热休克蛋白70在视网膜神经元和Müller细胞中的诱导及其保护作用

目的评价大鼠视网膜神经元(RNs)和Müller细胞中热休克蛋白(HSP)70的诱导表达,及其对低糖和谷氨酸损伤的视网膜神经元的保护作用. 方法大鼠RNs和Müller细胞体外培养体系分别经过热休克处理(42℃下1 h)及免疫细胞化学法检测HSP70表达的时间经过;并对RNs进行低糖(0.56 mmol/L葡萄糖,作用6 h)和谷氨酸(100 μmol/L,作用 6 h)兴奋毒性损伤,四唑盐(MTT)比色法评价细胞存活能力,同时用HSP70抗体阻断其表达. 结果热休克后大鼠RNs和Müller细胞中HSP70高效表达;经热休克预处理,RNs在低糖和谷氨酸盐损伤后的细胞活力明显提高,该现象可被HSP70抗体阻断. 结论热休克能够诱导RNs和Müller细胞高效表达HSP70,从而增强RNs对低糖和谷氨酸兴奋毒性损伤的耐受能力.     

缺氧对视网膜Müller细胞促红细胞生成素mRNA和蛋白表达的影响

目的 探讨缺氧条件下促红细胞生成素（EPO）mRNA及蛋白在体外培养的Müller细胞的表达情况。 方法 胰酶消化新生大鼠视网膜组织制成单细胞悬液，机械震荡、吹打法分离纯化视网膜Müller细胞，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫细胞化学方法对缺氧条件下视网膜Müller细胞EPO基因和蛋白的表达进行测定。 结果 成功获得视网膜Müller细胞，传代后95%以上的细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色阳性。EPO蛋白的阳性染色位于视网膜Müller细胞的细胞浆及突起上。在正常的视网膜Müller细胞中仅见微弱的EPO mRNA和蛋白表达，而缺氧后表达明显上调，且呈时间依赖性。 结论 Müller细胞在缺氧条件下EPO mRNA和蛋白表达增强，EPO表达水平的升高可能是缺氧性视网膜病变的神经保护因素之一。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 196-199)     

脑源性神经营养因子对小鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运体表达的调控

谷氨酸是视网膜主要的兴奋性神经递质,然而在病理性浓度升高时,对视网膜神经节细胞(RGC)具有兴奋毒性作用[1].L-谷氨酸/L-天门冬氨酸转运体(GLAST)是表达在视网膜Müller细胞上最主要的谷氨酸转运体[5],在维持谷氨酸平衡和保护RGC免受谷氨酸兴奋毒性作用中发挥着重要作用[3].     

脑源性神经营养因子对小鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运体表达的调控

谷氨酸是视网膜主要的兴奋性神经递质,然而在病理性浓度升高时,对视网膜神经节细胞(RGC)具有兴奋毒性作用[1].L-谷氨酸/L-天门冬氨酸转运体(GLAST)是表达在视网膜Müller细胞上最主要的谷氨酸转运体[5],在维持谷氨酸平衡和保护RGC免受谷氨酸兴奋毒性作用中发挥着重要作用[3].     

转化生长因子α对鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运体调控作用的研究

目的 观察转化生长因子α（TGFα）对鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运体 (GLAST) mRNA、蛋白质表达及摄取活性的调控作用。方法 取出生后7～10 d 的新生昆明小鼠视网膜组织，体外进行Müller细胞的培养。同一原代细胞的第3～4代细胞培养后随机分为2组：①TGFα干预组：分别加入浓度为50、75、125、150 ng/ml的TGFα，每种浓度3孔；②对照组：仍用含20%胎牛血清的Dulbeccon改良Eagle培养基培养。采用L-3H-谷氨酸摄取分析方法观察不同浓度TGFα对Müller细胞GLAST摄取活性的影响；逆转录聚合酶链反应方法分析Müller细胞GLAST mRNA表达的差异；免疫组织化学染色方法检测Müller细胞GLAST蛋白质表达的变化。结果随着TGFα浓度的增加，L-3H-谷氨酸的摄取量及GLAST mRNA表达量均逐渐增加，TGFα浓度为125 ng/ml时，L-3H-谷氨酸的摄取量达到最大值，为对照组的266%，同时GLASTmRNA表达量也达到最大值，为对照组的近4倍。免疫组织化学染色显示当TGFα浓度为125 ng/ml时，干预组Müller细胞内的GLAST蛋白表达量明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 TGFα可通过上调GLAST mRNA和蛋白质的表达增加视网膜Müller细胞谷氨酸转运体GLAST的摄取活性。     

