靶向表皮生长因子受体shRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向表皮生长因子受体（EGFR）的短发卡状RNA（shRNA）质粒表达载体并进行鉴定。方法①根据人类EGFR的mRNA序列,设计4条干扰片段,以PGPU6/GFP/Neo质粒为载体,构建shRNA重组体,转化入DH5a大肠杆菌,提取质粒,进行酶切和测序鉴定;②采用脂质体Lipofectamin 2000分别转染人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞,用G418筛选阳性克隆。结果①经酶切及测序鉴定,成功构建了针对EGFR的4个重组干扰质粒;②成功转染Colo-16细胞,经筛选后得到稳定表达的细胞克隆。结论利用RNAi技术原理成功构建针对EGFR的shRNA重组质粒,并转染入Colo-16细胞。     

pSIREN-HIF-1α/shRNA表达载体的构建与鉴定

目的构建pSIREN-HIF-1α/shRNA重组质粒并测序鉴定,为下一步探索鼻咽癌基因治疗的RNA干扰（RNA interference,RNA）i途径奠定基础.方法根据基因库HIF-1αcDNA序列（NM₀01530/NM₁81054）以及Reynolds设计原则,设计并合成两端有酶切位点的60个碱基的寡核苷酸链,退火成互补双链后将退火产物与RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体链接后,热转化至大肠杆菌JM109菌株中,提取质粒进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,测序分析.结果 PCR扩增片段出现约470 bp大小的目的基因条带,与预期结果相符;凝胶电泳证实重组载体构建成功,插入片段测序结果与合成的寡核苷酸序列一致.结论成功构建重组质粒pSIREN-HIF-1α/shRNA,为下一步用脂质体包装并转染鼻咽癌细胞的研究奠定基础.     

靶向β-catenin的shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的:针对β-连环蛋白(β-catenin)基因的不同部位,构建靶向β-catenin的shRNA真核表达质粒,鉴定并筛选出最佳抑制效率的表达质粒.方法:针对β-catenin基因的不同部位设计3对短发卡RNA(shRNA)的寡核苷酸片段,克隆到真核表达载体pGPU6中,构建靶向β-catenin的shRNA真核表达质粒pGPU6-β-catenin-shRNA-1、2、3.利用脂质体转染人胃癌细胞株AGS,Western blot法检测并筛选最佳抑制效率的shRNA表达质粒.结果:3个靶向β-catenin的shRNA真核表达质粒pGPU6-β-catenin-shRNA-1、2、3经限制性酶切和测序确实基因插入正确,Western blot法证实pGPU6-B-catenin-shRNA-3明显降低细胞内β-catenin蛋白的表达.结论:成功构建了靶向β-catenin的shRNA真核表达质粒pGPU6-β-catenin-shRNA-1、2、3,并筛选出最佳抑制效率的表达质粒,为进一步研究Wnt/β-catenin信号通路在胃癌中的作用奠定了基础.     

pSIREN-HIF-1α/shRNA 表达载体的构建与鉴定

［摘要］目的　构建pSIREN-HIF-1α/shRNA重组质粒并测序鉴定,为下一步探索鼻咽癌基因治疗的RNA干扰（RNA interference,RNAi）途径奠定基础．方法　根据基因库HIF-1αcDNA序列（NM_001530/ NM_181054）以及Reynolds设计原则,设计并合成两端有酶切位点的60个碱基的寡核苷酸链,退火成互补双链后将退火产物与RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体链接后,热转化至大肠杆菌JM109菌株中,提取质粒进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,测序分析．结果　PCR扩增片段出现约470 bp大小的目的基因条带,与预期结果相符;凝胶电泳证实重组载体构建成功,插入片段测序结果与合成的寡核苷酸序列一致．结论　成功构建重组质粒pSIREN-HIF-1α/shRNA,为下一步用脂质体包装并转染鼻咽癌细胞的研究奠定基础．     

