基于秀丽隐杆线虫的中医药抗衰老研究

衰老以及与衰老相关的疾病是当今社会日趋严重的医学问题和社会问题。秀丽隐杆线虫是一种很好的衰老模式生物,具有寿命短、世代周期短、易于培养与观察等特点。中医药抗衰老有明确疗效,多种中药提取物及中药复方可基于秀丽隐杆线虫模型,调控衰老基因、调节氧化应激水平、抑制Aβ1-42沉积等方面抗衰老及治疗衰老相关疾病。     

桑葚多糖T3-3分离及秀丽隐杆线虫抗衰老活性研究

[目的]研究桑葚多糖T2提取工艺优化,并对其抗衰老活性进行分析。[方法]以秀丽隐杆线虫为模型,用寿命、移动力分析、吞咽频率、产卵量和肠脂褐质综合评价不同剂量范围的桑葚多糖(T3-3)抗衰老活性。通过正交和优化实验确定最优提取工艺条件为:提取温度100℃,提取时间2 h,提取次数3次,料液比1∶30,提取率最高达8.48%。[结果]抗衰老活性研究表明,150 mg/L的T3-3能增强秀丽隐杆线虫的抗衰老能力。[结论]该提取工艺1)延长了秀丽隐杆线虫的寿命,秀丽隐杆线虫平均寿命延长了10.38%(P0.05),最大寿命延长了28.57%(P0.05),50%存活率对应天数延长了0.91%。2)秀丽隐杆线虫吞咽频率增加,吞咽频率比对照组高18.78%。3)产卵量无统计学差异。4)减少秀丽隐杆线虫肠脂褐质的产生量,比对照组平均荧光强度低11.14%(P0.05),实验末期,对照组的平均荧光强度增大了12.47%。     

秀丽隐杆线虫模型在中药活性筛选中的方法学考察

目的 基于秀丽隐杆线虫生物模型,建立快速筛选中药活性的方法.方法 选用亨廷顿舞蹈症疾病模型AM141线虫株作为模型,以骆驼蓬多糖和小檗碱为代表药物,分别在固体及液体培养基中加入中药提取物或单体小分子化合物,以中药提取物溶解度、培养基有无污染、线虫polyQ荧光点数目、线虫形态及生长状态作为考察指标.结果 小檗碱20μM和骆驼蓬多糖10 mg/mL可显著抑制AM141线虫的polyQ聚集症状.液体培养基中的线虫易污染,长势不一,且中药提取物溶解性不好影响观察,所以筛选中药提取物时应使用固体培养基.结论 秀丽隐杆线虫模型用于药物筛选,快捷、方便、简单.     

miRNA对秀丽隐杆线虫寿命的影响

miRNA具有调控基因表达的作用,目前关于miRNA的发育和作用机制已经有了相对深入的研究。近些年来miRNA对寿命的影响正逐渐被人们所重视,对其作用靶点的进一步研究有利于治疗衰老相关疾病。     

秀丽隐杆线虫在中药抗衰老研究中的应用

中药作为一种毒副作用少的天然物质,在抗衰老研究领域有巨大的潜力。本文就近年来以秀丽隐杆线虫为动物模型,探索中药通过对多种信号通路及衰老相关基因的调控发挥抗衰老作用的研究进行综述,为深入探索中药延缓衰老的生物活性和分子机制提供理论依据和试验参考。     

紫杉醇暴露对秀丽隐杆线虫毒性效应的研究

目的:为了解紫杉醇的神经毒性机制,以秀丽隐杆线虫为模型进行运动能力和细胞凋亡的研究.方法:配制紫杉醇系列浓度(0.4、4、40、400 mg/L)为试验组溶液,以K-medium溶液为空白对照组(0 mg/L);秀丽隐杆线虫暴露于试验组和对照组溶液中,检测线虫运动行为及细胞凋亡水平的改变.结果:急性暴露后,与溶液对照组...     

秀丽隐杆线虫在生殖毒理学研究中的应用进展

秀丽隐杆线虫是模式生物中比较常见的一种,具有简单的生殖发育系统.与传统实验动物相比,后代数目多、身体透明,在光学显微镜下清晰可见其体内的生殖器官,并能够在整体水平下观测化学物质暴露后对生殖器官造成的损伤.因此,其具有研究生殖毒性的优越性,被广泛应用到生殖毒理学研究中.本文作者对多年来国内外应用秀丽隐杆线虫进行生殖毒理学...     