甲泼尼龙对大鼠视网膜激光损伤中Müller细胞胶质纤维酸性蛋白和增生细胞核抗原表达的影响

目的 研究甲泼尼龙对视网膜激光损伤后Müller细胞胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）和增生细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的影响。 方法 40只Sprague-Danley(SD)大鼠随机分为治疗组和对照组，治疗组大鼠在视网膜激光光凝损伤后连续3 d腹腔注射剂量为30 mg/kg的甲泼尼龙，对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水；分别于激光光凝术后3、7、14、28 d各处死5只动物，取出眼球，用AFA固定液进行组织固定后做石蜡包埋、切片，用免疫组织化学方法测定GFAP和PCNA的表达。 结果 激光光凝损伤后3d ，治疗组和对照组视网膜Müller细胞均表达PCNA，治疗组PCNA表达明显较对照组弱，3 d 后PCNA表达消失；激光光凝损伤后3 d ，治疗组和对照组视网膜Müller细胞均表达GFAP，在各时间点治疗组GFAP表达明显较对照组弱。 结论 甲泼尼龙可减轻Müller细胞激光损伤后PCNA和GFAP的表达，最终影响视网膜激光光凝损伤的瘢痕修复，这为研究视网膜激光损伤和防护的机制提供了实验证据。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 299-301)     

体外培养视网膜Müller细胞损伤后早期的反应性改变

目的：研究体外培养Müller细胞致伤后早期细胞发生的一系列损伤性变化和发生反应性胶质化的规律。方法：新生SD大鼠视网膜进行体外Müller细胞的培养并建立高压气体冲击损伤模型,检测细胞致伤后早期胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达变化,以及乳酸脱氢酶（LDH）的释放量和细胞凋亡率的变化。结果：致伤后3h左右GFAP的表达量明显增强,以后24h内持续性高表达,并与损伤强度呈正比(P<0.05);LDH的释放增加主要出现在损伤后30min内;损伤后30min各组致伤细胞凋亡率呈非显著性差异(P>0.05),3h后细胞凋亡率增高,6h后细胞凋亡率最高。结论：Müller细胞形态的改变和细胞膜通透性的改变可能是触发GFAP 表达增强的因素之一。     

糖尿病视网膜Müller细胞病理改变的体内外研究

目的研究糖尿病视网膜Müller细胞的病理改变.方法用链脲菌素(STZ)腹腔注射建立大鼠糖尿病模型,3个月后观察视网膜Müller细胞超微结构的变化.行免疫组织化学染色,在激光共聚焦显微镜下观察视网膜Müller细胞GFAP、VEGF表达的改变;纯化培养出生5～7d(SD)乳鼠的Müller细胞,在其中加入糖基化终末产物(AGEs)2500μg/mL,培养24h后,用MTT方法检测细胞活性.结果3个月后电镜观察发现糖尿病鼠视网膜Müller细胞突起有损伤表现,微血管内皮细胞、周细胞未见病理改变;正常鼠视网膜VEGF染色阴性,视网膜内界膜下、神经节细胞层有GFAP染色;糖尿病鼠除视网膜内界膜下、神经节细胞层有GFAP染色外,其余各层也可见丝条状贯穿于内外界膜之间的GFAP染色,在上述部位有VEGF及GFAP的共表达.培养24h后,2500μg/mL质量浓度的AGEs对Müller细胞活性有显著促进作用.结论反应性胶质化增生可能是糖尿病早期Müller细胞的主要病理改变,它所引起的Müller细胞结构和功能改变应在糖尿病视网膜病变(DR)的发生发展中起重要作用.AGEs可能是DR中视网膜Müller细胞反应性胶质化增生的重要致病因素.     

