Nogo受体在早期糖尿病大鼠视网膜神经节细胞凋亡中的作用

目的:探讨Nogo受体(nogo receptor,NgR)在糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠视网膜神经节细胞凋亡中的作用及机制。方法:链脲佐菌素诱导SD大鼠DM模型,实验分4组,对照组;DM组;siNgR组:DM大鼠玻璃体内给予NgR反义核苷酸序列;siRNA空白组:DM大鼠玻璃体内给予阴性核苷酸序列。1mo后TUNEL染色检测视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)凋亡,试剂盒检测视网膜丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,Western-blot检测视网膜NgR及caspase-3含量。结果:对照组、DM组、siRNA空白组及siNgR组MDA含量分别为3.74±0.49,7.21±0.96,6.41±1.34及4.02±0.53nmol/mg prot。与对照组相比,DM组及siRNA空白组视网膜RGC凋亡增加,NgR及caspase-3表达上调,MDA含量升高(P<0.05),而siNgR组视网膜RGC数量、NgR及caspase-3表达、MDA含量较对照组均无明显变化(P>0.05)。结论:NgR表达增加是糖尿病RGC凋亡的重要原因之一,其机制可能与NgR诱导视网膜氧化应激、上调caspase-3表达有关。     

pEGFP-N1-Endostatin重组质粒的构建及其体外表达

目的构建分泌型人内皮抑素（ES）的真核表达载体pEGFP-N1-Endostatin重组质粒,鉴定其蛋白的体外瞬时表达。方法以pcDNA3-Endo质粒为模板,通过PCR扩增获得人ES基因片段,且在基因前加信号肽序列,将其定向插入真核表达载体pEGFP-N1中,获得重组质粒pEGFP-N1-ES。采用HindⅢ和BamHⅠ双酶切法、PCR法及插入片段序列测定法鉴定该质粒。利用阳离子脂质体介导法,将其转染到人胚胎肾HEK-293细胞中,采用免疫组织化学法和Westernblot法检测转染细胞内及培养上清液中ES蛋白的表达。结果通过HindⅢ和BamHⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证明构建出了含ES基因的真核表达载体,且插入片段正确。采用免疫组织化学法和Western blot法检测表明HEK-293细胞内及培养上清中存在相对分子质量为20 000的人ES蛋白表达。结论成功构建了重组质粒pEGFP-N1-ES真核表达载体,转染HEK-293细胞后可稳定有效地分泌人ES蛋白。     

脂质体介导色素上皮衍生因子-绿色荧光蛋白质粒转染大鼠视网膜细胞及其转染途径的实验研究

目的观察表达质粒色素上皮衍生因子（PEDF）-绿色荧光蛋白（GFP）以脂质体介导转染入BN大鼠视网膜组织的表达及定位,探索合适的基因治疗给药方法。方法将脂质体包裹的重组表达质粒PEDF—GFP分别经玻璃体注射和视网膜下注射的途径转染至BN大鼠眼内,于一定时间内分别用荧光显微镜观察GFP表达情况,用RT—PCR方法检测PEDF表达情况。结果（1）BN大鼠视网膜下注射脂质体包裹的重组表达质粒PEDF—GFP后1d即可见在荧光显微镜下观察到在注射点周围明显的绿色荧光蛋白分布于视网膜全层包括RPE细胞层,第2、3周荧光强度比第1周增强,荧光范围也有所扩大,可以持续表达4周。RT—PCR结果证实PEDF mRNA表达明显较对照组增强。（2）经玻璃体腔注射脂质体包裹的重组表达质粒PEDF—GFP后第1天BN大鼠的视网膜和RPE细胞亦可见绿色荧光蛋白表达,且分布更均匀,范围更广。第1、2周表达明显增强,到第4周仍有表达。RT—PCR结果也证实PEDF mRNA表达明显较对照组增强。结论阳离子脂质体可以成功介导PEDF—GFP基因转染至BN大鼠的视网膜组织、RPE细胞中,并能够持续表达。视网膜下注射和玻璃体腔注射均为有效的转染途径。本研究为视网膜,脉络膜新生血管性疾病的基因治疗奠定了基础。     