靶向MSTN基因shRNA表达载体的构建与鉴定

目的 旨在构建靶向MSTN基因的短发夹RNA (shRNA) 真核表达载体,并鉴定其在小鼠体内的抑制效果。方法根据MSTN基因的mRNA序列(NM_010834.3)设计siRNA,并挑选出3条可能具有良好干扰效果的siRNA,设计合成shRNA,构建pSIREN-MSTN-shRNA表达载体。通过肌内注射法将载体递送至小鼠体内,利用实时荧光定量PCR和Western blot法检测干扰后小鼠肌肉组织中MSTN的mRNA表达量和蛋白质表达水平。结果 测序鉴定表明pSIREN-MSTN-shRNA表达载体构建成功,3个重组质粒均能够明显降低肌肉组织中MSTN的mRNA和蛋白质水平,其中pSIREN-M819表达载体干扰效果最好,与对照组比较,MSTN的mRNA表达量降低了71%,蛋白水平也明显降低。结论 成功构建了pSIREN-MSTN-shRNA表达载体,并在小鼠体内能够有效抑制MSTN基因的表达。     

靶向整合于MHCC 97-H细胞的HBx基因shRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向整合于人肝癌MHCC97-H细胞乙型肝炎病毒x基因(HBxgene)基因的shRNA真核载体。方法依据从人肝癌细胞株MHCC97-H中克隆的HBx基因序列,设计合成X169、X220及MOCK(无关对照)3对寡核酸,经退火成互补双链并克隆至pGenesil-Ⅰ载体;经酶切、PCR和测序鉴定;将鉴定的shRNA质粒脂质体转染MHCC97-H细胞,流式细胞分析转染效率。结果酶切、PCR及测序证实pshRNA-X169/X220/MOCK质粒构建符合设计,转染48h后MHCC97-H细胞可激发绿色荧光,pshRNA-X220转染效率最低。结论成功构建靶向整合于人肝癌细胞HBVx基因特异性shRNA表达载体,并成功转染人肝癌细胞株MHCC97-H细胞,为沉默HBx基因实验性肝癌基因治疗奠定基础。     

靶向mdr1基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:设计并构建靶向mdr1基因shRNA真核表达质粒.方法:以mdr1为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pSilencerTM 3.1-H1 neo载体,构建重组的短发夹shRNA表达载体.采用酶切法和测序法鉴定.结果:经限制性内切酶酶切电泳后显示有66 bp模板寡核苷酸片段和4.3 kbp的线性化的pSilencerTM 3.1-H1 neo载体片段.重组子测序结果与Genebank中的mdr1基因cDNA序列相符.结论:重组靶向mdr1基因shRNA表达载体构建正确,为进一步转染耐药的肿瘤细胞逆转肿瘤耐药研究奠定了基础.     

携带靶向干扰VEGF基因shRNA重组腺相关病毒载体的构建和制备

目的：构建并制备携带靶向干扰VEGF165基因shRNA的重组腺相关病毒载体．方法：将PCR法扩增所得EGFP-U6-shRNA（VEGF165）片段插入载体质粒pSNAV2．0-lacz-α的EcoRI和SalI酶切位点,构建重组质粒pSNAV2．0-EGFP—U6-shRNA（VEGF165）．以HSV1-RapCap／△UL2为辅毒,包装rAAV2-EGFP-U6-shRNA（VEGF165）病毒．对所获病毒载体进行PCR,SDS-PAGE鉴定分析、滴度测定和EGFP的活性检测．结果：PCR,SDS-PAGE鉴定分析结果表明靶向干扰VEGF165基因的shRNA片段成功包装入重组AAV2载体,病毒纯度在98％以上．点杂交法测定重组病毒载体基因组滴度约为3×10^14v．g．（vector genomes）／L．EGFP活性检测显示重组AAV2感染细胞阳性率在30％以上．结论：成功制备了rAAV2-EGFP-U6-shRNA（VEGF165）病毒载体,为通过RNA干扰技术特异性抑制VEGF基因的表达来阐明VEGF在缺血性脑损伤后各种生物学事件中的作用奠定了实验基础．     

靶向DAL-1基因的shRNA表达载体的构建与鉴定

目的：建立DAL-1稳定抑制的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞实验模型．方法：构建靶向DAL-1的shRNA表达载体转染NSCLC细胞株，筛选出阳性克隆，在mRNA和蛋白质水平鉴定其抑制效率，最终得到DAL-1稳定抑制的细胞株．结果：通过双酶切鉴定和测序鉴定构建的shRNA表达载体序列正确，T4表达载体在mRNA和蛋白质水平能有效抑制DAL-1的表达，抑制率分别为（87．4±2．0）％和（82．7±2．1）％．结论：成功设计并构建了靶向DAL-1的shRNA表达载体，建立了DAL-1稳定抑制的NSCLC细胞株，为进一步研究DAL-1在NSCLC细胞中的作用提供了实验模型．     

