慢病毒介导的双自杀基因对乳腺癌细胞的杀伤作用

目的 探讨慢病毒介导的CDglyTK融合基因体系对人乳腺癌细胞株（MCF-7）的杀伤作用。方法 构建的重组质粒pLenti6／V5-D-CDglyTK及阳性对照质粒pLenti6／V5-D-GFP在lipofectamine2000介导下转染293FT细胞,包装、扩增后获得病毒颗粒,体外感染MCF-7细胞株,荧光显微镜下观察阳性对照质粒的感染效率并以RT-PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予前药5-FC,GCV及5-FC＋GCW处理,观察该体系对细胞株的杀伤效应。结果 重组体对细胞株的感染率随慢病毒滴度的增高而递增。RT-PCR方法检测发现MCF-7有目的基因CDglyTK的表达。双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效（P〈0．001）。结论 慢病毒为载体有较高的转染效率,MCF-7细胞对前药的具有较高的敏感性,双自杀基因疗效优于任一单自杀基因。     

慢病毒介导的双自杀基因对胃癌细胞的杀伤作用

目的探讨慢病毒介导胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对胃癌细胞SGC-7901的杀伤作用。方法用重组慢病毒FGW-KDRP-CD/TK体外感染胃癌SGC-7901细胞,荧光显微镜观察其感染效率,Giemsa染色法观察转基因的胃癌细胞形态学变化;用流式细胞术观察细胞周期的变化。RT-PCR法检测受感染细胞CD/TK基因的表达。然后加用前药更昔洛韦(GCV)和/或5-氟胞嘧啶(5-FC)用MTT法检测该体系对胃癌细胞的杀伤作用。结果慢病毒的感染率随病毒滴度的增高而递增。Giemsa染色法显示慢病毒载体对体外培养的胃癌细胞形态无明显影响。流式细胞仪检测慢病毒感染胃癌细胞前后,处于G0-G1,G2-M,S期的细胞百分比差异无统计学意义(P>0.05)。经RT-PCR检测发现转基因细胞有目的基因的表达。MTT法检测显示前药GCV和5-FC在一定浓度搭配范围内呈剂量依赖性地抑制SGC-7901细胞增殖,未转染慢病毒的细胞对前药不敏感;联合两种前药对SGC-7901的疗效优于任一单用前药(P<0.05)。联合用药[(0.1+40)、(1+80)、(10+160)、(100+320)]mg/L具有协同作...     

慢病毒介导的双自杀基因对T淋巴细胞杀伤作用的实验研究

目的:探讨慢病毒介导的双自杀基因对T淋巴细胞的杀伤作用。方法:在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMVΔ8.2、包膜基因pCMV.VSVG、目的基因pHR'CS.GFP或pHR'CS.CDglytk导入病毒包装细胞293T,包装成病毒后,收集病毒上清,浓缩后转染T淋巴细胞,荧光显微镜及RT-PCR检测基因的整合及表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或无环鸟苷(GCV)后,MTT法测定细胞的存活率,流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果:慢病毒的3种质粒可高效转染入293T细胞。对照组荧光显微镜下观察可见大量的绿色荧光,透射电镜下观察可见许多病毒颗粒。慢病毒介导的双自杀基因在T淋巴细胞中高效、稳定表达,单独使用GCV或5-FC对T细胞/CD+tk的存活率与未转染T细胞比较明显降低(P<0.01),与单独使用5-FC或GCV比较,联合使用5-FC和GCV时T细胞的存活率明显降低(P<0.01)。结论:慢病毒介导的双自杀基因可高效稳定转染T淋巴细胞,双自杀基因系统较单一自杀基因系统(CD/5-FC或HSV-tk/GCV)对T淋巴细胞的杀伤具有明显增强作用。     

慢病毒介导的双自杀基因对大肠肿瘤细胞的靶向杀伤作用

目的 研究慢病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK双自杀基因系统对大肠肿瘤细胞选择性杀伤作用.方法 构建的重组FGW-KDRP-CD/TK慢病毒载体在293T细胞包装扩增后,获得病毒颗粒,体外感染表达KDR的LOVO细胞株和不表达KDR的LS174T细胞株,以RT-PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药5-FC及GCV处理,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应.结果 重组体对各细胞株的感染率相似,RT-PCR方法检测发现:除LS174T细胞外,LOVO细胞有目的基因CDglyTK的表达.LOVO与LS174T细胞株对前药敏感性有显著性差异(P＜0.001),双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效(P＜0.001).结论 KDR启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR的大肠肿瘤细胞.     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对肺腺癌细胞杀伤作用探讨