大鼠光损伤性内层视网膜变性的超微病理学研究

目的 研究光损伤后大鼠眼内层视网膜的神经原变性。 方法 用波长为480～520 nm，强度为900～1000 lx的绿光光照Lewis大白鼠24 h ，然后使其在黑暗中恢复，于光照后1、3、7、14 d处死动物并获得视网膜。以免疫组织化学方法分别标记视网膜内层细胞，用光镜和电镜观察。 结果 光损伤后可见大量光感受器细胞死亡。杆双极细胞在光照后第3天开始变性并逐渐减少数目；水平细胞在第1天即水肿变性但以后逐渐恢复；无长突细胞在第1天显示数目减少；神经节细胞在光照后始终呈水肿变性；Müller细胞于光照后在视网膜下增殖。超微结构研究显示视网膜内层神经元有固缩和水肿两种变性。 结论 视网膜内层 神经元和Müller细胞参与了光损伤性视网膜变性。不同的神经元表现不同类型的变性。（中华眼底病杂志，2003，19：201-268）     

腹腔渗出细胞辅助原代培养成年大鼠视网膜Müller细胞

目的 观察以腹腔渗出细胞为饲养细胞对原代培养的成年大鼠视网膜Müller细胞生长状态的影响。方法 制备大鼠腹腔渗出细胞,CD68免疫组织化学染色鉴定巨噬细胞,墨汁吞噬实验检测吞噬活性。酶消化法原代培养成年大鼠视网膜Müller细胞,神经胶质酸性蛋白（GFAP）和波形蛋白免疫组织化学染色鉴定。饲养细胞加入Müller细胞进行共培养后,流式细胞术分析Müller细胞的生长周期,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口翻译法（TUNEL）染色检测凋亡情况。结果 大鼠腹腔渗出细胞中巨噬细胞占95%以上,对墨汁颗粒有良好的吞噬能力。原代培养的Müller细胞贴壁生长,胞体较大、扁平,第3代细胞生长减慢。加入饲养细胞后,Müller细胞生长增生加快,S期和G2/M期细胞增多（S期, t=4.172, P<0.001;G2/M期, t=3.562, P<0.01）,第1代细胞生长时间由25~30 d缩短至18~22 d,第2代由10~15 d缩短至7~10 d;Müller细胞凋亡减少（t=3.804, P<0.01）。结论 以腹腔渗出细胞为饲养细胞能促进Müller细胞的生长增生,抑制其凋亡,加快Müller细胞的培养速度,是原代培养成年大鼠视网膜Müller细胞的一种有效方法。     

压力对体外培养大鼠视网膜Müller细胞的影响

目的　探讨压力作用下体外培养的大鼠Müller细胞形态、活性和谷氨酸代谢功能是否有改变,以明确Müller细胞在青光眼损伤过程中的作用。方法　将体外培养的大鼠Müller细胞随机分为对照组和加压处理组,加压组在50mmHg(1mmHg=0. 133kPa)压力下处理1h,然后两组细胞继续培养3d后,使用倒置显微镜和电镜观察细胞的形态,MTT比色法测定两组细胞的活性,RT PCR法检测两组细胞内谷氨酰胺合成酶mRNA表达,并用图像分析系统测定吸光度值。结果　体外培养的Müller细胞经压力处理后与对照组相比倒置显微镜下改变不明显,电镜下可见细胞内空泡增多,线粒体肿胀;MTT比色法显示细胞活性降低,差异有统计学意义(P<0 05); RT PCR法示细胞内谷氨酰胺合成酶mRNA表达减少,差异有统计学意义(P<0 .05)。结论　经压力处理后体外培养的Müller细胞有损伤的改变,细胞由于谷氨酸谷氨酰胺循环中的关键酶谷氨酰胺合成酶mRNA表达减少而代谢谷氨酸的能力下降,这可能是青光眼玻璃体中谷氨酸浓度升高的原因之一。     

阿柏西普对大鼠视网膜Müller细胞STAT3表达的影响

目的：探讨阿柏西普对大鼠视网膜Müller细胞信号转导及转录活化因子3(STAT3)表达的影响。

方法：采用不同浓度的阿柏西普 100μL(加药浓度分别为400、200、100pg/mL)大鼠永生化视网膜Müller细胞24、48h后,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Transwell小室法检测细胞侵袭,Western-blot法检测AKT、STAT3蛋白表达。

结果：随着阿柏西普浓度的升高,Müller细胞的增殖活性下降(P<0.05)。处理48h后,随着阿柏西普浓度的升高,Müller细胞的凋亡率逐渐上升,Müller细胞的侵袭穿透指数逐渐降低(P<0.05)。转染48h后,随着阿柏西普浓度的升高,Müller细胞的AKT蛋白相对表达量无显著变化(P>0.05),STAT3蛋白相对表达量逐渐降低(P<0.05)。

