质谱仪测定重组蛋白的分子量。结果与结论4个重组蛋白成功在大肠杆菌中表达,分子量实测值与理论相近。     

结核分枝杆菌Rv3425-Rv1168c蛋白融合表达与血清学评价

目的 原核表达结核分枝杆菌Rv3425-Rv1168c融合蛋白并进行纯化,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法评价重组蛋白在结核病血清学诊断中的价值。方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,通过重叠PCR扩增得到Rv3425-Rv1168c全核酸序列克隆至表达载体pET-24b中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,通过ELISA检测100份确诊结核病人、20例非结核呼吸疾病患者、100份健康人血清,评价融合蛋白进行临床血清学诊断的可行性。结果 Rv3425-Rv1168c融合蛋白在原核系统内获得高表达,纯化的融合蛋白经ELISA方法测定,在血清学实验中敏感性为54%,特异性为95%。结论 Rv3425-Rv1168c融合蛋白具有较高的抗原特异性和免疫原性,在结核病血清学诊断方面具有很大的应用价值。     

结核分枝杆菌14000抗原基因的克隆、表达纯化及抗原性分析

目的对结核分枝杆菌14 000抗原基因进行克隆表达及纯化,并评价其抗原性。方法以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,用PCR方法获得目的基因构建大肠杆菌高效表达株;亲和层析柱纯化重组蛋白;进SDS-PAGE电泳鉴定;通用ELISA法进行重组蛋白的抗原性检测分析。结果获得了结核分枝杆菌抗原14 kD基因,在大肠杆菌BL21中高效表达,Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分枝杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应。ELISA分析中,该纯化的重组抗原敏感性、特异性和准确性分别为:52.5%、96.7%和67.2%,具有良好的抗原性和较高的特异性。结论14 kD重组蛋白抗原具备良好的抗原性与特异性,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及抗原、抗体的大规模制备打下基础。     

结核分枝杆菌CFP-10与Rv2626c蛋白的表达及血清学诊断研究

目的　通过构建结核分枝杆菌（结核菌）CFP-10和Rv2626c蛋白表达载体,并在大肠杆菌表达,对其免疫反应性进行鉴定评价。方法　用PCR法从结核菌H37Rv基因组DNA分别扩增出CFP-10、Rv2626c基因,连接到表达载体PET30a上, 在大肠杆菌中表达;组氨酸标签(His - Tag) 镍柱层析纯化重组蛋白;用ELISA方法进行检测。结果　构建了含CFP10、Rv2626c重组质粒的大肠杆菌工程菌, 发现目的蛋白主要以可溶形式存在;用重组CFP10、Rv2626c蛋白组成联合抗原, ELISA方法检测214份血清, 阳性率达77.1%。结论　目的基因克隆入宿主菌中并表达成功, 重组的CFP-10、Rv2626c蛋白组成联合抗原可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。     

结核分枝杆菌Rv3621c原核表达及免疫功能研究

目的 以结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)H37Rv基因组为模板,构建、纯化及鉴定原核表达质粒pPROEX-Rv3621c,通过人群、小鼠试验进行免疫原性评价。方法 构建重组质粒pPROEX-Rv3621c,并以全血干扰素释放分析技术(Whole-blood IFN-γ release assay,WBIA)检测其能否被安徽省淮南市M.tb感染者T细胞特异性识别。rRv3621c混合佐剂MTM[母牛分枝杆菌(M.vaccae),人工合成海藻糖-6'6,二分枝菌酸(TDB),单磷酰脂质A(MPLA)]免疫小鼠后,检测血清中特异性抗体分泌水平、脾细胞中抗原特异性Th1型细胞因子分泌水平及肺脏细胞因子mRNA表达水平。结果 成功构建重组质粒pPROEX-Rv3621c,并使之诱导表达、纯化和鉴定。在rRv3621c蛋白诱导下,活动性结核(Active tuberculosis, ATB)患者外周血淋巴细胞释放的IFN-γ水平明显较高(t=4.813, P<0.01),且ATB患者产生的IFN-γ水平高于潜伏性结核(Latent tuberculosis infection, LTBI)人群(t=4.442, P<0.01)。BCG+Rv3621c/MTM组小鼠产生的特异性抗体滴度水平明显高于Rv3621c/MTM组(P<0.01)和BCG组(P<0.01),Rv3621c/MTM组和BCG+Rv3621c/MTM组小鼠的IgG2a/IgG1比值大于1,明显高于MTM组和BCG组。BCG+Rv3621c/MTM组小鼠均分泌高水平IFN-γ、TNF-α和IL-2。Rv3621c/MTM组小鼠肺脏组织中IFN-γ、TNF-α及iNOS表达水平较高。结论 M.tb感染者外周血T细胞可特异性识别rRv3621c蛋白,rRv3621c混合佐剂MTM可以诱导较强烈的抗原特异性Th1型免疫应答。     