秀丽隐杆线虫嗅觉适应性的分子细胞生物学机制

嗅觉适应是动物的一项重要生理功能,可以保护自身细胞免受过度刺激,进而更好地应对周围环境变化。目前发现秀丽隐杆线虫嗅觉适应性主要与嗅觉神经元胞内信号分子和感受蛋白有关,如AWC神经元区域特异性环鸟苷酸（cGMP）反应、瞬时受体电位香草酸亚型（TRPV）离子通道蛋白OSM-9、细胞质基质抑制蛋白ARR-1和G蛋白信号通路中的甘油二酯（DAG）通路等均可以调控嗅觉适应,而神经环路方面的嗅觉适应性研究甚少。本文总结回顾了线虫嗅觉适应有关的分子细胞生物学机制,以期为高等生物嗅觉的研究提供参考。     

三卤甲烷对秀丽隐杆线虫生殖细胞及子代数的影响

目的 探讨3种三卤甲烷类饮用水消毒副产物对秀丽隐杆线虫生殖细胞发育与繁殖能力的影响。方法 以3种三卤甲烷(三溴甲烷、三氯甲烷、三碘甲烷)为研究对象,在秀丽隐杆线虫模型中检测不同浓度三卤甲烷暴露后生殖腺细胞凋亡和卵母细胞数,及最终产生的子代数目。结果 生殖腺细胞凋亡结果显示,50μmol/L处理组中三氯甲烷和三碘甲烷的暴露造成线虫生殖腺凋亡水平升高,且存在一定剂量依赖效应。卵母细胞数结果显示,在50μmol/L浓度暴露下,3种THMs的暴露均显著降低了线虫体内的卵母细胞数。子代数结果显示,仅有50μmol/L处理组的三碘甲烷暴露会显著降低线虫的子代数。结论 THMs会造成秀丽隐杆线虫的生殖毒性,且毒性与其携带的卤族元素有关。     

rsa基因通过mbk-2调控秀丽隐杆线虫胚胎发育

目的使用秀丽隐杆线虫作为模式生物,观察rsa基因对mbk-2突变型线虫胚胎发育和虫卵孵化的影响,初步探讨mbk-2的在胚胎发育中的作用及机制。 方法以RNAi技术定向干扰mbk-2突变型线虫rsa基因的表达,并对rsa沉默后线虫的虫卵孵化水平及胚胎发育情况进行分析,检测其在线虫生长发育、生殖能力等方面的变化。 结果与L4440喂养的mbk-2基因突变组相比,rsa-1和rsa-2RNAi细菌处理mbk-2基因突变组虫卵未孵化率显著升高,达到41.8%和49.2%（P＜0.05）,且rsa-2处理组显著高于rsa-1组（P＜0.05）;rsa-1和rsa-2 RNAi细菌处理的N2野生型线虫虫卵未孵化率分别为3.9%和5.7%,显著低于rsa-1和rsa-2 RNAi细菌处理的mbk-2突变型线虫（P＜0.05）。 rsa-2 RNAi处理mbk-2突变型线虫组,线虫胚胎发育异常显著增加。 结论mbk-2是线虫发育的一个重要因子,rsa是mbk-2的重要修饰基因,两者相互作用调节线虫的胚胎发育和虫卵孵化。     

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的原核表达、纯化及酶活检测

目的：以人类多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶2（ppGalNAc-12）为研究对象，利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌（E．Coli）BL21中原核表达其编码序列，并对表达产物进行纯化、复性及酶活检测。方法：首先利用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列，将其亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-3，形成重组表达质粒pGEX-5X-3／T2。重组质粒转化大肠杆菌DH5α，测序鉴定后转化BL21，异丙基硫代半乳糖（IPTG）诱导后，表达产物为主要以包涵体形式存在的融合蛋白。对其复性后用谷胱甘肽-琼脂糖（Glutathione-Sepharose）4B亲和层析柱进行纯化。然后根据ppGalNAc-T2的催化功能，设计底物，建立酶促反应体系，利用高效液相色谱（HPLC）进行酶活分析。结果：成功构建了原核表达重组载体pGEX-5X-3／T2，通过蛋白质电泳检测到分子量约为90 kD的融合蛋白的表达，利用亲和层析得到纯化的酶蛋白，并经Western印迹得以验证。反应后体系上柱洗脱后出现酶促反应的产物洗脱峰。结论：成功构建了重组表达载体pGEX-5X-3／T2，ppGalNAc-T2伞长编码序列被成功表达、纯化及复性，检测到具有酶活性。     