干扰RNA抑制小鼠视网膜HIF-1α蛋白质的表达

目的:探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)特异性小片段干扰性RNA(siRNA)对小鼠视网膜HIF-1α蛋白质的抑制作用.方法:构建HIF-1α siRNA重组质粒pSUPERsiHIF-1α.选择7d龄C57BL/6J小鼠24只,其中6只为正常组(A);另18只建立缺氧诱导的视网膜新生血管模型,并随机分为:对照组(B)、空载体组(C组)和基因治疗组(D组),每组6只.于出舱前1d,向空载体组小鼠玻璃体腔注射pSUPER空载体质粒;基因治疗组注射HIF-1α siRNA重组质粒pSUPERsiHIF-1α.采用FITC-Dextran 荧光造影视网膜铺片观察4组小鼠视网膜血管形态变化;SP免疫组织化学检测各组间HIF-1α的表达差异.结果:荧光造影视网膜铺片显示,A组整个视网膜血管分布呈均匀网状;B、C组视网膜中周部口丁见大片无灌注区,见新生血管丛,伴荧光渗漏;D组无灌注区较B,C组明显减少,周边部毛细血管网基本正常,新生血管丛明显减少.免疫组织化学染色显示,A组HIF-1α蛋白表达刚性;B,C组在神经节细胞层呈阳性表达;D组在神经节细胞层呈弱阳性表达,较B,C组明显减少.结论:采用玻璃体腔注射,通过脂质体介导HIF-1α siRNA重组质粒pSUPERsiHIF-1α 转染视网膜,有效地抑制了缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型视网膜中HIF-1α 蛋白质的农达及视网膜新生血管的形成.     

人TGF-β2特异性siRNA质粒的构建

目的:构建人TGF-β2特异性siRNA质粒。方法:从NCBI中查找人TGF-β2的mRNA序列,并利用生物信息学对序列进行分析;根据siRNA的设计原则,选择最佳的siRNA序列;利用限制性内切酶BamHⅠ和BbsⅠ将相应的双链DNA插入到GPU6/GFP/Neo载体中;重组质粒经限制性内切酶BamHⅠ和PstⅠ单酶切进行鉴定,鉴定正确的质粒进一步通过基因测序的方法进行验证。结果:根据生物信息学选择TGF-β2mRNA的1016～1034区域作为干扰位点;重组质粒酶切结果表明双链DNA序列成功插入到了GPU6/GFP/Neo载体中;测序分析结果进一步证明插入序列与设计完全一致。结论:成功构建了人TGF-β2特异性siRNA干扰质粒,为研究TGF-β2基因功能和利用基因治疗的方法提高青光眼滤过手术成功率奠定了实验基础。     

缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子干扰性RNA抑制鼠视网膜新生血管的研究

目的 探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)小片段干扰性RNA(siRNA)对小鼠视网膜新生血管的抑制作用.方法 本研究采用随机对照方法.构建HIF-1αsiRNA重组质粒.C57BL/6J小鼠玻璃体腔注射增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达质粒pEGFP-N1,1 d后视网膜铺片观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达.选7天龄C57BL/6J小鼠90只,17只为正常组,73只建立氧诱导的视网膜新生血管模型,分为模型对照组、空载体组和基因治疗组(HIF-1α siRNA组、VEGF siRNA组及共转染组).于出氧舱前1 d,向空载体组小鼠玻璃体腔注射空载体质粒;HIF-1α siRNA组注射HIF-1α siRNA,VEGF siRNA组注射VEGF165 siRNA,共转染组注射HIF-1αsiRNA+VEGF165 siRNA.采用荧光造影视网膜铺片方法观察血管形态变化;制作组织切片计算突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数;采用逆转录聚合酶链反应和Western blot检测视网膜HIF-1α和VEGF的表达.采用单因素方差分析和组间最小显著差法进行统计学分析.结果 pEGFP-N1经脂质体LF2000介导转染视网膜细胞后1 d即可见GFP表达.基因治疗组较模型对照组新生血管丛明显减少,荧光渗漏明显减轻,其中共转染组效果最明显.基因治疗组[HIF-1α siRNA组为(27.73±2.33)个,VEGF siRNA组为(15.43±3.23)个,共转染组为(8.70 ±2.88)个]较其他3组突破视网膜内界膜的细胞核数量减少,差异均具有统计学意义(F=3016.527,P＜0.01).视网膜HIF-1α mRNA及蛋白表达水平:模型对照组(1.08±0.06,0.383±0.009)和空载体组(1.09±0.05,0.386 ±0.010)较正常组(0.81 ±0.07,0.035±0.003)上调,而HIF-1α siRNA组(0.46±0.06,0.182±0.008)较模型对照组下调,抑制效率分别为57.4%和52.5%,差异均有统计学意义(F=139.804,2686.001;P＜0.01).VEGF mRNA及蛋白表达水平:模型对照组(1.53 ±0.07,0.340±0.004)和空载体组(1.59±0.06,0.337±0.009)较正常组(0.27±0.08,0,051±0.008)明显上调,而基因治疗组较模型对照组明显下调,差异均有统计学意义(F=421.423,2513.583;P＜0.01),其中共转染组下调最明显,抑制效率分别为85.6%和80.9%.结论 HIF-1α siRNA和VEGF165siRNA均可有效抑制小鼠视网膜新生血管形成,两种siRNA共转染抑制效果最明显.     