结核分枝杆菌Rv3134c蛋白抗原表位的预测

目的 预测结核分枝杆菌Rv3134c的抗原表位,了解其免疫学特性。方法 利用DNAStar软件包中Protean软件对Rv3134c氨基酸序列进行分析,采用包括二级结构、亲水性、抗原性、表面可能性、柔韧性等多参数预测其二级结构及T细胞和B细胞抗原表位,最后BLAST分析其与人类抗原表位的同源性。结果 Rv3134c蛋白具有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区段,含有较多潜在的B细胞抗原表位,可能位于1-7、30-37、65-81、89-100、111-120、138-148、184-195、209-216、233-238位氨基酸残基或其附近,这些区域基本上含有β转角结构,亲水性、表面可能性和柔韧性指数都较高。该蛋白潜在的T细胞抗原表位较少,可能位于62-76、89-97、185-195、203-213、219-231、248-255位氨基酸残基或其附近。BLAST分析结果显示,其与人类抗原表位的同源性很低。结论 结核分枝杆菌Rv3134c是一个即含有较多B细胞抗原表位又含有较多T细胞抗原表位的蛋白抗原,实验结果为该蛋白抗原表位的进一步研究与合成肽疫苗奠定了基础。     

GFP-Rv2626c融合蛋白表达载体的构建及表达纯化

目的构建含Rv2626c基因的原核表达载体,获得GFP-Rv2626c融合蛋白,为今后开发鉴别结核感染的血清学诊断试剂打下基础。方法以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,经PCR法扩增得到Rv2626c基因DNA片段。将扩增片段克隆到pGM-T载体中测序,并进一步将Rv2626c亚克隆到pET28a-GFP中,构建原核重组表达载体pET28a-GFP-Rv2626c。将pET28a-GFP-Rv2626c转化E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导目的基因表达,经SDS-PAGE和Western-blot分析和纯化该表达产物。结果经核苷酸序列测定和酶切鉴定,成功构建了重组质粒pET28a-GFP-Rv2626c。用IPTG诱导该质粒转化的E.coliBL21后,获得分子量约46kD的GFP-Rv2626c融合蛋白。经Ni-NTA Agarose试剂盒进行蛋白纯化,获得纯化的GFP-Rv2626c融合蛋白。结论成功制备出重组GFP-Rv2626c融合蛋白,为开发鉴别结核感染的血清学诊断试剂打下了基础。     

结核分枝杆菌Rv1009基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建结核分枝杆菌Rv1009基因真核表达载体。方法PCR扩增Rv1009基因,测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染P815细胞后,分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果构建了重组质粒pCDNA-Rv1009,RT-PCR结果证明Rv1009可在P815细胞中转录,用间接免疫荧光检测,表达有Rv1009蛋白的细胞着染。结论成功构建了结核分枝杆菌Rv1009基因的真核表达载体pCDNA-Rv1009,Rv1009基因可以在P815细胞中表达。