目的：探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因转染联合抗病毒药物更昔洛韦（GCV）对人肺腺癌细胞系的杀伤作用。方法：应用基因工程技术构建了携带单纯疮疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因的逆转录病毒重组体pLXSN-tk，通过脂质体法转染PA317细胞，G418筛选出产重组病毒颗粒的生产细胞PA317-tk细胞。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测HSV-tk/GCV系统对人肺腺部细胞系GLC-82的生长抑制率。结果：重组逆转录病毒载体能有效地将HSV-tk基因导入GLC-82细胞系内并使其获得对GCV的敏感性。结论：肺腺癌细胞转染HSV-tk基因后，能有效地被GCV杀死。     

逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用

目的：探讨逆转录病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用。方法 应用PA317细胞包装的逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统,在体外以逆转录病毒上清感染法将TK基因导入MKN28人胃癌细胞,并初步观察更昔洛韦（GCV）对转染TK基因的MKN28胃癌细胞的杀伤作用。结果：TK基因可成功转导入MKN28细胞,且对细胞的生长状态无明显影响。但对GCV的敏感性却显增加;同时还观察到显的“旁观效应”。结论：逆转录病毒介导的HSV-TK系统对人胃癌细胞有较高的转染效率,GCV对转染阳性的胃癌细胞有显的杀伤作用。     

CEA慢病毒载体的制备及其在树突状细胞中的表达鉴定

目的 构建人癌胚抗原(CEA)慢病毒表达载体并包装成感染性病毒颗粒,获得稳定表达CEA的树突状细胞(DC).方法 以人CEA的测序质粒为模板,PCR扩增CEA全长,装入pLentiGFP转移质粒,经过测序证实其序列与标准序列完全一致.将pLentiGFP-CEA、包装质粒p△8.2和pVSV-G用LipofectamineTM2000共同转染293T细胞,包装成感染性病毒颗粒,感染树突状细胞,并进行RT-PCR和Western blot检验CEA在细胞中的表达.结果 DC细胞病毒感染48h后荧光显微镜观察CEA慢病毒载体在细胞中高效表达,PCR扩增可得到人CEA的2009 bp基因片段,与预期大小一致,Western blot显示CEA在感染DC中表达.结论 成功构建了CEA慢病毒表达载体,重组慢病毒感染DC细胞后表达出有活性的CEA蛋白,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.     

小鼠CD80和CD86基因RNA干扰慢病毒载体的构建及体外对树突状细胞的作用

 目的 构建小鼠CD80和CD86基因RNA干扰慢病毒表达载体,并在体外观察其对小鼠骨髓源性树突状细胞（dendritic cell,DC）的作用。方法 针对已经筛选确定的CD80基因RNA干扰有效靶序列,合成靶序列的双链DNA,接入pGCL-GFP载体,再与pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度;同法构建出CD86基因RNA干扰慢病毒载体。慢病毒感染体外培养的DC,通过荧光显微镜检测感染效率,Annexin V/PI双染色法检测感染细胞凋亡和坏死情况,流式细胞仪检测CD80和CD86的表达情况。结果 PCR和测序证实,pGCL-CD80shRNA和pGCL-CD86shRNA慢病毒载体构建正确,病毒滴度均达2×107TU/mL,适合感染DC的MOI值为20,此时慢病毒对DC具有低毒性,感染效率为85.42%。CD80和CD86表达的抑制率分别为82.05% 和77.78%。结论 成功构建出小鼠CD80和CD86基因RNA干扰慢病毒载体,其有明显抑制DC表面CD80和CD86的表达,这为移植物排斥提供了新的治疗手段。     

联合应用全反式维甲酸与单纯疱疹病毒腺苷激酶基因对髓母细胞瘤的协同杀伤作用研究

目的 评估全反式维甲酸(ATRA)联合单纯疱疹病毒腺苷激酶(HSV-tk)基因对髓母细胞瘤细胞系Daoy的杀伤作用.方法 观察不同浓度ATRA对Daoy细胞生长的抑制作用;HSV-tk基因稳定转染人的髓母细胞瘤细胞系Daoy,获得Daoy-tk细胞;Daoy-tk细胞与Daoy细胞按不同比例混合,给予不同浓度的更昔洛韦(GCV)和一定浓度的ATRA,7d后应用噻唑蓝(MTT)法测定细胞生存率.结果 ATRA在0.5～1 μmol/L时即可对Daoy细胞生长产生抑制作用;Daoy-tk与Daoy细胞比例达到1:4时仍有明显的抗肿瘤作用,联合应用1 μmol/L的ATRA后能显著提高HSV-tk基因对Daoy细胞的杀伤率.结论 ATRA与HSV-tk/GCV系统联合应用,能增强对人的髓母细胞瘤的杀伤作用.     