糖尿病大鼠玻璃体腔注射缺氧诱导因子-1α siRNA对血管内皮生长因子蛋白表达的影响

目的：观察缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)小干扰RNA(siRNA)对糖尿病大鼠视网膜组织中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达的抑制作用,及其用于糖尿病新生血管性疾病治疗的可行性。

方法：以pSilencer2.1-U6neo为质粒载体,构建HIF-1α.siRNA 重组质粒。选取雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠54只,随机分为正常对照组(15只)和实验组(39只)。实验组采用尾静脉注射链尿佐菌素(STZ)的方法建立糖尿病大鼠模型,造模成功后将实验组随机分为糖尿病组(15只)、基因治疗组(12只)和空载体组(12只)。正常对照组及糖尿病组大鼠均不做转染; 基因治疗组和空载体组分别转染HIF-1α.siRNA 重组质粒和pSilencer空载体质粒。行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE染色)观察视网膜组织形态,并采用免疫组织化学法检测VEGF蛋白的表达。分别于干扰后24、48、72h,1wk时计算VEGF蛋白的抑制效率。采用单因素方差分析和LSD-t检验进行统计学分析。

结果：HIF-1α.siRNA 重组质粒经酶切、测序鉴定,确定为目的序列。HE染色显示：正常对照组大鼠视网膜各层细胞排列整齐,细胞形态基本正常。糖尿病大鼠视网膜各层细胞排列紊乱,内界膜不完整,新生血管芽、新生血管簇呈垂直状突破内界膜生长。免疫组织化学染色显示：VEGF阳性表达为细胞浆出现棕黄色颗粒,主要位于神经节细胞层。正常对照组VEGF蛋白呈弱阳性表达,而DR对照组和空载体组表达明显增强,基因治疗组较DR组和空载体组表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。VEGF蛋白抑制率24、48、72h和1wk时分别为：27.4%、40.6%、47.5%、64.5%。

结论：HIF-1α.siRNA重组质粒能够抑制糖尿病大鼠视网膜中VEGF蛋白的表达,可能成为一种治疗糖尿病性新生血管疾病的新方法。     

LEDGFp52-siRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的: 构建 LEDGFp52 基因 RNA 干扰(RNAi)的真核细胞表达载体。方法: 以 LEDGFp52 为靶基因, 以 pGenSil-l 质粒为载体, 设计构建重组体, 根据 GenBank 数据库提供的LEDGFp52 基因核苷酸序列, 按照 Tuschl 设计原则, 选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列, 克隆到空载体pGenSil-l 中, 转化 DH5α菌株, 提取质粒, 进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。结果: 经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致, 重组载体构建成功,重组质粒转染 HeLa 细胞48h, Western blotting 检测到 LEDGFp52 蛋白表达的改变。结论: 利用 RNAi 技术可成功构建抑制 LEDGFp52 表达的小干扰 RNA 重组体。     

