免疫电镜技术在肾活检中的应用

肾活检标本中 ,多数是免疫复合物介导的肾小球肾炎 ,通过免疫病理学方法检测肾小球内的免疫沉积物的性质和分布 ,对于最终的病理诊断至关重要。免疫电镜检查对肾小球炎的病理诊断虽然不是常规方法 ,但为了精确分析沉积于肾小球的抗原抗体复合物 ,免疫电镜仍为行之有效的手段。本文探讨了肾活检标本的低温包埋及常规树脂包埋的胶体金标记的透射电镜方法。材料和方法选取膜性肾病及 Ig A肾病患者肾活检组织标本各 2例 ,经固定 ( 4 %多聚甲醛加 0 .1 %戊二醛混合固定液于 4℃固定 2 h) ,蔗糖冲洗液洗后 ,0 .5 M氯化铵溶液封闭游离醛基 4℃ 30…     

金标β-葡萄糖醛酸酶免疫电镜技术的建立及其在人肝细胞中的表达

我们应用低温包埋 ,胶体金标记 ,免疫电镜技术 ,对人体肝细胞中的β -葡萄糖醛酸酶 ( β -Ｇ)进行超微结构定位研究。1　材料和方法1 1　标本和试剂　取新鲜手术切除的、远离癌瘤3ｃｍ以外的肝组织 ,用手术刀片将肝组织切成1ｍｍ3的小组织数块备用。兔抗人 β -Ｇ多克隆抗体和胶体金系美国阿拉巴马大学何康洁教授赠送 ,其它药品均为Ｓｉｇｍａ公司产品。1 2　固定、脱水、包埋与聚合　将组织块在Ｃａｒｓｏｎ-Ｍｉｌｌｏｉｎｇ固定液中室温下固定 3ｈ ;用 0 0 2ｍｏｌ.Ｌ- 1 的ＰＢＳ缓冲液冲洗 3次 ,每次 1 5ｍｉｎ ;然后 60 %乙醇 1 %…     

锇酸固定组织的包埋后免疫电镜胶体金标记方法的改进

目的建立一种适用于中枢神经系统蛋白质抗原定位的包埋后免疫电镜胶体金标记方法。方法利用还原锇酸固定大鼠脑组织切片,首先在冰冻漂浮切片上用NaIO4确定待检抗原的可修复性,然后在亲水树脂Technovit7100包埋的半薄切片寻找使抗原得以最大程度修复的最佳NaIO4浓度,最后在超薄切片上进行相应抗原的免疫胶体金标记。结果NaIO4对不同抗原的修复作用明显不同。对于可修复抗原,低浓度NaIO4即可以使其充分修复。低浓度NaIO4处理组织可使组织超微结构保持完好,并可使胶体金高密度标记。     

小鼠肾脏发育中凋亡细胞的超微结构变化

1　材料和方法1 1　动物取昆明小鼠 ,雌雄比例 3∶1同窝饲养 ,以雌鼠阴道精栓出现为第 1日计算胎鼠胚龄。部分孕鼠分笼饲养 2 0日后 ,每天早八时观察分娩情况 ,新生仔鼠按生后计算日龄。选取 1 4、1 8日胎鼠各 4只 ,生后 1、7、1 4日龄仔鼠各 4只为观察对象。1 2　光镜和电镜标本制作　在冷操作条件下切开胎鼠和仔鼠腹部 ,取左肾于 2 5 %戊二醛内固定。胎鼠做全肾树脂包埋 ,仔鼠肾脏经肾门做矢状面切开 ,皮质和髓质分别进行树脂包埋。ＬＫＢ Ｖ型超薄切片机半薄连续切片 ,甲苯胺蓝染色 ,按Ｋｏｓｅｋｉ判断光镜下凋亡细胞后制超薄切片 ,…     

正常人粒细胞内铁蛋白的定位观察

本文采用正常人外周血2～4m1,1000～1500r/min离心10分钟,4%戊二醛固定后按常规电镜标本制作。半薄切片定位白细胞,制超薄切片收集于无膜镍网上。超薄切片先经H_2O_2蚀刻,继之用1%卵蛋白处理15分钟,然后切片依次孵育于抗人铁蛋白抗体(一种为兔抗人铁蛋白多克隆抗体,另一种为鼠抗人铁蛋白单克隆抗体)、10nm葡萄球菌A蛋白-胶体金探针(PAG)中,最后经醋酸铀和柠檬酸铅复染,JEM-1200EX透射电镜观察。结果如下:各种血细胞的超微结构均清晰可见,两种抗体在白细胞内的反应显著不同。经心脏铁蛋白单克隆抗体染色后,发现阳性胶体金颗粒只存在于嗜酸性粒细胞内的颗粒上,细     