靶向大鼠gnas基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定靶向大鼠gnas基因的小干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体.方法:根据大鼠gnas基因mRNA序列设计并合成3条shRNA特异性寡核苷酸片段,退火形成双链后克隆进入线性化pGenesil-1.1载体,并进行酶切鉴定和测序,同时构建针对大鼠GAPDH基因的阳性对照质粒和不具有基因同源性的非特异性基因的质粒做阴性对照.结果:经酶切和测序鉴定分析,构建的shRNA已成功插入载体,并且与设计序列完全相符.结论:成功构建了靶向大鼠gnas基因的shRNA真核表达载体,为后续研究Gs a 蛋白在心力衰竭中作用的体内外实验奠定了基础.     

人EGFP—TERT—VEGF-Bcl—xlshRNA重组腺病毒的构建与鉴定

目的构建表达绿色荧光蛋白（EGFP）和人端粒酶逆转录酶（TERT）、血管内皮生长因子（VEGF）、Bcl-xl基因shRNA的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定,观察其对喉癌细胞（Hep-2）的感染效果。方法用基因工程技术将EGFP和TERT、VEGF、Bcl—xl基因短发夹RNA（shRNA）的cDNA从质粒载体pGenesil-1．1上亚克隆至穿梭质粒pENTR-EGFP-VTB上,再通过体外同源重组的方法将EGFP-VEGF-TERT-Bcl-xlshRNA表达框转移至pGSadeno腺病毒表达载体上,得到腺病毒载体pGsadeno-EGFP_VTB,将PacI线性化的腺病毒DNA转染HEK293,并在其中包装扩增腺病毒。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中所携带EGFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对Hep-2细胞感染效率的检测。结果酶切鉴定及PCR结果证明EGFP-TERT—VEGF-Bcl—xlshRNA重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1．0×10^9PFU／ml,对Hep-2细胞有较强感染能力。结论应用体外同源重组方法成功构建了表达EGFP和TERT-VEGF-Bcl—xl基因shRNA的重组腺病毒载体。     

RNA干扰Twist基因真核表达载体的构建与筛选

目的： 构建编码Twist mRNA 的短发卡样RNA （shRNA ）质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA 质粒表达载体。方法： 以Twist mRNA 编码区中第777位和第845位序列作为RNA干扰靶点,分别构建2个shRNA 质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,构建后通过PCR 酶切电泳和质粒测序进行鉴定。经鉴定后分别转染稳定表达Twist基因的膀胱癌T24细胞,RT-PCR 和Western blotting 分别从mRNA 和蛋白质水平检测抑制效果。结果： 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出400 bp的目的条带,插入片段测序结果与合成的shRNA 结果一致。靶向Twist基因的shRNA 对膀胱癌T24细胞中Twist基因mRNA 抑制率为90%,蛋白质抑制率为86%,两种干扰质粒中shRNA1干扰效果最明显。结论： 成功构建了靶向Twist 基因的shRNA 质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA 质粒表达载体为pGenesil-shRNA1 质粒。     

趋化因子受体CCR7在胃癌组织中的表达及意义

目的探讨趋化因子受体CCR7在胃癌组织中的表达及其临床意义。方法采用RT—PCR及Western blot法检测32例胃癌及其癌旁对照组织中CCR7的表达。结果CCR7mRNA在胃癌组织中的表达水平为癌旁对照组的1．66倍（P〈0．01），且其表达水平与肿瘤TNM分期（P〈0．05）、浸润深度（P〈0．05）及淋巴结转移有关（P〈0．05）；Western blot结果显示CCR7蛋自在胃癌组织中的表达水平为癌旁对照组的2．3倍（P〈0．01），且高表达于肿瘤分期较晚（P〈0．05）、分化较差（P〈0．05）、浸润较深（P〈0．05）、有淋巴结转移（P〈0．05）和远处转移（P〈0．05）的组织。结论趋化因子受体CCR7可能与胃癌的发生、发展、侵袭、转移有关。     