新型重组纤维蛋白原受体拮抗剂的表达、纯化及活性研究

目的:构建两个预期能够成为纤维蛋白原受体拮抗剂的重组融合蛋白。方法:人工合成北美水蛭素Decorsin的基因序列,利用基因工程的方法构建两个重组蛋白,分别是AnnV D39:AnnexinV加上Decorsin全序列和AnnV- D2 7:AnnexinV加上Decorsin的羧基端2 7个氨基酸序列。在AnnV D39的AnnexinV和Decorsin序列之间加入了由10个氨基酸组成的连接肽GGGGSGGGGS。利用质粒pET -2 8(a +)作为载体,将上述融合蛋白在大肠杆菌E coliBL2 1(DE3)中以包涵体的形式进行高效表达,纯化后,进行抗血小板聚集活性测试。结果:基因表达的产物在变性条件下用DEAE -Cellulose5 2和SepharoseCL -4B层析纯化。随后进行的血小板聚集分析表明,An nV D39具有良好的抗血小板凝集活性,而AnnV D2 7没有显示相似活性。结论:AnnV- D39作为一种新的纤维蛋白原受体抑制剂显示了良好的活性,而Annv- D2 7需要进行进一步的修饰。     

重组人血管抑素的纯化和生物活性鉴定

目的：纯化大肠杆菌表达的重组人血管抑素（ｒｈＡＧＮ）并鉴定其抗血管生成生物活性。方法：通过超声破碎、包涵体洗涤、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００ 凝胶过滤层析等步骤初步纯化ｒｈＡＧＮ,Ｌｏｗｒｙ法测定蛋白浓度,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析观察其纯度;应用 ＭＴＴ法观察在终浓度为 ０．１～３．０ ｍｇ／Ｌ范围内 ｒｈＡＧＮ对 １０ μｇ／Ｌ ＥＧＦ刺激的人真皮微血管内皮细胞系ＨＤＭＥＣ的增殖抑制活性;以ＰＢＳ为对照（ｎ＝５）,应用原位鸡胚绒毛尿囊膜（ＣＡＭ）技术观察１００ μｇ／只（ｎ＝５）和２００ μｇ／只（ｎ＝５）ｒｈＡＧＮ作用７２ ｈ对３０ｎｇ ｂＦＧＦ 诱导的鸡胚ＣＡＭ毛细血管生成的抑制作用。结果：①ｒｈＡＧＮ电泳纯度达到 ９６％,总回收率为 ６１．７％;②ｒｈＡＧＮ对 ＨＤＭＥＣ细胞增殖的最大抑制剂量约为 ２．０ ｍｇ／Ｌ,抑制率约９２．３％．半数最大抑制剂量在１．０ ｍｇ／Ｌ附近;③１００ μｇ／只和２００ μｇ／只ｒｈＡＧＮ组鸡胚ＣＡＭ 载样滤纸片下毛细血管数目分别为７９±２３条和３７±１１条,两组间比较差异显著（Ｐ＜０．０５）;与对照组（１４５±３６条）相比,均有显著性差异（Ｐ＜０．０１）。结论：ｒｈＡＧＮ达到了较高的电泳纯度,     

酶法和Jaffe速率法测定血清肌酐的结果比较

目的:了解酶法和Jaffe速率法测定血清肌酐结果的定量关系.方法:按各自方法将测得结果进行相关回归分析.结果:酶法和Jaffe速率法测定血清肌酐的回归方程式为Y=0.7X 46.8(Y为Jaffe速率法,X为酶法 ),相关系数r=0.9976.结论:Jaffe速率法和酶法结果不同,两者之间存在恒定偏倚.     

SEL1L蛋白、Smad4蛋白在食管癌中的表达及其意义

目的 观察SEL1L蛋白、Smad4蛋白在食管癌组织中的表达及其意义。方法 应用免疫组化S—P法检测90例食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell cancer，ESCC）、35例正常食管黏膜（normal esophageal mucosa，NEM）及20例食管不典型增生（esophageal dysplasia，ED）中SELlL蛋白、Smad4蛋白的表达。结果SEL1L蛋白在ESCC、ED的表达阳性率较NEM高（P〈0．01）；Smad4蛋白在ESCC的表达阳性率较NEM和ED低（P〈0、01）；ESCC中SEL1L蛋白和Smad4蛋白的表达呈明显负相关。结论 SEL1L蛋白过表达和Smad4蛋白低表达可能在食管癌发生发展中具有协同作用；联合检测食管癌中SEL1L蛋白和Smad4蛋白的表达，对于评估食管癌的发生、发展具有重要意义。     