大鼠海马神经细胞花生凝集素和ConA受体细胞化学技术

本实验应用 PNAg和 ConAg细胞化学技术 ,对大鼠海马神经细胞膜上的相应受体进行凝集素细胞化学反应。材料与方法 :雄性 SD大鼠 4只 ,体重2 5 0～ 30 0 g。动物经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后 ,进行心脏灌注固定 (固定液为 4%多聚甲醛 0 .1 M PB( p H7.3)。动物静置于 4℃ ,3hr后取出大脑 ,用上述固定液后固定 3hr。取具有海马的脑组织 ,用梯度酒精脱水、透明、石蜡包埋、切片。PNAg和 Con Ag的制备 :1 )枸橼酸还原法配制 7nm胶体金 ;2 )胶体金分别与 PNA和 Con A稀释液按一定比例结合 ;3)超速离心 ,4℃ ,36 0 0 0 /rpm45分钟 ;4)收…     

庆大霉素在肾近端小管吸收途径的形态学证据

利用活体肾小管显微穿刺技术 ,将 3H-庆大霉素注入近端小管腔内 ,间隔 5分钟、2 0分钟后 ,用 1%戊二醛分别固定各自的肾小管 ,摘除肾脏 ,将含有显微穿刺的肾小管取出 ,1%锇酸后固定 1小时 ,逐级酒精脱水 ,Epon812包埋 ,半薄、超薄切片 ,铀铅双重染色。光镜放射自显影切片 ,浸入 L M- 1乳胶 7～ 8秒钟 ,置 4℃冰箱中 1～ 2周 ,显影、定影、甲苯胺兰染色 ,显微镜观察并摄影。电镜放射自显影超薄切片 ,碳喷镀后 ,利用金属套环法将 Ilfore- L4核乳胶涂片 ,放置 4℃冰箱中 2～ 3个月 ,显影、定影。JEM- 12 0 0型电子显微镜观察。结果 :光镜放…     

培养细胞的免疫细胞化学操作体会

对培养的细胞进行免疫细胞化学反应 ,可以在培养皿内直接进行 ,亦可经树脂包埋后 ,在半薄切片上进行。本实验应用上述二种方法 ,对培养的大鼠内耳血管纹的组织细胞进行了免疫细胞化学显示。组织细胞处理 :1 )平皿培养和盖玻片上培养的大鼠内耳血管纹处组织细胞 ,经Bouin固定液固定 4h,0 .0 1 Mol/L PBS浸洗 ,0 .1 %的 Triton x- 1 0 0处理 2 0 min;2 )平皿培养的细胞经酶处理 ,离心收集 ,2 %戊二醛固定液固定 4h,经丙酮脱水与锇酸固定( - 2 0℃ )、树脂包埋、半薄切片。免疫细胞化学反应 :上述处理的细胞或切片进行免疫细胞化学反应 ,其…     

骨骼肌m-ATPase染色改良法

我们在实验中发现 ,用常规的钙钴法很少能保存骨骼肌中 ATP酶的活性 ,且 ATP酶对固定非常敏度 ;而使用未固定的材料骨骼肌中常出现人工假象。固定液的张力很重要 ,而蔗糖是把张力提高到足够水平的最适当添加物。我们将原 ATP酶钙钴法作了如下改进 :1.固定 :将新鲜骨骼肌组织用双面刀片切成约 1 mm厚的薄片 ,入固定液中固定1 0 min,4℃。固定液配制 :多聚甲醛 4g;二甲砷酸钠 3.0 8g;氯化钙 0 .75 g;蔗糖 1 1 .5 g;双蒸水加至 1 0 0 ml,调节 p H值为 7.2。2 .OCT包埋 ,- 2 0℃恒冷箱切片( 8μm) ,室温下自然干燥 30 min。3.切片预处理 1…     

淋巴瘤的原位杂交和免疫组化双标记技术

将原位杂交与免疫组化在同一切片上进行显示 ,利于从基因水平和蛋白质水平两方面来分析同一细胞。作者利用ＥＢＥＲ 1探针和多种淋巴瘤抗体进行双标记 ,取得满意效果。1　材料与方法1.1　标本来源　 1997年以来 ,临床病理检查的淋巴瘤活检蜡块 ,经常规固定 ,包埋 ,制片。1.2　试剂　 (1)免疫组化 :为Ｓ Ｐ试剂盒 (抗鼠ＤＡＢ显色试剂盒ＬａｂＶｉｓｉｏｎ ,ＵＳＡ)抗体为ＣＤ3、ＣＤ45、ＣＤ2 0、ｂｃ1 2。(2 )原位杂交 :采用异硫氰酸荧光素 (ＦＩＴＣ)标记的ＥＢＥＲ 1探针 (ＤａｋｏＹ5 2 0 0 )及原位杂交试剂盒 (ＤａｋｏＹ5 2 0 1)。1.3…     