大鼠癌钙调蛋白基因原核表达载体的构建及表达

目的 在原核表达载体中构建癌钙调蛋白（OM）基因,并对构建的原核表达质粒进行表达和鉴定.方法 取SD大鼠6只,提取腹腔巨噬细胞并活化,提取总RNA,设计引物对OM基因进行RT-PCR扩增.通过中间载体pUC57进行目的 基因克隆,将阳性克隆质粒酶切,与原核表达载体pET-22b（＋）连接,转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α,菌检PCR筛选阳性克隆后小量提取质粒,送样行核苷酸序列分析鉴定.成功构建的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组体的表达,并用Western blot鉴定表达产物.结果 琼脂糖凝胶电泳获得目的 基因OM,大小为350 bp左右,与预期的目的 基因大小一致.构建的重组质粒pET-22b（＋）/OM菌检PCR获得长度为500 bp左右的阳性克隆,与预期大小一致.抽提质粒经核苷酸序列分析后表明,克隆的片段与OM基因序列一致.在IPTG的诱导下,重组体表达出分子量约11.7 kD的表达产物,Western blot结果证实其为目的 蛋白.结论 实验成功构建了OM基因原核表达载体及其表达,为该蛋白促进视神经损伤后再生的研究奠定了基础.     

新生大鼠视觉系统发育过程中视网膜及视皮质Nogo-A及其受体NgR表达变化的研究

目的 观察Nogo-A及其受体NgR在新生大鼠视觉系统发育过程中的表达及其作用.方法 实验研究.采用免疫组织化学方法对出生后1 d、3 d、7 d、14 d、28 d、56 d的SD大鼠视网膜及视皮质发育过程中Nogo-A及其受体NgR表达进行检测,并用免疫印迹法检测新生大鼠视皮质Nogo-A及NgR蛋白的表达.对所得数据进行单因素方差分析.结果 Nogo-A及其受体NgR在大鼠出生后整个发育阶段的视网膜及视皮质均可检测到阳性细胞的表达,免疫印迹法结果显示Nogo-A蛋白在1、3、7、14、28及56 d的吸光度比值分别为0.852±0.026、0.917±0.024、0.810±0.028、0.417±0.053、0.258±0.029、0.298±0.054,NgR蛋白的吸光度比值分别为0.070±0.014、0.185±0.035、0.678±0.046、0.705±0.021、1.210±0.057、1.140±0.0420,可见随着大鼠出生后的生长发育,Nogo-A蛋白表达降低(F=376.56,P=0.000),NgR蛋白表达增高(F=888.26,P=0.000).结论 Nogo-A及其受体NgR与中枢神经系统生长、发育密切相关.

Abstract：

Objective To study the expression of Nogo-A and Nogo receptor (NgR) in the development of neonatal rats retinal and visual cortex and their effects on the development of central nervous system (CNS). Methods Immunohistochemical staining method was used to detect the expression of NogoA and NgR in neonatal rats retinal and visual cortex at 1,3, 7, 14, 28, 56 days after birth. One-way Anova was used to analyze the results of Western blot analysis of Nogo-A and NgR in neonatal rats visual cortex.Results Nogo-A and NgR was found to express in neonatal rats retinal and visual cortex at the developing stage. In 1, 3, 7, 14, 28, 56 days, the IDV ratio of Nogo-A was 0.852 ± 0.026、0. 917 ± 0. 024、0. 810 ±0. 028、0. 417 ± 0. 053 、0. 258 ± 0. 029、0.298 ± 0.054 respectively and the IDV ratio of NgR was 0.070±0. 014、0. 185 ± 0. 035、0. 678 ± 0. 046、0. 705 ± 0. 021、1. 210 ± 0. 057、1. 140 ± 0. 0420 respectively by Western blot analysis. The expression of Nogo-A was decreased ( F = 376. 56, P = 0. 000 ) and the expression of NgR was increased ( F = 888.26, P = 0. 000) during postnatal development. Conclusion Nogo-A and NgR is closely related to the CNS growth and development.     

Nogo-66受体mRNA在成年大鼠视神经中的 表达及意义

目的观察Nogo-66受体（NgR）mRNA在成年大鼠视神经的表达并探讨其意义。方法取8只成年大鼠视神经及坐骨神经，将拟杂交的组织切片分为3组：视神经实验组、坐骨神经对照组、视神经阴性对照组。采用原位杂交技术观察NgR mRNA在视神经和坐骨神经中的表达。结果大鼠视神经切片中NgR mRNA均表达阳性，阳性信号沿视神经长轴排列；所有大鼠坐骨神经切片中NgR mRNA的表达均为阴性。结论在成年大鼠视神经中NgR mRNA广泛表达，而坐骨神经中不表达，提示NgR 阳性表达及分布与视神经再生能力低下密切相关。(中华眼底病杂志,2005,21:246-248)     