自杀基因TK腺相关病毒载体的构建及其抑制肿瘤细胞的功能研究

目的 探讨腺相关病毒(rAAV)-单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)(简称rAAV-TK)载体的构建及其生物学效应的初步鉴定.方法 用PCR扩增TK序列至pAAV-MCS载体,构建pAAV-TK;采用AAV-Helper Free System包装系统、"氯仿-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提"及冰乙醇沉淀法进行AAV的包装、纯化和浓缩,对病毒颗粒进行鉴定;用MB49-PSA细胞对rAAV-TK生物学效应进行初步鉴定.结果 成功构建pAAV-TK载体,并经酶切、PCR及测序验证其准确性;rAAV病毒颗粒滴度达2×1010v.p/mL,浓缩后可达到2 × 1011～2×1012v.p/mL;rAAV-TK可以分泌TK基因,加入药物更昔洛韦(Ganciclovir,GCV)和吉地他滨(Gemcitabine,GVC),该基因能有效诱导膀胱肿瘤细胞MB49-PSA凋亡.结论 成功构建rAAV-TK腺相关病毒,体外实验表明rAAV-TK/GVC/GCV系统能高效诱导膀胱肿瘤细胞的凋亡.     

放疗联合TK/GCV自杀基因系统对肺腺癌细胞凋亡活性的影响

目的研究放疗联合高效表达的胸苷激酶/丙氧鸟苷(TK/GCV)自杀基因系统对人肺腺癌细胞株A549细胞凋亡活性的影响,探寻肺腺癌放化疗联合治疗的新途径。方法利用前期研究成功构建的可调控自杀基因TK高效表达的pfos-iNOS/TK治疗载体转染A549细胞筛选阳性克隆。将阳性转染细胞(转染治疗载体组)和未转染的对照细胞(未转染组)分别给予2 Gy的X射线照射和10μmol/L、1000μmol/L的GCV。荧光显微镜观察细胞凋亡情况,检测各组细胞的凋亡率。结果给予10μmol/L、1000μmol/L的GCV作用后,治疗载体组凋亡率高于未转染(P<0.05);X射线照射联合GCV作用后,转染治疗载体组大量细胞发生凋亡,而未转染组仅有少量细胞发生凋亡(P<0.01)。结论放疗联合高效表达的TK/GCV自杀基因系统显著提高了对肺腺癌细胞的杀伤作用,为肺癌治疗带来了新的希望。     

CIK与树突细胞联合对肾癌细胞的杀伤研究

目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）和树突状细胞（Dc）共同培养后CIK细胞的增殖活性、表型变化及对肾癌细胞株769一P的杀伤作用。方法采集健康人的外周血单个核细胞（PBMC）,置37℃、5％C02培养箱2h,收集非粘附细胞诱导分化成CIK,粘附细胞诱导为DC,在培养7d后DC与CIK按1：40的比例混合培养,分别在3d、6d收集细胞同时以单纯CIK细胞为对照,运用LDH释放法检测对769一P细胞的杀伤活性。结果Dc—CIK共同培养后增殖速度明显快于单纯的CIK细胞,培养第10天时单纯CIK的CD3CD8、CD;cD未双阳性率分别为（50．4±1．8）％、（20．1±5．2）％,共培养3dDC—CIK的CD;CD8＋、CD36＋未的阳性率分别为（67．2±5．2）％、（37．9±4．1）％,6dDC-CIK的CD3＋CD8、CD3CD56的阳性率分别为（75．2±3．1）％、（48．3±2．9）％,表达差异具有统计学意义（P〈0．05）。在1：5—1：40靶效比范围内DC—CIK对肾癌细胞的杀伤活性高于单纯CIK细胞,且随效靶比增强杀伤活性增强（P〈0．05）。结论DC—CIK的增殖活性和细胞毒活性均高于单纯CIK细胞。     

树突状细胞的研究进展

树突状细胞参与机体的许多生理、病理过程,在免疫防御、免疫监视、免疫自稳等多方面发挥重要作用。因其具有独特的生物学性质,在肿瘤的形成和发展、感染的控制与播散、移植的排斥与耐受以及自身免疫性疾病发病等方面的作用日益受到重视,成为近年来研究的热点。现就其生物学特性及其在肿瘤、感染、移植及自身免疫病等方面的作用予以综述。     

抗原负载的树突细胞对细胞因子诱导的杀伤细胞的影响

目的：研究树突细胞(DC)负载不同形式的抗原对其成熟和功能的影响,及DC对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)增殖和功能的影响。方法：外周血单个核细胞(PBMC)经不同细胞因子作用后培养成DC和CIK细胞,将Bel 7402细胞制备成肿瘤细胞冻融物、坏死肿瘤细胞及正常生长的肿瘤细胞,并作为不同状态的肿瘤抗原刺激DC,以流式细胞仪检测DC表面分子的表达。应用MTT法检测肿瘤抗原负载的DC刺激的CIK对肿瘤细胞的杀伤力。结果：负载肿瘤细胞冻融物的Dc其表面cDla、CD80、CD83、HLA-DR高表达,促进CIK增殖和杀伤力的功能最强;与正常肿瘤细胞共培养的DC细胞成熟程度受到抑制;负载Bel 7402抗原的DC刺激的CIK对Bel 7402有较强杀伤力,而对HerpG2杀伤力弱。结论：肿瘤细胞冻融物预刺激的DC成熟程度最高,诱导抗原特异性CIK细胞的功能最强,为临床DC瘤苗和CIK的应用提供了实验依据。     