一种心肌细胞内钙调素定位定量的测定方法

钙调素(Calmodulin CaM)是一种分子量小、结构简单、分布广泛并具有多种功能的Ca~2调节蛋白.了解CaM在组织中的分布特征对于探讨CaM的功能具有重要意义.但仅仅利用免疫胶体金标记技术,从二维图像上金颗粒的分布来推测CaM的定量分布特征、结果是不准确的.我们在对人右心室肌细胞GaM定位定量测定中,采用了一种将兔疫胶体金标记技术与细胞形态立体定量学相结合的方法.我们认为该方法结果可靠,能较好地反映细胞内CaM的相对含量.有较好的实用性,现介绍如下:1 材料与方法1.1 材料 先天性心脏病室间隔缺损患者4例.男2例,女2例.年龄6～8岁,平均7.15岁.术前心电图均属正常范围,X线胸片心胸比为0.48±0.02.手术证实缺损均为嵴下型,缺损直径均≤5mm.心脏手术中自右心室切口处取2mm~3心肌组织若干块,经3%戊二醛予固定.1%四氧化锇后固定,梯度脱水,Enpon 812包埋,每个病例取5个包埋块,各切2张超薄切片并分别覆于铜网和不锈钢网上.     

四环素荧光标记不脱钙骨甲酯包埋法

四环素荧光标记是评估骨重塑速率的一种方法 ,需做不脱钙骨切片。甲酯包埋法是常用的不脱钙骨包埋法 ,作者曾对此进行探讨 ,现报道如下。1　材料和方法1.1　四环素荧光标记　标本来自犬股骨头内松质骨 ,于第1、4周及 7周全周 7天饲给四环素粉剂 ,每天 2 5ｍｇ/ｋｇ。第9周末取材 ,75 %乙醇固定 3天～ 1年。组织块大小 0 5～1 0ｃｍ ,厚 0 3～ 0 5ｃｍ。1.2　试剂　 (1)甲基丙烯酸甲酯单体 ,(2 )聚甲基丙烯酸甲酯粉末 ,(3)甲基丙烯酸正丁酯单体 ,(4 )洗涤剂 :5 %氢氧化钠 ,(5 )引发剂 :过氧化苯甲酰 ,(6 )吸水剂 :氯化钙 ,无水硫酸钠或无…     

胶体金技术及其发展和应用

本文主要介绍了胶体金技术的基本应用及其发展,包括应用胶体金在同一组织切片上进行免疫组化定位、银加强胶体金标记法、使用生物素化探针进行原位杂交后用胶体金技术检测(包括振动切片的包埋前法及超薄切片杂交法)以及胶体金双标记法。这些方法都是在最初的胶体金技术的基础上发展起来的,既继承了优点,又进一步进行了改良,使之广泛应用于各种理论及临床研究课题上。本文同时还简介了应用这些新技术在各个领域中的研究成果。     

大白鼠脚内核至外侧缰核投射的突触特点——WGA-HRP顺行标记法电镜研究

选大白鼠六只,戊巴比妥钠麻醉后,于定向仪上,通过微玻管将2～5％WGA-HRP的Tris溶液(pH8.2)微电泳入脚内核。电流强度为3μA,持续通电6～10min。术后存活两天,用含1％多聚甲醛和1.25％戊二醛的磷酸缓冲液灌注取材。取脑后于2％戊二醛磷酸缓冲液中后固定4h(4℃),置5％蔗糖磷酸缓冲液中,冰箱(4℃)内过夜。震动切片机切片(厚100μm),TMB成色反应。在电泳同侧的外侧缰核内,可见密集的、肉眼可见的灰蓝色标记区,光镜下证明是标记终末。于解剖镜下取下顺行标记密集区,经锇酸后固定1h后,脱水包埋,LKB—Ⅰ型超薄切片机切片,用国产DXA 4—10     

HE染色在环氧树脂半薄切片中的应用

目前 ,对Ｅｐｏｎ812包埋的半薄切片进行光镜观察 ,其染色多数采用盐基性染料如美蓝、甲苯胺蓝、结晶紫、硫堇和碱性品红等无需脱脂的单色染色法。虽然方法简单、时间短 ,但效果很差 ,细胞核、细胞质、细胞膜与细胞间质的区别不明显 ,有时结构不清、难以定位 ,而且染色后的切片易褪色 ,不易做长期保存。笔者应用ＨＥ染色法 ,染色效果比较理想 ,特别对临床肾活检超微病理诊断定位有重要意义。现将方法和体会介绍如下。1　染色方法1.1　常规环氧树脂Ｅｐｏｎ812包埋 　组织经 3%戊二醛前固定 2ｈ ,1%锇酸后固定 1 5ｈ ,梯度乙醇 (5 0 %、70 %…     