hTERT启动的双自杀基因CDTK载体的构建

目的:构建hTERT启动子启动的双自杀基因载体CDTK(pc-ChCDTK)。方法:利用PCR扩增CMV增强子、hTERT启动子、yCD及TKgly4种元件,并构建过渡载体T-CMV,T-hTERT,T-yCD,T-TKgly,连至pc-DNA3.1(-)质粒载体上构建成双自杀基因载体pc-DNA3.1-CMV-hTERT-CDTK(pc-ChCDTK);对各个元件、过渡载体及最终载体进行琼脂糖凝胶电泳、酶切和测序鉴定。结果:实验所构建的最终载体的酶切产物琼脂糖凝胶电泳所得片段大小分别为6773bp和288bp,与预期片段一致;测序证实最终载体与pc-ChCDTK序列一致。结论:成功构建了含有hTERT启动子的肿瘤特异性双自杀基因载体pc-ChCDTK。     

癌钙调蛋白／鱼精蛋白截短体融合基因在原核表达载体中的构建及鉴定

目的在原核表达载体中构建癌钙调蛋白（OM）／鱼精蛋白截短体（tp）融合基因，进行基因测序鉴定。方法提取SD大鼠腹腔巨噬细胞，并进行细胞计数，经巨噬细胞特异性抗体CD68鉴定。设计引物扩增OM基因，并在其3’端引入印的编码基因，经PCR扩增获得OM／tp融合基因，通过中间载体PUC57进行目的基因克隆，将阳性克隆质粒酶切，与原核表达载体PET32a连接，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，小量提取质粒，送样经公司测序鉴定。结果琼脂糖凝胶电泳获得OM／tp目的基因，与预期的目的基因大小一致，回收目的基因与中间载体PUC57连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后，菌检PCR获得约500bp的阳性克隆，与预期大小一致。抽提质粒PUC57-OM／tp，经测序鉴定后与预期的序列一致。质粒PUC57-OM／tp酶切后与载体PET32a连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，菌检PCR获得约500bp的阳性克隆，与预期大小一致。抽提质粒PET32a—OM／tp经测序后与预期的序列一致。结论OM／tp融合基因的成功构建，为该融合蛋白促进视神经损伤后再生的研究奠定了基础。     

HTLV-1 Tax 基因真核表达载体的构建及对 RPE 细胞的影响

目的构建人T淋巴细胞白血病病毒-1(human T-cell leukemia virus type1,HTLV-1)Tax基因真核表达载体,在人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞表达Tax蛋白,观察其对细胞的影响。方法应用基因重组技术构建重组载体PIRES2-EGFP-Tax(PT),鉴定后将重组载体转染入RPE细胞,应用RT-PCR、Western-blot和免疫荧光法检测细胞内Tax基因和蛋白的表达;通过MTT和流式细胞仪检测质粒(空白载体、PT和Green-Tax)转染RPE细胞24h和48h后对RPE细胞生长活力及细胞周期的影响。结果经双酶切鉴定和测序分析证实成功地构建了HTLV-1Tax真核表达载体;通过RT-PCR、Western-blot和免疫荧光法检测到转染Tax重组载体的RPE细胞中有Tax基因和蛋白的表达。质粒转染RPE细胞后,细胞生长活力受到抑制,G1期减少而S期增加。但转染Tax质粒和空白载体,对RPE细胞的生长活力和细胞周期产生相似影响。结论成功构建了HTLV-1Tax基因真核表达载体,并在RPE细胞中表达Tax蛋白;Tax质粒对RPE细胞的影响不排除是转染试剂所致。     

蛋白酶体β5亚单位基因真核表达载体的构建

目的:构建蛋白酶体亚单位β5基因真核表达质粒。方法:从人晶状体上皮细胞株SRA01/04中提取总RNA,经RT-PCR扩增获得β5亚单位的全长cDNA片段,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1上。结果:RT-PCR法扩增出约792bp的β5亚单位基因全部编码序列的片段。酶切鉴定和测序分析证实所插入的β5亚单位的基因序列完全正确。结论:成功构建了蛋白酶体β5亚单位基因真核表达重组质粒。