抗鼠CTLA-4单链抗体的构建与表达及其免疫学活性的鉴定

目的 构建具有免疫学活性的抗小鼠细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)单链抗体ScFv (single chain fragment of variety region),为进一步将其应用到动物体内奠定基础.方法 采用RT-PCR技术,从分泌抗小鼠CTLA-4 单克隆抗体(mAb) 的杂交瘤细胞中扩增mAb 的VH、VL 基因,并进一步将其组装成VH-Linker-VL 型的ScFv 片段.将ScFv 片段亚克隆至pGMET 载体,测序正确后将其克隆至真核分泌型表达载体pSect2-GFP,将pSect2-GFP-ScFv 纯化质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)并进行表达,同时经Zeocin筛选稳定表达株.用Western blot方法检测ScFv 融合蛋白的表达,采用ELISA检测 ScFv 的亲和活性.结果 经Zeocin 筛选2周后,CHO细胞株可稳定表达GFP-ScFv 蛋白.Western blot法证实GFP-ScFv 蛋白在细胞上清和细胞裂解液中均有表达,大小约55 kD.ELISA检测表明,CHO 培养上清中的GFP-ScFv 蛋白经浓缩初纯后能与重组小鼠CTLA-4 纯化抗原结合,并具有抑制亲本单抗与其结合的能力.结论 成功构建了抗小鼠CTLA-4 的ScFv 真核表达载体,并能有效表达出具有免疫学活性的ScFv 融合蛋白.     

凋亡素融合蛋白在HeLa细胞中的转导及体外活性分析

研究胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）的肝素结合域（HBD）在HeLa细胞中的转导活性,并证实HBD具有运载药物蛋白（凋亡素 ）进入细胞并诱导肿瘤细胞凋亡的能力。通过克隆表达的HBD-EGFP融合蛋白经Ni2+-NTA纯化后,观察其转导活性;并利用HBD-凋 亡素融合蛋白表达纯化后,用噻唑蓝( MTT法)检测肿瘤细胞的凋亡。结果表明：用荧光显微镜可观察到HeLa细胞内有绿色荧光;MTT 法检测表明凋亡素融合蛋白能诱导HeLa细胞的凋亡;HBD具有转导活性,能携带药物蛋白（凋亡素）进入细胞并能诱导HeLa细胞的凋 亡。     

4-取代氨基甲酰胺基-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素衍生物的合成及其抗肿瘤活性

根据鬼臼毒素类化合物C_4位氮取代衍生物构效原理,设计并合成了11个4-取代氨基或烃氧甲酰胺基表鬼臼毒素类似物。从鬼臼毒素出发,经溴代、水解、叠氮化、还原以及酰化等六步反应合成标题化合物。体外抗肿瘤活性试验表明这类化合物具有较为显著的生物活性,多数化合物对L1210白血病肿瘤细胞与KB细胞生长抑制活性超过临床用药依托泊甙。     

p53基因的原核表达与活性测定

目的 原核表达P53重组蛋白,检测P53蛋白对人类白血病细胞系K562增生的影响.方法 运用PCR技术鉴定了pET-p53重组质粒导人BL21菌株中p53基因的存在,并在IPTG的诱导下,大量产生外源基因产物.通过Ni-NAT亲和层析柱纯化分离P53蛋白,SDS-PAGE确定该蛋白准确性.以不同浓度的P53重组蛋白诱导K562细胞后,用MTT比色法、集落形成法、流式细胞术(FCM)测定P53蛋白对靶细胞增生的影响.结果 成功地构建了含人野生型p53基因的原核表达载体,纯化了P53重组蛋白.活性测定结果表明,随着P53重组蛋白浓度的增加,K562细胞存活率显著降低,并发现该蛋白能促进肿瘤细胞凋亡,且呈现明显的剂量依赖性,经相关分析,细胞抑制率与P53蛋白浓度呈正相关(r=0.8981),其半数抑制浓度(IC50)为6.74μg/ml.结论 P53重组蛋白具有促进K562细胞凋亡的作用.     

检测补体C3、C4及C1q水平对狼疮性肾炎活动性判定的价值

目的：检测活动期和非活动期狼疮性肾炎（LN）患者血清补体C3、C4及C1q水平,探讨其对LN活动性判定的价值.方法：用免疫比浊法分别对经临床确诊的82例活动期和79例非活动期LN患者血清补体C3、C4及C1q的水平进行检测,比较两组患者C3、C4及C1q的水平及阳性检出率.结果：两组患者血清补体C3和C4的阳性检出率差异无统计学意义（P＞0.05）,LN活动组C1q的阳性检出率（92.6％）高于LN非活动组（70.8％）,差异有统计学意义（P＜0.05）;LN活动组补体C3、C4、C1q水平均较LN非活动组下降（P＜0.05）.结论：LN活动期患者C1q阳性率较LN非活动期患者高,而C3、C4、C1q水平较LN非活动期患者均降低,动态监测C3、C4、C1q的水平及检测C1q阳性情况对判断LN是否处于活动期有重要意义.