结论：阿柏西普可抑制大鼠视网膜Müller细胞STAT3蛋白表达,从而抑制细胞增殖与侵袭性,促进细胞凋亡。     

视网膜缺血再灌注损伤后HSP70、NF-κB的表达和细胞凋亡的关系

目的探讨大鼠视网膜缺血再灌注损伤后热休克蛋白70（HSP70）、核蛋白因子-κB（NF-κB）表达和损伤神经细胞凋亡的关系。方法前房加压法制作大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型，28只大鼠随机分为正常组和缺血再灌注组，后者又按照再灌注后不同时间段分为1、6、12、24、48、72h组。应用末端脱氧核酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记（TUNEL）法检测视网膜神经细胞凋亡指数（AI），过氧化物酶标记的链酶卵白素（SP）免疫组织化学法检测视网膜组织中HSP70、NF-κB的表达。结果视网膜神经细胞的凋亡出现于再灌注后6h，并逐渐递增，24h达到高峰．48h开始下降，72h不明显。HSP70在再灌注后1h即有表达，随时间段延长表达逐渐增加，至再灌注后24h达到高峰．之后渐下降。NF-κB的表达变化与凋亡细胞变化的规律基本一致。结论视网膜缺血再灌注损伤导致神经节细胞的凋亡：HSP70和NF-κB在视网膜缺血再灌注损伤中表达升高，对神经细胞的凋亡起着重要的调节作用。     

Müller细胞对视网膜血管内皮细胞紧密连接蛋白表达的影响

目的
探讨体外培养的Müller细胞在糖基化终末产物（AGEs）作用下增殖活性的变化，以及这种改变对牛视网膜血管内皮细胞（BREC）紧密连接蛋白（occludin）表达的影响。
方法
培养新生大鼠Müller细胞和BREC，两类细胞均用特异性抗体进行免疫鉴定。将培养的BREC分4组观察：第1组未添加任何细胞上清液；第2组添加正常Müller细胞上清液；第3组添加糖基化终末产物(AGEs)作用后的Müller细胞上清液；第
4组无细胞组，为空白对照组。酶联免疫吸附法（ELISA）测定4组细胞上清液中紧密连接蛋白的含量，比较其变化。
结果
添加正常Müller细胞上清液组紧密连接蛋白表达量最多，未添加任何细胞上清液组次之，添加AGEs作用后的Müller细胞上清液组更少。
结论
AGEs能促进Müller细胞异常增殖、抑制BREC表达紧密连接蛋白。
(中华眼底病杂志, 2006, 22: 28-30)     

体外培养兔视网膜Müller细胞葡萄糖转运载体蛋白1表达及其影响因素研究

目的观察高糖以及高浓度胰岛素等不同因素对体外培养兔视网膜Müller细胞葡萄糖转运载体蛋白1(GLUT1)表达的影响。方法利用组织块悬浮法原代培养兔视网膜Müller细胞，分为正常对照组、高糖组、胰岛素组、高糖加胰岛素组，通过激光共聚焦显微镜结合免疫细胞化学、荧光染色的方法，定位定量分析GLUT1的表达情况。结果高糖及高浓度胰岛素条件下视网膜Müller细胞GLUT1的表达均明显增强，并主要位于细胞浆靠近核膜周围。结论视网膜Müller细胞可表达GLUT1，高糖以及高浓度胰岛素均可使其表达增强。 （中华眼底病杂志，2008，24：265-267）     

Mlüler细胞与视网膜神经元的关系

Müller细胞是脊椎动物视网膜中最重要的胶质细胞,它贯穿视网膜全层,与视网膜三级神经元共同构成致密的“神经-胶质”网。近年来,随着对Müller细胞功能研究的深入,逐渐发现它在视网膜神经元的发育、营养、代谢中均发挥着重要作用。它诱导神经元在发育中的迁移、分化,参与神经元能量供应,并通过控制视网膜神经元的微环境和释放神经活性物质而主动调制神经元活动,此外,还以谷氨酸代谢和神经营养因子的分泌等形式保护神经元免受各种病理损害。     

兔视网膜Müller细胞的原代培养

目的 探索体外培养兔视网膜Müller细胞的有效方法.方法 采用酶消化法从乳兔视网膜获取Müller细胞,通过振荡和反复洗涤使之纯化.采用免疫组织化学技术和透射电镜对传代Müller细胞进行鉴定.结果 培养24 h后即有部分细胞贴壁生长,72 h后贴壁细胞进一步增多.通过振荡吹打可使附着于Müller细胞上的神经元脱落.20～25 d后细胞接近融合,呈三角形或不规则形.传代后细胞经1周达到融合.培养细胞GFAP阳性率在95%以上.电镜观察显示细胞内含有线粒体、粗面内质网、核糖体及8～10 nm的中间丝.结论 利用酶消化法可成功分离兔视网膜Müller细胞,通过振荡和吹打洗涤,可使之纯化.     