小鼠树突状细胞过继转移抗原作用的实验研究

用绵羊红细胞（SRBC）免疫小鼠,取其脾脏分离树突状细胞（dendriticcellsDCs）将这些带有抗原信息的DCs经尾静脉注射给小鼠．以观察DCs过继转移抗原的作用。结果表明,各试验组小鼠抗体形成细胞（AFC）及血清中SRBC处价明显高于对照组,P＜0．01,再次免疫DC组抗SRBC放价高于初次免疫DC组P＜0．05,提示：DCs具有过继转移抗原的作用。     

树突状细胞与肝癌的免疫治疗

树突状细胞(DC)是体内最强的抗原递呈细胞(APC),具有激活T细胞和诱导免疫反应的特殊功能。大量研究显示,DC在抗肿瘤的免疫反应、肿瘤监视等过程中均起到重要作用。DC免疫治疗应用于临床的问题已经引起广泛关注,并取得一定的进展。本文就DC的生物学特征、抗肝癌免疫治疗研究现状等方面作一综述。     

树突状细胞与免疫耐受的研究进展

近年来,随着对树突状细胞研究的不断深入,人们发现树突状细胞不仅是体内最强的抗原呈递细胞,激发免疫反应,而且又是调节免疫反应的重要因素之一,在维持免疫反应平衡及诱导免疫耐受中发挥重要作用。树突状细胞诱导免疫耐受的机制及其在临床中的应用,越来越受关注,成为免疫耐受领域的研究热点。     

抗原致敏DC联合LAK细胞对肺腺癌细胞杀伤作用的研究

目的：观察抗原致敏树突状细胞（DC）联合淋巴因子激活的杀伤（LAK）细胞对肺腺癌细胞的杀伤作用。方法：采用密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞（PBMC）,常规诱导出DC、LAK细胞。倒置显微镜观察细胞的形态和增殖情况;应用流式细胞仪（FCM）测定细胞表型上变化鉴定这两种细胞。流式细胞仪检测DC经抗原冲击和未经抗原冲击后其表型变化;利用四甲基偶氮唑蓝（MTT）检测法把DC-LAK细胞和DC-LAK-A549细胞作为效应细胞,肺腺癌A549细胞作为靶细胞,进行杀伤试验。结果：①体外诱导单个核细胞培养出DC和LAK细胞。②共培养后DC-LAK细胞的免疫表型表达增加。抗原致敏DC联合LAK细胞（DC-A549-LAK）组的免疫表型表达与对照组相比更有显著性意义。③共培养细胞在增殖倍率上有显著意义。④MTT显示共培养后的LAK细胞杀伤肿瘤细胞活性增强,抗原致敏后DC-A549-LAK抗肿瘤效应增强更显著。结论：从外周血单个核细胞中诱导出具有典型形态和免疫表型的DC和LAK细胞。DC和LAK细胞共培养细胞,增殖活性、免疫表型、杀伤活性方面高于单纯培养的LAK细胞。抗原致敏后DC-A549-LAK抗肿瘤效应增强更显著。     

树突状细胞与妊娠免疫耐受的研究进展

正常妊娠胚胎作为半同种移植物之所以能够维持取决于母胎界面免疫耐受的形成,树突状细胞(DCs)具有独特的免疫调节能力,既能诱导抗原特异性免疫反应又能诱导免疫抑制,通过调节妊娠期间母体内Th1/Th2平衡向Th2偏移,有利于受精卵着床和胎儿发育,维持正常妊娠。DCs不同的亚型及成熟度对妊娠免疫耐受的影响也不同。DCs还可与自然杀伤细胞及类固醇激素协同作用,共同维系妊娠免疫耐受状态。     

树突状细胞与细胞因子诱导杀伤细胞治疗肿瘤研究进展

树突状细胞（dendritic cells,DC）是已知的功能最强的专职抗原提呈细胞,在抗原加工提呈、抗原识别及T细胞激活中发挥重要作用。而细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokineiduced killercells,CIK）是由多种细胞因子诱导而成,对多种肿瘤细胞具有杀伤作用的细胞毒性T细胞。以DC为基础的肿瘤免疫治疗日益受到人们的重视。文章就近年DC与CIK免疫治疗肿瘤的研究进展作一综述。