表面活性剂在免疫组化中的应用

组织经福尔马林固定 ,大量抗原决定簇被封闭 ,为了获得满意的结果 ,常用的方法是对组织切片进行抗原修复。而表面活性剂Tween 2 0和TritonX 10 0的合理应用 ,则可以提高免疫组化染色的阳性率以及背景的清晰度。1　材料与方法1.1　标本　收集本院手术切除的淋巴瘤、乳腺癌、肠癌等标本 10例 ,所有组织均用 10 %福尔马林液固定 ,常规石蜡包埋 ,3μm厚连续切片 ,每个指标切 6张。1.2　试剂　ER、PR、CD4 5、CD2 0、CD4 5RO、Syn、nm2 3、Ki 6 7、TopⅡ、p5 3、PCNA等抗体和S P试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司 ,Tween 2 0购自…     

全自动密闭式组织脱水机的使用改进

全自动密闭式组织脱水机以其卓越的性能和良好的处理效果 ,特别是安全、高效 ,将逐渐被各级医院病理科广泛使用。我科自 1997年使用全自动密闭式组织脱水机以来 ,标本的处理效果明显改观 ,切片质量显著提高。一、材料与方法1.仪器和设备∶(1)进口全自动密闭式组织脱水机 ,附不锈钢脱水篮 2只 ,分别可容 15 0个包埋盒。 (2 )塑料包埋盒。2 .试剂∶(1)ＡＡＦ固定液 :70 %乙醇 85ｍｌ,冰乙酸 5ｍｌ,4 %甲醛液 10ｍｌ。 (2 ) 95 %乙醇 ,(3)无水乙醇 ,(4)硬脂酸 ,(5 ) 5 8～ 6 0℃熔点石蜡。3.处理过程∶新鲜组织取材后 ,放入写有检验号码的塑料…     

应用端粒酶原位杂交技术检测大肠癌端粒酶活性

笔者利用国产端粒酶原位杂交检测试剂盒在大肠癌组织的石蜡切片中检测端粒酶活性 ,获得满意结果。现将应用该方法的体会简要介绍如下。1　材料与方法1.1　观察对象　手术切除的新鲜大肠癌组织 2 0例 ,对离体组织立即液氮冷冻 ,- 80℃冰箱保存。标本分为 2份 ,1份在做 5 μｍ厚连续冷冻切片 ;另 1份经 10 %中性福尔马林或4 %多聚甲醛固定 ,石蜡包埋 ,做 5 μｍ厚石蜡切片。1.2　试剂　 (1)端粒酶原位杂交检测试剂盒为武汉博士德公司产品 ,购自天津ＴＢＤ公司 ,编号ＭＫ115 9。端粒酶逆转录成分 (ＴＥＲＴ )来源于人基因ＴＥＲＴ ＮＭ 0 0 32 …     

内窥镜活检组织包埋方法的改良

内窥镜目前在我国各级医院较为普及 ,作内窥镜检查的人也不断增加 ,我院每年作病检的内窥镜的例次占全年总病检例次的 2 6 9%～ 32 5 % ,最多者为胃镜 ,由于取材方法及部位较固定的特点 ,我们对传统包埋方法进行了改良 ,使用镶嵌法及一片法包埋和切片 ,使用 8年多以来 ,效果较好 ,现介绍如下。1　材料与方法1.1　材料　纤维内窥镜取材为芝麻大小至米粒大小的活检组织。熔点为 5 6℃～ 5 8℃的生物切片石蜡。1.2　方法1.2 .1　包埋前先将融化的石蜡液倒入包埋框 ,然后以 0 5ｃｍ的间距 ,插入较薄的金属片 ,待石蜡冷却凝固后 ,即成为可使用…     

肿瘤侵袭诱导基因蛋白在正常及癌组织中的表达及意义

一、材料与方法1.组织标本 :2例男性 (2 8岁和 48岁 ,均为创伤死亡 )尸检组织切片 (肝、肾、肺、胃、胰、心肌等 ) ,由第三军医大学新桥医院病理科提供 ;5 6例肿瘤组织 (男性 39例 ,女性 17例 ,患者年龄 19～ 78岁 ) ,随机取自本院 1997年 1～ 12月病理科活检材料 ,其中包括胃癌 2 2例 ,食管癌 10例 ,乳腺癌 9例 ,肝癌、肺癌及甲状腺癌各 3例 ,肾癌、胆囊癌各 2例 ,子宫内膜腺癌和膀胱移行细胞癌各 1例。所有标本均经 10 %甲醛溶液固定 ,石蜡包埋 ,切片厚 5 μｍ。2 .肿瘤侵袭诱导基因 (Ｔｉａｍ 1)单克隆抗体的制备[1] :用反转录ＰＣＲ扩增…