GRP78基因短发夹RNA表达载体的构建和鉴定

目的构建葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因短发夹RNA表达载体并鉴定,为探讨GRP78对胃癌发生发展作用及机制提供前期基础。方法运用核糖核酸(RNA)干扰技术构建靶向干扰GRP78蛋白短发夹RNA(GRP78-shRNA)载体,载体经转化、抽提及测序,用脂质体将GRP78-shRNA载体瞬时转染至SGC-7901胃癌细胞中,应用荧光显微镜、反转录定量PCR(qRT-PCR)及免疫印迹(Western blot)观察GRP78表达情况。结果GRP78-shRNA载体测序显示序列正确;转染GRP78-shRNA载体的SGC-7901胃癌细胞可见绿色荧光;qRT-PCR和Western blot结果显示,转染GRP78-shRNA载体的SGC-7901胃癌细胞中GRP78基因和蛋白表达降低。结论成功构建并鉴定GRP78基因短发夹RNA表达载体。     

CCR7在非小细胞肺癌中的表达及其与淋巴结转移的关系

目的 检测CCR7在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中的表达,并分析其与肺癌临床病理参数间的关系,探讨CCR7在NSCLC淋巴结转移中的作用.方法 选用65例NSCLC临床切除组织石蜡标本,以免疫组化SP法检测CCR7蛋白的表达.结果 65例肺癌组织中,CCR7阳性表达37例,阳性率为56.9%(37/65),且其表达与淋巴结转移存在非常显著相关性(P<0.01).结论 CCR7在NSCLC组织中高表达,且其表达与NSCLC淋巴结转移密切相关.     

小鼠STAT4，STAT6基因shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建并鉴定小鼠信号转导子和转录激活因子4(STAT4),信号转导子和转录激活因子6(STAT6)具有发夹结构小干扰RNA(shRNA)表达质粒.方法:根据STAT4和STAT6基因mRNA序列,在体外分别合成有小发夹结构的2条STAT4特异性寡核苷酸序列,2条STAT6特异性寡核苷酸序列,退火后与线性化pGenesil-3质粒连接,转化感受态细胞DH5α,扩增,纯化得到所需质粒.同时设计构建分别针对小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的干扰质粒作为阳性对照,不具有基因同源性的非特异性基因的质粒作为阴性对照序列.通过酶切后琼脂糖凝胶电泳和基因测鉴定纯化质粒分子量及插入片段的序列.结果:经限制性酶切和测序鉴定分析证实基因插入正确,与设计的序列完全相符.结论:成功构建了针对小鼠STAT4,STAT6基因的发夹结构小干扰RNA表达载体.为今后利用基因沉默技术从转录后水平抑制STAT4,STAT6的研究奠定基础.     

CCR7基因转染对小鼠未成熟树突状细胞成熟及迁移功能的影响

熟转化,但IL-10可抑制成熟;流式结果表明转染后细胞表型符合典型imDCs的特征;Western blot证实CCR7重组腺病毒转染imDCs后可增强CCR7的表达;体外趋化实验显示转染后imDCs体外迁移百分比由4.2%增加到36.1%.结论 CCR7重组腺病毒转染imDCs后,其仍保留末成熟特性,CCR7蛋白表达增强,体外迁移能力明显增强.     

趋化因子受体CCR7在乳腺癌淋巴结转移中的作用

目的:探讨趋化因子受体CCR7在乳腺癌中的表达意义. 方法:应用RT-PCR及免疫组织化学方法检测42例乳腺癌组织和10例乳腺纤维腺瘤中CCR7的表达. 结果:在乳腺癌组织中CCR7 mRNA表达42.9%, CCR7蛋白表达35.7%,在乳腺纤维腺瘤中仅有1例CCR7 mRNA表达. 无淋巴结转移者CCR7蛋白阳性表达率为11.1%(2/18),而有淋巴结转移阳性表达率为54.2%(13/24)(P＜0.01);临床TNM分期Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ期的阳性表达率分别为0%,39.1%,60.0%(P＜0.01). 结论:CCR7可能是介导淋巴结转移和组织浸润的重要机制之一.