高糖对体外培养的视网膜Müller细胞膜离子通道的影响

目的 观察在高浓度葡萄糖条件下，体外培养的兔视网膜Müller细胞的钙依赖性钾(K_Ca)通道的变化。 方法 高浓度葡萄糖条件下体外培养兔视网膜Müller细胞，并用免疫组织化学染色及透射电镜鉴定培养的Müller细胞，采用膜片钳方法观察不同时间高糖条件下视网膜Müller细胞K_Ca通道的变化。 结果 高糖对体外培养的Müller细胞K_Ca通道有阻滞作用，其阻滞作用呈时间依赖性。 结论 高浓度葡萄糖可能通过阻滞K Ca通道而降低 Müller细胞的生物学功能。 （中华眼底病杂志，2003，19：164-167）     

巢蛋白和神经胶质纤维酸性蛋白在大鼠视网膜发育中的动态表达

目的 观察巢蛋白(nestin)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在大鼠视网膜发育中的动态变化.方法 48只Wistar大鼠,其中24只大鼠分为出生后1 d,1、2、3、4、7、12、20周8组,每组3只.制作眼球矢状位冰冻切片,采用共聚焦激光显微镜观察nestin和谷氨酰胺合成酶(GS)以及GFAP和GS免疫荧光染色情况.18只大鼠分为出生后id,1、2、3、4、12周,每组3只.提取大鼠视网膜总RNA,实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测nestin、GFAP和GS mRNA表达.选择6只出生后7～12 d新生鼠,取眼球体外培养Müller细胞,行GS和(或)nestin免疫荧光染色,共聚焦激光显微镜观察荧光染色情况.结果 出生后1 d,nestin免疫阳性细胞贯穿神经视网膜全层,主要定位于视网膜前体细胞放射状排列的细长纤维中,在视网膜内侧出现GFAP阳性的星形胶质细胞.出生后1周出现表达GS的Müller细胞,同时表达nestin,但不表达GFAP;GFAP阳性细胞仍然位于视网膜内侧.出生后2～12周,nestin在Mfiller细胞上的表达逐渐减少直至消失,GFAP在星形胶质细胞中的表达强度投有显著变化.体外培养的Müller细胞表达nestin,不表达GFAP.Nestin和GFAP mRNA在视网膜中的表达与免疫荧光染色结果相一致.结论 随大鼠视网膜不断发育,Müller细胞上nestin表达逐渐减少,成年大鼠视网膜Müller细胞不再表达nestin;新生鼠和成年鼠Müller细胞均不表达GFAP.     

巢蛋白和神经胶质纤维酸性蛋白在大鼠视网膜发育中的动态表达

目的 观察巢蛋白(nestin)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在大鼠视网膜发育中的动态变化.方法 48只Wistar大鼠,其中24只大鼠分为出生后1 d,1、2、3、4、7、12、20周8组,每组3只.制作眼球矢状位冰冻切片,采用共聚焦激光显微镜观察nestin和谷氨酰胺合成酶(GS)以及GFAP和GS免疫荧光染色情况.18只大鼠分为出生后id,1、2、3、4、12周,每组3只.提取大鼠视网膜总RNA,实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测nestin、GFAP和GS mRNA表达.选择6只出生后7～12 d新生鼠,取眼球体外培养Müller细胞,行GS和(或)nestin免疫荧光染色,共聚焦激光显微镜观察荧光染色情况.结果 出生后1 d,nestin免疫阳性细胞贯穿神经视网膜全层,主要定位于视网膜前体细胞放射状排列的细长纤维中,在视网膜内侧出现GFAP阳性的星形胶质细胞.出生后1周出现表达GS的Müller细胞,同时表达nestin,但不表达GFAP;GFAP阳性细胞仍然位于视网膜内侧.出生后2～12周,nestin在Mfiller细胞上的表达逐渐减少直至消失,GFAP在星形胶质细胞中的表达强度投有显著变化.体外培养的Müller细胞表达nestin,不表达GFAP.Nestin和GFAP mRNA在视网膜中的表达与免疫荧光染色结果相一致.结论 随大鼠视网膜不断发育,Müller细胞上nestin表达逐渐减少,成年大鼠视网膜Müller细胞不再表达nestin;新生鼠和成年鼠Müller细胞均不表达GFAP.